Name: construction of model lipid membranes incorporating g-protein coupled receptors (gpcrs)
Uploaded: 2022-02-05T14:00:00
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私たちは、貴重な議論とアドバイスのためにマシュー・ブロッサーに感謝します。この研究は、海軍研究局(N00014-16-1-2382)と国立科学財団(PHY-1915017)によって支援されました。

1. タンパク質標識
<ol><li>NHS-ローダミン、5-HT1A 膜断片、および室温で平衡化する1つの7 K MWCOスピン脱塩カラムを可能にする。</li>
	<li>1mgのNHS-ローダミンをジメチルスルホキシド(DMSO)の100 μLに溶解します。</li>
	<li>5-HT1AR溶液のpHをpH 8に増加させるために1 M重炭酸ナトリウム溶液の5 μLを加えます。</li>
	<li>5-HT1AR溶液の50 μLに3.66 μLのNHS-ローダミン溶液を加え、ピペット...

我々は、全体的なプロトコルの成功に不可欠な2つのステップを同定しました:プラズマ処理と脂質堆積。カバーリップのプラズマ洗浄は、ガラスカバースリップにアガロースヒドロゲルの十分なカバレッジと接着性を確保するために不可欠です。プラズマ洗浄は、まず、ガラス表面から有機物の痕跡を取り除く、という2つのことを達成します。第二に、それはカバースリップ表面を活性化し?...

合成モデル膜は、生体膜の基本的な特性と機能の調査に強力なツールです。巨大な単層小胞(GUV)は、様々な形質膜特性を研究するための最も顕著なプラットフォームの1つであり、異なる生理学的条件を模倣するように設計することができます1、2、3、4、5、6、7、8。シグナル伝達、接着、エンドサイトーシス、輸送9,11,12,13,14,15など、細胞プロセスの多くにおいて、形質膜とその組織が重要な役割を果たしていることは十分に確立されています。
GUVは、穏やかな水和物16、ヒドロゲル膨潤17、電気形質18、マイクロ流体技術19、20、21、22、jetting23、および溶媒交換24、25、26を含む様々な方法を用いて製造されている。一体型膜タンパク質(IMP)の取り扱いにおける課題により、それらを研究するインビトロプラットフォームは限られています。GUVは、ネイティブ環境を模倣した環境でのIMPを研究するための簡略化されたプラットフォームを提供します。GUVではタンパク質再構成にはいくつかのアプローチがありましたが、正しい向きを持つタンパク質を組み込み、タンパク質の機能性を維持することで課題が生じます。
GUVで最も成功したタンパク質再構成には、洗剤交換法が必要です。これは、洗剤によって天然環境からタンパク質を可溶化し、続いてタンパク質精製を行い、その後、様々な方法で洗浄剤分子を脂質に置き換えることを含む28。洗浄剤は精製中にIPSの三次構造を安定させるのに役立ちますが、洗剤ミセルはこれらのタンパク質にとって比較的不自然な環境であり、特に脂質二重層における機能研究のために、より良い安定化を図ります。また、従来のGUV製造技術を用いて機能性膜貫通タンパク質を脂質二重層に組み込むことは、これらのタンパク質の大きさ、繊細さ、および必要となる追加の洗剤交換ステップ27,31,32,33のために困難であった。有機溶剤を使用して洗剤を除去すると、タンパク質の凝集と変性34が発生します。改善された洗剤媒介方法は有望であったが、洗剤除去ステップには注意が必要であり、特定のタンパク質31,35に対して最適化が必要となる可能性がある。さらに、電気的な形質を利用する方法はタンパク質の選択を制限し、特に帯電した脂質31,36,37のすべての脂質組成物に適していない可能性があります。もう一つの技術は、所望のタンパク質を含む大きなユニラメラ小胞(RV)とGUVのペプチド誘発融合であるが、骨の折れるものであり、外来分子の挿入につながる可能性があるが、フソジェニックペプチド33,38,39。生きた細胞に由来する巨大な原形質膜小胞(GPMV)は、これらの問題のいくつかを克服するために使用することができますが、結果として生じる脂質およびタンパク質組成の制御を最小限に抑えることができます14,40,41。従って、我々の修飾アガロース膨潤法を用いたGUVのバイリピッド層におけるIPSの統合は、膜環境におけるこれらのタンパク質をさらに調べる信頼性の高い方法を提示する42,43,44,45。
細胞シグナル伝達とコミュニケーションは、Gタンパク質共役受容体(GPCRs)として知られているタンパク質のファミリーを含みます。GPCRsはタンパク質の最大のファミリーの一つであり、気分、食欲、血圧、心血管機能、呼吸、および他の多くの生理学的機能の中で睡眠を調節することに関連しています46。本研究では、ヒトセロトニン1A受容体(5-HT1AR)を用いたGPCRファミリーの原型的なメンバーである。5-HT1AR は中枢神経系 (CNS) 血管で見つけることができます。;それは、心血管、胃腸、内分泌機能、ならびにmood47の調節に参加する多数の機能に影響を与える。GPCR研究の大きな障壁は、その複雑な両親媒性構造から生じ、GUVはタンパク質機能性、脂質タンパク質相互作用、タンパク質間相互作用に至るまで、関心のある様々な特性の調査のための有望なプラットフォームを提示します。表面プラズモン共鳴(SPR)48,49、核磁気共鳴分光法(NMR)50,51、タンパク質脂質オーバーレイ(PLO)アッセイ51,52,53,54、天然質量分析計55、等温滴定熱量測定(ITC)56,56,56,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,lipsome、及び567,576,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,576,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,5700,57,5700,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,5堆積アッセイ58,59.我々の研究室では、簡略化したGUVアプローチを用いて、受容体の活性状態でGiαサブユニットと結合するBODIPY-GTPγSをカプセル化することにより、脂質-タンパク質相互作用がタンパク質機能に及ぼす影響を調べています。彼らの結合は、時間45で検出され得る蛍光シグナルを産生する蛍光を解く。さらに、様々な研究が脂質タンパク質相互作用と、膜曲率60,61を感知または安定化するタンパク質の役割を調査し、実現可能なGUVアプローチを利用することが重要な利点となり得る。
このプロトコルは、修飾されたアガロースヒドロゲルシステム17,42を使用してGPVの膜にGPCRを組み込むための簡単な方法を示しています。さらに、当社の前の研究に基づいて、我々の方法は、30〜40°Cに短期的に曝すことができるIMPに適している可能性があります。 簡単に言うと、目的のGPCRを含む膜断片と組み合わせたアガロースの薄膜を広げる。この層のゲル化後、アガロースの上に脂質溶液を堆積させ、溶媒を蒸発させます。その後、システムの再水和を水溶液バッファーで行い、脂質二重層にタンパク質を取り込んだGUVの形成を行った。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td>
			<td>850375C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;TI-Eclipse inverted microscope</td>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td>
			<td>850355C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13/16&#8243; ID, 1&#8243; OD silicon O-rings</td>
			<td>Sterling Seal &#38; Supply, Neptune, IN</td>
			<td>5-003-8770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera</td>
			<td>Photometrics, Huntington Beach, CA</td>
			<td>&#160;Cascade II 512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td>
			<td>850457C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm</td>
			<td>Coherent, Santa Clara, CA</td>
			<td>488/561-50-LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-HT1AR membrane fragments</td>
			<td>Perkin Elmer, Waltham, MA</td>
			<td>RBHS1AM400UA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE)</td>
			<td>ATTO-TEC, Siegen, Germany</td>
			<td>AD 488-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench top plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma, Ithaca, NY</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform (CHCl3)</td>
			<td>Millipore Sigma, Burlington, MA</td>
			<td>CX1055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol (Chol)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>C8667-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Flat Clear Bottom</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic</td>
			<td>Elma, Singen, Germany</td>
			<td>[no longer sold on main website]</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol (MeOH)</td>
			<td>Millipore Sigma, Burlington, MA</td>
			<td>MX0485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-1000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-Rhodamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>46406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS)</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>21-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning-disc CSUX confocal head</td>
			<td>Yokogawa,Tokyo, Japan</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>standard 25 mm no. 1 glass coverslips</td>
			<td>ChemGlass, Vineland, NJ</td>
			<td>CLS-1760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sykes-Moore chambers</td>
			<td>Bellco, Vineland, NJ</td>
			<td>1943-11111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low melting temperature agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Analog Heatblock</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>[no longer sold on main website]</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Tube Rotator</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>10136-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>89882</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of model lipid membranes incorporating g-protein coupled receptors (gpcrs)

一体膜タンパク質の構造と機能の堅牢な インビトロ 調査は、原形質膜の複雑性と生細胞におけるタンパク質の挙動に影響を与える多くの要因による課題となっています。巨大なユニラメラ小胞(GUV)は、タンパク質膜相互作用を調査し、正確で刺激に依存する方法でタンパク質の挙動を探査するためのバイオミメティックで高度に調整可能な インビトロ モデルシステムです。本プロトコルでは、膜中に安定に統合されたヒトセロトニン1A受容体(5-HT1AR)を用いてGUVを製造するための安価で効果的な方法を提示する。我々は、修飾されたヒドロゲル膨潤法を用いてGUVを製造する。アガロースと5-HT1ARの混合物の上に脂質膜を堆積させ、その後、システム全体をハイドレートすることによって、小胞は膜に組み込まれた適切に配向し、機能的な5-HT1ARで形成することができる。これらのGUVは、顕微鏡を介してタンパク質膜相互作用と局在化行動を調べるために使用することができます。最終的に、このプロトコルは、深い生理学的洞察を提供し、一体膜タンパク質の機能性の理解を進めることができます。

タンパク質の濃度を測定し、標識の程度を、色素とタンパク質との間のモル比を1:1と計算した。共焦点顕微鏡を用いてGUVを調べることで、小胞の形成とタンパク質の統合が成功したことを確認することができました。脂質を0.4モル%ATTO 488-DPPEで標識し、タンパク質を一次アミンのローダミンNHSエステル修飾を介して共有結合標識した。 図2a および 図2b</st...

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Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors GPCRs

このプロトコルは、アガロース膨潤を、巨大な単層脂質小胞(GUV)に組み込むための強力かつ一般化可能な技術として利用し、ここで述べるように、ヒト1Aセロトニン受容体タンパク質(5-HT1AR)の再構成に関して、薬理学的に重要なGタンパク質結合型受容体の1つである。

Gタンパク質共役受容体(GPPC)を組み込んだモデル脂質膜の構築

Robust in vitro investigations of the structure and function of integral membrane proteins has been a challenge due to the complexities of the plasma ...

原形質膜の複雑さから、生体内のタンパク質を自在環境で研究することは課題となっています。巨大な単層脂質小胞、またはGUVは、生体膜特性を研究するための最も顕著なプラットフォームの1つであり、様々な生理学的条件を模倣するように設計することができます。このプロトコルは、ヒドロゲルの腫脹に続く自発的な組み込みに基づいて、タンパク質組み込まれたGUVを作製する方法を記述する。GUVを製造する従来の方法は、一体膜タンパク質の組み込みのために一般化することはできません。これらの方法は、多くの場合、低収率、方法論的に複雑でアドホックであり、広範なクラスのタンパク質には適用されません。一方、このプロトコルは、GUVに機能積分膜タンパク質を組み込むための柔軟で堅牢で簡単な方法を表しています。ここで紹介した例では、Gタンパク質共役受容体(GPCR)をGUVsに組み込みました。この間、カバースリップをメタノールに入れ、40分で30分間超音波処理して清掃します。

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