Name: construction of model lipid membranes incorporating g-protein coupled receptors (gpcrs)
Uploaded: 2022-02-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors GPCRs at JoVE.com

Vi takker Matthew Blosser for verdifull diskusjon og råd. Dette arbeidet ble støttet av Office of Naval Research (N00014-16-1-2382) og National Science Foundation (PHY-1915017).

1. Proteinmerking
<ol><li>Tillat NHS-Rhodamine, 5-HT1A membranfragmenter og en 7 K MWCO spin desalting kolonne å likevektere ved romtemperatur.</li>
	<li>Løs opp 1 mg NHS-rhodamin i 100 μL dimetylsulfoksid (DMSO).</li>
	<li>Tilsett 5 μL 1 M natriumbikarbonatoppløsning for å øke pH-en til 5-HT1AR-oppløsningen til pH 8.</li>
	<li>Tilsett 3,66 μL av NHS-rhodaminoppløsningen til 50 μL av 5-HT1AR-oppløsningen og pipetten forsiktig opp og ned i et mikrosenterrør. MERK: Sørg f...

Vi har identifisert to trinn som er avgjørende for suksessen til den overordnede protokollen: plasmabehandling og lipidavsetning. Plasmarengjøring av dekslene er avgjørende for å sikre at det er tilstrekkelig dekning og vedheft av agarose hydrogel til glasslipdekslene. Plasmarengjøring oppnår to ting: for det første fjerner det spor av organisk materiale fra glassoverflaten; For det andre aktiverer den dekslene, noe som gir en økning i fuktbarheten etter hvert som glassoverflatens hydrofilisitet <sup class="xref"...

Syntetiske modellmembraner er kraftige verktøy i undersøkelsen av biomembranes grunnleggende egenskaper og funksjoner. Giant unilamellar vesikler (GUVs) er en av de mest fremtredende plattformene for å studere en rekke plasmamembranegenskaper og kan konstrueres for å etterligne forskjellige fysiologiske forhold1,2,3,4,5,6,7,8. Det er godt fastslått at plasmamembranen og dens organisasjon spiller en nøkkelrolle i en rekke cellulære prosesser, for eksempel signaltransduksjon, vedheft, endokytose og transport9,10,11,12,13,14,15.
GUVer har blitt fremstilt ved hjelp av ulike metoder, inkludert skånsom hydrering16, hydrogel hevelse17, elektroformasjon18, mikrofluidiske teknikker19,20,21,22, jetting23 og løsningsmiddelutveksling24,25,26. På grunn av utfordringer med å håndtere integrerte membranproteiner (IMPer), har in vitro-plattformer for å studere dem vært begrenset. GUVer presenterer en forenklet plattform for å studere IMPer i et miljø som etterligner deres opprinnelige miljø. Selv om det har vært flere tilnærminger for proteinrekonstituering i GUVer, oppstår utfordringer ved å inkorporere proteiner med riktig orientering og opprettholde proteinfunksjonalitet27.
Mest vellykket proteinrekonstituering i GUVer krever vaskemiddelutvekslingsmetoden; som innebærer å løse proteinene fra sitt opprinnelige miljø av vaskemidler, etterfulgt av proteinrensing, og deretter erstatte vaskemiddelmolekylene med lipider gjennom ulike metoder28. Mens vaskemidler tjener til å stabilisere den tertiære strukturen til IMPer under rensing, er vaskemiddel micelles et relativt unaturlig miljø for disse proteinene, som er bedre stabilisert, spesielt for funksjonelle studier, i lipid bilayers28,29,30. Videre har det vært vanskelig å innlemme funksjonelle transmembranproteiner i lipidbilayeren ved hjelp av tradisjonelle GUV-fabrikasjonsteknikker på grunn av størrelsen, delikatessen til disse proteinene og de ekstra rengjøringsmiddelutvekslingstrinnene som trengs27,31,32,33. Bruk av organisk løsningsmiddel for å fjerne vaskemidler forårsaker proteinaggregering og denaturing34. En forbedret vaskemiddelmediert metode har vært lovende, men forsiktighet er nødvendig for rengjøringsmiddel fjerning trinn og optimalisering kan være nødvendig for spesifikke proteiner31,35. I tillegg kan metoder som bruker elektroformasjon begrense valg av protein og er kanskje ikke egnet for alle lipidsammensetninger spesielt ladede lipider31,36,37. En annen teknikk som har blitt brukt er peptidindusert fusjon av store unilamellar vesikler (LUVer) som inneholder ønsket protein med GUVs, selv om det ble funnet å være arbeidskrevende og kan føre til innsetting av fremmede molekyler - de fusogene peptidene33,38,39. Giant plasmamembran vesicles (GPMVs), som er avledet fra levende celler, kan brukes til å overvinne noen av disse problemene, men de tillater minimal kontroll av den resulterende lipid- og proteinsammensetningen14,40,41. Derfor presenterer integrasjonen av IMPer i bilipidlaget av GUVer ved hjelp av vår modifiserte agarose hevelsesmetode en pålitelig metode for å undersøke disse proteinene i membranmiljøet ytterligere42,43,44,45.
Cellulær signalering og kommunikasjon innebærer en familie av proteiner kjent som G protein-koblede reseptorer (GPCRs); GPCRs er blant de største familien av proteiner og er forbundet med modulerende humør, appetitt, blodtrykk, kardiovaskulær funksjon, åndedrett og søvn blant mange andre fysiologiske funksjoner46. I denne studien brukte vi human serotonin 1A reseptor (5-HT1AR) som er et prototypisk medlem av GPCR-familien. 5-HT1AR finnes i sentralnervesystemet (CNS) og blodårene; det påvirker mange funksjoner som kardiovaskulære, gastrointestinale, endokrine funksjoner, samt deltakelse i regulering av humør47. En stor barriere mot GPCR-forskning oppstår fra deres komplekse amfifile struktur, og GUVer presenterer en lovende plattform for undersøkelse av ulike egenskaper av interesse, alt fra proteinfunksjonalitet, lipidproteininteraksjoner og proteinproteininteraksjoner. Ulike tilnærminger har blitt brukt til å studere lipidproteininteraksjoner som overflateplasmonresonans (SPR)48,49, kjernemagnetisk resonansspektroskopi (NMR)50,51, protein lipidoverlegg (PLO) assay51,52,53,54, innfødt massespektrometri55, isotermisk titreringskalorimetri (ITC)56,57 og liposom sedimenteringsanalyse58,59. Laboratoriet vårt har brukt den forenklede GUV-tilnærmingen for å undersøke effekten av lipidproteininteraksjoner på proteinfunksjonalitet ved å inkapsulere BODIPY-GTPγS, som binder seg til Giα-underenheten i reseptorens aktive tilstand. Deres binding løsner fluoroforen som produserer et fluorescenssignal som kan oppdages over tid45. Videre undersøkte ulike studier Lipid-proteininteraksjoner og proteinenes rolle i å registrere eller stabilisere membrankurvatur60,61, og bruk av en mulig GUV-tilnærming kan være en viktig fordel.
Denne protokollen demonstrerer en enkel metode for å inkorporere GPCRs i membranen til GUVer ved hjelp av et modifisert agarose hydrogelsystem17,42. Videre, basert på vårt tidligere arbeid, kan vår metode være egnet for IMPer som kan bære kortsiktig eksponering for 30-40 °C. Kort sagt sprer vi en tynn film av agarose kombinert med membranfragmenter som inneholder GPCR av interesse. Etter gelering av dette laget legger vi en lipidløsning på toppen av agarose og lar løsningsmidlet fordampe. Rehydrering av systemet ble deretter utført med en vandig buffer, noe som resulterte i dannelse av GUVer med protein innlemmet i lipidbilayeren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td>
			<td>850375C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;TI-Eclipse inverted microscope</td>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td>
			<td>850355C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13/16&#8243; ID, 1&#8243; OD silicon O-rings</td>
			<td>Sterling Seal &#38; Supply, Neptune, IN</td>
			<td>5-003-8770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera</td>
			<td>Photometrics, Huntington Beach, CA</td>
			<td>&#160;Cascade II 512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td>
			<td>850457C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm</td>
			<td>Coherent, Santa Clara, CA</td>
			<td>488/561-50-LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-HT1AR membrane fragments</td>
			<td>Perkin Elmer, Waltham, MA</td>
			<td>RBHS1AM400UA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE)</td>
			<td>ATTO-TEC, Siegen, Germany</td>
			<td>AD 488-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench top plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma, Ithaca, NY</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform (CHCl3)</td>
			<td>Millipore Sigma, Burlington, MA</td>
			<td>CX1055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol (Chol)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>C8667-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Flat Clear Bottom</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic</td>
			<td>Elma, Singen, Germany</td>
			<td>[no longer sold on main website]</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol (MeOH)</td>
			<td>Millipore Sigma, Burlington, MA</td>
			<td>MX0485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-1000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-Rhodamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>46406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS)</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>21-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning-disc CSUX confocal head</td>
			<td>Yokogawa,Tokyo, Japan</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>standard 25 mm no. 1 glass coverslips</td>
			<td>ChemGlass, Vineland, NJ</td>
			<td>CLS-1760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sykes-Moore chambers</td>
			<td>Bellco, Vineland, NJ</td>
			<td>1943-11111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low melting temperature agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Analog Heatblock</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>[no longer sold on main website]</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Tube Rotator</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>10136-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>89882</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of model lipid membranes incorporating g-protein coupled receptors (gpcrs)

Robuste in vitro-undersøkelser av strukturen og funksjonen til integrerte membranproteiner har vært en utfordring på grunn av kompleksiteten i plasmamembranen og de mange faktorene som påvirker proteinadferd i levende celler. Giant unilamellar vesikler (GUVs) er et biomimetisk og svært justerbart in vitro-modellsystem for å undersøke proteinmembraninteraksjoner og undersøke proteinadferd på en presis, stimulusavhengig måte. I denne protokollen presenterer vi en billig og effektiv metode for å fremstille GUVer med den menneskelige serotonin 1A-reseptoren (5-HT1AR) stabilt integrert i membranen. Vi fremstiller GUVs ved hjelp av en modifisert hydrogel hevelse metode; ved å deponere en lipidfilm på toppen av en blanding av agarose og 5-HT1AR og deretter hydrere hele systemet, kan vesikler dannes med riktig orientert og funksjonell 5-HT1AR innlemmet i membranen. Disse GUVene kan deretter brukes til å undersøke proteinmembraninteraksjoner og lokaliseringsatferd via mikroskopi. Til syvende og sist kan denne protokollen fremme vår forståelse av funksjonaliteten til integrerte membranproteiner, noe som gir dyp fysiologisk innsikt.

Konsentrasjonen av protein ble målt, og graden av merking ble beregnet som molarforholdet mellom fargestoffet og proteinet til å være 1: 1. Ved å undersøke GUVene ved hjelp av konfektmikroskopi, kunne vi bekrefte vellykket dannelse og proteinintegrasjon av vesiklene. Lipidene ble merket med 0,4 mol% ATTO 488-DPPE, og proteinet ble kovalent merket via rhodamin NHS-ester modifikasjon av primære aminer. Figur 2a og figur 2b viser en proteininkorporert vesicle...

Watch this Scientific Journal Video about Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors GPCRs at JoVE.com

Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors GPCRs

Denne protokollen benytter agarose hevelse som en kraftig og generaliserbar teknikk for å inkorporere integrerte membranproteiner (IMPs) i gigantiske unilamellar lipid vesicles (GUVs), som beskrevet her for rekonstituering av humant 1A serotoninreseptorprotein (5-HT1AR), en av klassene av farmakologisk viktige G protein-koblede reseptorer.

Konstruksjon av modell lipidmembraner som inkorporerer G-proteinkoblede reseptorer (GPCRs)

Robust in vitro investigations of the structure and function of integral membrane proteins has been a challenge due to the complexities of the plasma ...

Å studere integrerte membranproteiner i sitt opprinnelige miljø har vært en utfordring på grunn av kompleksiteten i plasmamembranen. Giant unilamellar lipid vesikler, eller GUVs, er en av de mest fremtredende plattformene for å studere biomembrane egenskaper, og de kan konstrueres for å etterligne ulike fysiologiske forhold. Denne protokollen beskriver en metode for å fremstille proteininkorporerte GUVer basert på spontan inkorporering, etter hydrogel hevelse. Tradisjonelle metoder for å fremstille GUVs er ikke generaliserbare for integrert membranproteininkorporering. Disse metodene er ofte lav avkastning, metodisk komplekse og ad hoc, ikke anvendelige for brede klasser av proteiner. På den annen side representerer denne protokollen en fleksibel, robust og enkel metode for å innlemme funksjonelle integrerte membranproteiner i GUVs.We oppnådde dette ved å forberede et hydrogel stillas, som inneholder proteinet, og deponere et tynt lag lipid på toppen av det. I eksemplet som presenteres her, innlemmet vi G protein-koblet reseptor, eller GPCR, i GUVs.Upon rehydrering av hele systemet, GUVs knopper av overflaten av hydrogelen med membranen som inneholder riktig orientert GPCRs.Tillat alle reagenser å komme til romtemperatur. I løpet av denne tiden rengjør dekselet ved å plassere dem i metanol og sonikere i 30 minutter ved 40

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Bioengineering

Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors (GPCRs)

Unit 1

Membrane Structure and Components

SCIENTISTS IN ACTION

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

Helical Organisering av koagulasjonsfaktor VIII på Lipid Nanorør

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

Bruk av Merkfritt Optiske biosensorer til Detect Modulation av kaliumkanaler av G-protein koblede reseptorer

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Lipidbllag Vesikkel Generation Bruke Microfluidic Spyling

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

Bygging og karakterisering av en Novel Vocal Fold bioreaktor

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

Preparation of Light-responsive Membranes by a Combined Surface Grafting and Postmodification Process

Utarbeidelse av Light-responsive Membraner av en kombinert Surface Negl og Postmodification Process

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Biomembranen Fabrication av Løsemiddel assistert lipidbilag (SalB) Metode

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Bygging av Modular Hydrogel blad for Micropatterned Macro-skalert 3D Cellular Arkitektur

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Magnetic Levitation Coupled with Portable Imaging and Analysis for Disease Diagnostics

Magnetisk Levitation Sammen med Portable Imaging and Analysis for sykdomsdiagnostikk

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Syntese av hydrogeler med Bunn Egenskaper som membraner for vannrensing

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

Construction and Setup of a Bench-scale Algal Photosynthetic Bioreactor with Temperature, Light, and pH Monitoring for Kinetic Growth Tests

Konstruksjon og oppsett av en Bench-skala alg fotosyntetisk bioreaktor med temperatur, lys og pH-overvåkning for kinetiske vekstprøver

The optimal design and operation of photosynthetic bioreactors (PBRs) for microalgal cultivation is essential for improving the environmental and economic ...