Name: construction of model lipid membranes incorporating g-protein coupled receptors (gpcrs)
Uploaded: 2022-02-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors GPCRs at JoVE.com

Agradecemos a Matthew Blosser por valiosa discussão e conselhos. Este trabalho foi apoiado pelo Escritório de Pesquisa Naval (N00014-16-1-2382) e pela Fundação Nacional de Ciência (PHY-1915017).

1. Rotulagem de proteínas
<ol><li>Permita que os fragmentos de membrana NHS-Rhodamine, 5-HT1A e uma coluna de dessecação de spin de 7 K MWCO se equilibrem à temperatura ambiente.</li>
	<li>Dissolver 1 mg de NHS-rhodamina em 100 μL de sulfóxido de dimetila (DMSO).</li>
	<li>Adicione 5 μL de solução de bicarbonato de sódio de 1 M para aumentar o pH da solução 5-HT1AR ao pH 8.</li>
	<li>Adicione 3,66 μL da solução NHS-rhodamine a 50 μL da solução 5-HT1AR e pipeta suavemen...

Identificamos duas etapas que são fundamentais para o sucesso do protocolo geral: tratamento plasmás e deposição lipídica. A limpeza plasmática das tampas é essencial para garantir que haja cobertura adequada e adesão do hidrogel agarose ao deslizamento de tampas de vidro. A limpeza plasmática realiza duas coisas: primeiro, remove vestígios de matéria orgânica da superfície do vidro; segundo, ativa a superfície do deslizamento de tampas, permitindo um aumento na capacidade de verícula à medida que a hidro...

As membranas de modelo sintético são ferramentas poderosas na investigação das propriedades e funções fundamentais dos biomembranos. Vesículas unilamellar gigantes (GUVs) são uma das plataformas mais proeminentes para estudar uma variedade de propriedades de membrana plasmática e podem ser projetadas para imitar diferentes condições fisiológicas1,2,3,4,5,6,7,8. Está bem estabelecido que a membrana plasmática e sua organização desempenham um papel fundamental em uma infinidade de processos celulares, como transdução de sinal, adesão, endocitose e transporte9,10,11,12,13,14,15.
Os GUVs foram fabricados utilizando vários métodos, incluindo hidratação suave16, inchaço de hidrogel17, eletroformação18, técnicas microfluídicas19,20,21,22, jetting23 e troca de solventes24,25,26. Devido aos desafios no manuseio de proteínas de membrana integral (IMPs), as plataformas in vitro para estudá-las têm sido limitadas. Os GUVs apresentam uma plataforma simplificada para estudar IMPs em um ambiente que imita seu ambiente nativo. Embora tenha havido várias abordagens para a reconstituição de proteínas nos GUVs, os desafios surgem da incorporação de proteínas com a orientação correta e manutenção da funcionalidade proteica27.
A reconstituição de proteínas mais bem sucedida em GUVs requer o método de troca de detergentes; que envolve solubilizar as proteínas de seu ambiente nativo por detergentes, seguido pela purificação de proteínas, e, em seguida, substituir as moléculas de detergente por lipídios através de vários métodos28. Enquanto os detergentes servem para estabilizar a estrutura terciária dos IMPs durante a purificação, as micelas detergentes são um ambiente relativamente antinatural para essas proteínas, que são melhor estabilizadas, particularmente para estudos funcionais, em bicamadas lipídicas28,29,30. Além disso, a incorporação de proteínas transmembranas funcionais na bicamada lipídica utilizando técnicas tradicionais de fabricação de GUV tem sido difícil devido ao tamanho, à delicadeza dessas proteínas e às etapas adicionais de troca de detergente que seriam necessárias27,31,32,33. O uso de solvente orgânico para remover detergentes causa agregação de proteínas e desnaturação34. Um método melhorado mediado por detergente tem sido promissor, no entanto, é necessário cautela para a etapa de remoção do detergente e a otimização pode ser necessária para proteínas específicas31,35. Além disso, métodos que utilizam a eletroformação podem restringir a escolha da proteína e podem não ser adequados para todas as composições lipídicas especialmente lipídios carregados31,36,37. Outra técnica que tem sido utilizada é a fusão induzida por peptídeos de grandes vesículas unilamellar (LUVs) contendo a proteína desejada com GUVs, embora tenha sido considerada trabalhosa e pode levar à inserção de moléculas estranhas - os peptídeos fusogênicos33,38,39. As vesículas gigantes da membrana plasmática (GPMVs), derivadas de células vivas, podem ser usadas para superar algumas dessas questões, porém permitem o controle mínimo da composição lipídica e proteica resultante14,40,41. Portanto, a integração dos IMPs na camada bilipid de GUVs utilizando nosso método de inchaço agarose modificado apresenta um método confiável para examinar ainda mais essas proteínas no ambiente da membrana42,43,44,45.
A sinalização e comunicação celular envolve uma família de proteínas conhecidas como receptores acoplados à proteína G (GPCRs); Os GPCRs estão entre a maior família de proteínas e estão associados à modulação do humor, apetite, pressão arterial, função cardiovascular, respiração e sono entre muitas outras funções fisiológicas46. Neste estudo, utilizamos o receptor humano de serotonina 1A (5-HT1AR), que é um membro prototípico da família GPCR. 5-HT1AR pode ser encontrado no sistema nervoso central (SNC) e vasos sanguíneos; influencia inúmeras funções como funções cardiovasculares, gastrointestinais, endócrinas, além de participar da regulação do humor47. Uma grande barreira à pesquisa de GPCR surge de sua complexa estrutura anfílica, e os GUVs apresentam uma plataforma promissora para a investigação de várias propriedades de interesse, que vão desde a funcionalidade proteica, interações lipídica-proteínas e interações proteína-proteína. Várias abordagens têm sido utilizadas para estudar interações lipídica-proteína, como ressonância de plasmon superficial (SPR)48,49, espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR)50,51, sobreposição lipídica proteica (OLP) ensaio51,52,53,54, espectrometria de massa nativa555, calorimetria de titulação isotemal (ITC)56,57, e lipososom ensaio de sedimentação58,59. Nosso laboratório tem usado a abordagem simplificada do GUV para investigar o efeito das interações lipídica-proteína na funcionalidade proteica, incapsulando BODIPY-GTPγS, que se liga à subunidade Giα no estado ativo do receptor. Sua ligação insocra o fluoróforo produz um sinal de fluorescência que poderia ser detectado ao longo do tempo45. Além disso, vários estudos investigaram as interações lipídica-proteínas e o papel das proteínas na detecção ou estabilização da curvatura da membrana60,61, e utilizar uma abordagem Uctávia viável do GUV pode ser uma vantagem fundamental.
Este protocolo demonstra um método simples para incorporar GPCRs na membrana de GUVs usando um sistema de hidrogel agarose modificado17,42. Além disso, com base em nosso trabalho anterior, nosso método pode ser adequado para IMPs que podem suportar exposição a curto prazo a 30-40 °C. Resumidamente, espalhamos um filme fino de agarose combinado com fragmentos de membrana contendo o GPCR de interesse. Após a gelação desta camada, depositamos uma solução lipídica em cima da agarose e permitimos que o solvente evapore. A reidratação do sistema foi então realizada com um tampão aquoso, resultando na formação de GUVs com proteína incorporada na bicamada lipídica.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td>
			<td>850375C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;TI-Eclipse inverted microscope</td>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td>
			<td>850355C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13/16&#8243; ID, 1&#8243; OD silicon O-rings</td>
			<td>Sterling Seal &#38; Supply, Neptune, IN</td>
			<td>5-003-8770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera</td>
			<td>Photometrics, Huntington Beach, CA</td>
			<td>&#160;Cascade II 512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td>
			<td>850457C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm</td>
			<td>Coherent, Santa Clara, CA</td>
			<td>488/561-50-LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-HT1AR membrane fragments</td>
			<td>Perkin Elmer, Waltham, MA</td>
			<td>RBHS1AM400UA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE)</td>
			<td>ATTO-TEC, Siegen, Germany</td>
			<td>AD 488-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench top plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma, Ithaca, NY</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform (CHCl3)</td>
			<td>Millipore Sigma, Burlington, MA</td>
			<td>CX1055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol (Chol)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>C8667-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Flat Clear Bottom</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic</td>
			<td>Elma, Singen, Germany</td>
			<td>[no longer sold on main website]</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol (MeOH)</td>
			<td>Millipore Sigma, Burlington, MA</td>
			<td>MX0485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-1000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-Rhodamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>46406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS)</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>21-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning-disc CSUX confocal head</td>
			<td>Yokogawa,Tokyo, Japan</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>standard 25 mm no. 1 glass coverslips</td>
			<td>ChemGlass, Vineland, NJ</td>
			<td>CLS-1760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sykes-Moore chambers</td>
			<td>Bellco, Vineland, NJ</td>
			<td>1943-11111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low melting temperature agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Analog Heatblock</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>[no longer sold on main website]</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Tube Rotator</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>10136-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>89882</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of model lipid membranes incorporating g-protein coupled receptors (gpcrs)

Investigações in vitro robustas da estrutura e função das proteínas da membrana integral tem sido um desafio devido às complexidades da membrana plasmática e aos inúmeros fatores que influenciam o comportamento proteico nas células vivas. Vesículas unilamellar gigantes (GUVs) são um sistema de modelo biomimético e altamente incapaz de in vitro para investigar interações proteína-membrana e sondar o comportamento proteico de forma precisa e dependente de estímulos. Neste protocolo, apresentamos um método barato e eficaz para a fabricação de GUVs com o receptor humano de serotonina 1A (5-HT1AR) firmemente integrado na membrana. Fabricamos GUVs usando um método modificado de inchaço de hidrogel; depositando uma película lipídica em cima de uma mistura de agarose e 5-HT1AR e, em seguida, hidratando todo o sistema, as vesículas podem ser formadas com 5-HT1AR devidamente orientados e funcionais incorporados na membrana. Esses GUVs podem então ser usados para examinar interações proteína-membrana e comportamento de localização via microscopia. Em última análise, este protocolo pode avançar nossa compreensão da funcionalidade das proteínas da membrana integral, fornecendo uma visão fisiológica profunda.

A concentração de proteína foi medida, e o grau de rotulagem foi calculado como a razão molar entre o corante e a proteína a ser de 1:1. Examinando os GUVs utilizando microscopia confocal, pudemos confirmar a formação bem sucedida e a integração proteica das vesículas. Os lipídios foram rotulados com 0,4 mol% ATTO 488-DPPE, e a proteína foi rotulada covalentemente através da modificação de rhodamina NHS-éster de aminas primárias. A Figura 2a e a Figura 2...

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Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors GPCRs

Este protocolo utiliza o inchaço de agarose como uma técnica poderosa e generalizável para incorporar proteínas de membrana integral (IMPs) em vesículas lipídicas unilamellar gigantes (GUVs), como descrito aqui para a reconstituição da proteína humana receptora de serotonina 1A (5-HT1AR), uma das classes de receptores farmacofarologicamente importantes acoplados à proteína G.

Construção de membranas lipídicas modelo incorporando receptores acoplados de proteína G (GPCRs)

Robust in vitro investigations of the structure and function of integral membrane proteins has been a challenge due to the complexities of the plasma ...

Estudar proteínas de membrana integral em seu ambiente nativo tem sido um desafio devido à complexidade da membrana plasmática. Vesículas lipídicas unilamellar gigantes, ou GUVs, são uma das plataformas mais proeminentes para estudar propriedades biomédicas e podem ser projetadas para imitar várias condições fisiológicas. Este protocolo descreve um método para fabricar GUVs incorporados de proteínas com base na incorporação espontânea, posteriormente ao inchaço do hidrogel. Os métodos tradicionais para fabricar GUVs não são generalizáveis para a incorporação integral da proteína da membrana. Esses métodos são muitas vezes de baixo rendimento, metodologicamente complexos e ad hoc, não aplicáveis a classes amplas de proteínas. Por outro lado, este protocolo representa um método flexível, robusto e simples para incorporar proteínas de membrana integral funcional em GUVs.Realizamos isso preparando um andaime de hidrogel, contendo a proteína, e depositando uma fina camada de lipídio em cima dele. No exemplo aqui apresentado, incorporamos o receptor acoplado à proteína G, ou GPCR, nos GUVs.Após a reidratação de todo o sistema, os GUVs bud fora da superfície do hidrogel com a membrana contendo GPCRs devidamente orientados.Permitir que todos os reagentes cheguem à temperatura ambiente. Durante este tempo, limpe os deslizamentos de cobertura colocando-os em metanol e sonicando por 30 minutos em 40

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