Name: construction of model lipid membranes incorporating g-protein coupled receptors (gpcrs)
Uploaded: 2022-02-05T14:00:00
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Ringraziamo Matthew Blosser per la preziosa discussione e i consigli. Questo lavoro è stato sostenuto dall'Office of Naval Research (N00014-16-1-2382) e dalla National Science Foundation (PHY-1915017).

1. Etichettatura delle proteine
<ol><li>Consentire a NHS-Rhodamine, ai frammenti di membrana 5-HT1A e a una colonna di dissalazione di spin 7 K MWCO di equilibrarsi a temperatura ambiente.</li>
	<li>Sciogliere 1 mg di NHS-rodamina in 100 μL di dimetilsolfossido (DMSO).</li>
	<li>Aggiungere 5 μL di soluzione di bicarbonato di sodio 1 M per aumentare il pH della soluzione 5-HT1AR a pH 8.</li>
	<li>Aggiungere 3,66 μL della soluzione NHS-rodamina a 50 μL della soluzione 5-HT1AR e pipett...

Abbiamo identificato due passaggi fondamentali per il successo del protocollo complessivo: il trattamento al plasma e la deposizione lipidica. La pulizia al plasma dei coverslip è essenziale per garantire che vi sia un'adeguata copertura e adesione dell'idrogel di agarosio al coperchio di vetro. La pulizia al plasma realizza due cose: in primo luogo, rimuove tracce di materia organica dalla superficie del vetro; in secondo luogo, attiva la superficie del coverslip, consentendo un aumento della bagnabilità all'aumentare...

Le membrane modello sintetiche sono potenti strumenti nello studio delle proprietà e delle funzioni fondamentali delle biomembrane. Le vescicole unilamellari giganti (GUV) sono una delle piattaforme più importanti per studiare una varietà di proprietà della membrana plasmatica e possono essere progettate per imitare diverse condizioni fisiologiche1,2,3,4,5,6,7,8. È ben noto che la membrana plasmatica e la sua organizzazione svolgono un ruolo chiave in una moltitudine di processi cellulari, come la trasduzione del segnale, l'adesione, l'endocitosi e il trasporto9,10,11,12,13,14,15.
I GUV sono stati fabbricati utilizzando vari metodi, tra cui idratazione delicata16, gonfiore dell'idrogel17, elettroformazione18, tecniche microfluidiche19,20,21,22, jetting23 e scambio di solventi24,25,26. A causa delle difficoltà nella gestione delle proteine integrali di membrana (PIM), le piattaforme in vitro per studiarle sono state limitate. I GUV presentano una piattaforma semplificata per lo studio degli IMP in un ambiente che imita il loro ambiente nativo. Sebbene ci siano stati diversi approcci per la ricostituzione proteica nei GUV, le sfide derivano dall'incorporazione di proteine con il corretto orientamento e dal mantenimento della funzionalità proteica27.
La ricostituzione proteica di maggior successo nei GUV richiede il metodo di scambio del detergente; che comporta la solubilizzazione delle proteine dal loro ambiente nativo mediante detergenti, seguita dalla purificazione delle proteine, e quindi la sostituzione delle molecole detergenti con lipidi attraverso vari metodi28. Mentre i detergenti servono a stabilizzare la struttura terziaria degli PIM durante la purificazione, le micelle detergenti sono un ambiente relativamente innaturale per queste proteine, che sono meglio stabilizzate, in particolare per gli studi funzionali, in doppiostrati lipidici28,29,30. Inoltre, incorporare proteine transmembrana funzionali nel doppio strato lipidico utilizzando le tradizionali tecniche di fabbricazione GUV è stato difficile a causa delle dimensioni, della delicatezza di queste proteine e delle fasi aggiuntive di scambio di detergenti che sarebbero necessarie27,31,32,33. L'uso di solventi organici per rimuovere i detergenti provoca aggregazione proteica e denaturazione34. Un metodo migliorato mediato dal detergente è stato promettente, tuttavia, è necessaria cautela per la fase di rimozione del detergente e potrebbe essere necessaria un'ottimizzazione per proteine specifiche31,35. Inoltre, i metodi che utilizzano l'elettroformazione potrebbero limitare la scelta delle proteine e potrebbero non essere adatti a tutte le composizioni lipidiche, in particolare i lipidi caricati31,36,37. Un'altra tecnica che è stata utilizzata è la fusione indotta da peptidi di grandi vescicole unilamellari (LUV) contenenti la proteina desiderata con GUV, sebbene sia risultata laboriosa e possa portare all'inserimento di molecole estranee- i peptidi fusogenici33,38,39. Le vescicole giganti della membrana plasmatica (GPMV), che derivano da cellule viventi, possono essere utilizzate per superare alcuni di questi problemi, tuttavia consentono un controllo minimo della composizione lipidica e proteica risultante14,40,41. Pertanto, l'integrazione di PIM nello strato bilipidico dei GUV utilizzando il nostro metodo di gonfiore dell'agarosio modificato presenta un metodo affidabile per esaminare ulteriormente queste proteine nell'ambiente di membrana42,43,44,45.
La segnalazione e la comunicazione cellulare coinvolgono una famiglia di proteine note come recettori accoppiati alla proteina G (GPCR); I GPCR fanno parte della più grande famiglia di proteine e sono associati alla modulazione dell'umore, dell'appetito, della pressione sanguigna, della funzione cardiovascolare, della respirazione e del sonno tra molte altre funzioni fisiologiche46. In questo studio, abbiamo utilizzato il recettore umano della serotonina 1A (5-HT1AR) che è un membro prototipico della famiglia GPCR. 5-HT1AR può essere trovato nel sistema nervoso centrale (SNC) e nei vasi sanguigni; influenza numerose funzioni come le funzioni cardiovascolari, gastrointestinali, endocrine, oltre a partecipare alla regolazione dell'umore47. Una grande barriera alla ricerca GPCR deriva dalla loro complessa struttura anfifila e i GUV presentano una piattaforma promettente per lo studio di varie proprietà di interesse, che vanno dalla funzionalità proteica, alle interazioni lipidico-proteina e alle interazioni proteina-proteina. Vari approcci sono stati utilizzati per studiare le interazioni lipidico-proteina come la risonanza plasmonica di superficie (SPR)48,49, la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR)50,51, il saggio di sovrapposizione lipidica proteica (PLO)51,52,53,54, la spettrometria di massa nativa55, la calorimetria di titolazione isotermica (ITC)56,57 e il liposoma saggio di sedimentazione58,59. Il nostro laboratorio ha utilizzato l'approccio GUV semplificato per studiare l'effetto delle interazioni lipidico-proteina sulla funzionalità proteica incapsulando BODIPY-GTPγS, che si lega con la subunità Giα nello stato attivo del recettore. Il loro legame incanta il fluoroforo producendo un segnale di fluorescenza che potrebbe essere rilevato nel tempo45. Inoltre, vari studi hanno studiato le interazioni lipidico-proteina e il ruolo delle proteine nel rilevare o stabilizzare la curvatura della membrana60,61, e l'utilizzo di un approccio GUV fattibile potrebbe essere un vantaggio chiave.
Questo protocollo dimostra un metodo semplice per incorporare i GPCR nella membrana dei GUV utilizzando un sistema di idrogel di agarosio modificato17,42. Inoltre, sulla base del nostro lavoro precedente, il nostro metodo potrebbe essere adatto per i PIM che possono sopportare un'esposizione a breve termine a 30-40 °C. In breve, abbiamo diffuso un sottile film di agarosio combinato con frammenti di membrana contenenti il GPCR di interesse. Dopo la gelificazione di questo strato, depositiamo una soluzione lipidica sopra l'agarosio e lasciamo evaporare il solvente. La reidratazione del sistema è stata quindi eseguita con un tampone acquoso, con conseguente formazione di GUV con proteine incorporate nel doppio strato lipidico.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td>
			<td>850375C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;TI-Eclipse inverted microscope</td>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td>
			<td>850355C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13/16&#8243; ID, 1&#8243; OD silicon O-rings</td>
			<td>Sterling Seal &#38; Supply, Neptune, IN</td>
			<td>5-003-8770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera</td>
			<td>Photometrics, Huntington Beach, CA</td>
			<td>&#160;Cascade II 512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td>
			<td>850457C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm</td>
			<td>Coherent, Santa Clara, CA</td>
			<td>488/561-50-LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-HT1AR membrane fragments</td>
			<td>Perkin Elmer, Waltham, MA</td>
			<td>RBHS1AM400UA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE)</td>
			<td>ATTO-TEC, Siegen, Germany</td>
			<td>AD 488-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench top plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma, Ithaca, NY</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform (CHCl3)</td>
			<td>Millipore Sigma, Burlington, MA</td>
			<td>CX1055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol (Chol)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>C8667-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Flat Clear Bottom</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic</td>
			<td>Elma, Singen, Germany</td>
			<td>[no longer sold on main website]</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol (MeOH)</td>
			<td>Millipore Sigma, Burlington, MA</td>
			<td>MX0485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-1000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-Rhodamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>46406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS)</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>21-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning-disc CSUX confocal head</td>
			<td>Yokogawa,Tokyo, Japan</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>standard 25 mm no. 1 glass coverslips</td>
			<td>ChemGlass, Vineland, NJ</td>
			<td>CLS-1760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sykes-Moore chambers</td>
			<td>Bellco, Vineland, NJ</td>
			<td>1943-11111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low melting temperature agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Analog Heatblock</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>[no longer sold on main website]</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Tube Rotator</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>10136-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>89882</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of model lipid membranes incorporating g-protein coupled receptors (gpcrs)

Robuste indagini in vitro sulla struttura e la funzione delle proteine di membrana integrali sono state una sfida a causa delle complessità della membrana plasmatica e dei numerosi fattori che influenzano il comportamento delle proteine nelle cellule vive. Le vescicole unilamellari giganti (GUV) sono un sistema modello in vitro biomimetico e altamente sintonizzabile per studiare le interazioni proteina-membrana e sondare il comportamento proteico in modo preciso e dipendente dallo stimolo. In questo protocollo, presentiamo un metodo economico ed efficace per fabbricare GUV con il recettore umano della serotonina 1A (5-HT1AR) stabilmente integrato nella membrana. Fabbrichiamo GUV utilizzando un metodo di rigonfiamento dell'idrogel modificato; depositando un film lipidico sopra una miscela di agarosio e 5-HT1AR e quindi idratando l'intero sistema, si possono formare vescicole con 5-HT1AR opportunamente orientato e funzionale incorporato nella membrana. Questi GUV possono quindi essere utilizzati per esaminare le interazioni proteina-membrana e il comportamento di localizzazione tramite microscopia. In definitiva, questo protocollo può far progredire la nostra comprensione della funzionalità delle proteine di membrana integrali, fornendo una profonda comprensione fisiologica.

La concentrazione di proteine è stata misurata e il grado di etichettatura è stato calcolato come il rapporto molare tra il colorante e la proteina per essere 1: 1. Esaminando i GUV utilizzando la microscopia confocale, siamo stati in grado di confermare la formazione e l'integrazione proteica delle vescicole. I lipidi sono stati etichettati con 0,4 mol% ATTO 488-DPPE e la proteina è stata etichettata covalentemente tramite la modifica dell'estere NHS della rodamina delle ammine primarie. La Figur...

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Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors GPCRs

Questo protocollo utilizza il gonfiore dell'agarosio come tecnica potente e generalizzabile per incorporare proteine di membrana integrali (PIM) in vescicole lipidiche unilamellari giganti (GUV), come descritto qui per la ricostituzione della proteina del recettore della serotonina 1A umana (5-HT1AR), una delle classi di recettori accoppiati a proteine G farmacologicamente importanti.

Costruzione di membrane lipidiche modello che incorporano recettori accoppiati alla proteina G (GPCR)

Robust in vitro investigations of the structure and function of integral membrane proteins has been a challenge due to the complexities of the plasma ...

Studiare le proteine di membrana integrali nel loro ambiente nativo è stata una sfida a causa della complessità della membrana plasmatica. Le vescicole lipidiche unilamellari giganti, o GUV, sono una delle piattaforme più importanti per studiare le proprietà della biomembrana e possono essere progettate per imitare varie condizioni fisiologiche. Questo protocollo descrive un metodo per fabbricare GUV incorporati in proteine basati sull'incorporazione spontanea, successiva al gonfiore dell'idrogel. I metodi tradizionali per fabbricare GUV non sono generalizzabili per l'incorporazione integrale di proteine di membrana. Questi metodi sono spesso a bassa resa, metodologicamente complessi e ad hoc, non applicabili ad ampie classi di proteine. D'altra parte, questo protocollo rappresenta un metodo flessibile, robusto e semplice per incorporare proteine di membrana integrali funzionali nei GUV.Abbiamo ottenuto questo obiettivo preparando un'impalcatura idrogel, contenente la proteina e depositando un sottile strato di lipidi sopra di esso. Nell'esempio qui presentato, abbiamo incorporato il recettore accoppiato alla proteina G, o GPCR, nei GUV.Dopo la reidratazione dell'intero sistema, i VUV germogliano dalla superficie dell'idrogel con la membrana contenente GPCR correttamente orientati.Consentire a tutti i reagenti di arrivare a temperatura ambiente. Durante questo periodo, pulire gli scivoli del coperchio mettendoli in metanolo e sonicando per 30 minuti a 40

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Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors (GPCRs)

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