Name: construction of model lipid membranes incorporating g-protein coupled receptors (gpcrs)
Uploaded: 2022-02-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors GPCRs at JoVE.com

Vi tackar Matthew Blosser för värdefull diskussion och råd. Detta arbete stöddes av Office of Naval Research (N00014-16-1-2382) och National Science Foundation (PHY-1915017).

1. Proteinmärkning
<ol><li>Låt NHS-Rhodamine, 5-HT1A membranfragment och en 7 K MWCO spin desaltning kolonn att balansera vid rumstemperatur.</li>
	<li>Lös upp 1 mg NHS-rhodamin i 100 μL dimetylsulfoxid (DMSO).</li>
	<li>Tillsätt 5 μL 1 M natriumbikarbonatlösning för att öka pH-värdet på 5-HT1AR-lösningen till pH 8.</li>
	<li>Tillsätt 3,66 μL av NHS-rhodaminlösningen till 50 μL av 5-HT1AR-lösningen och pipetten försiktigt upp och ner i ett mikrocentrifugerör. OBS: ...

Vi har identifierat två steg som är avgörande för framgången för det övergripande protokollet: plasmabehandling och lipiddeposition. Plasmarengöring av täcksliparna är avgörande för att säkerställa att det finns tillräcklig täckning och vidhäftning av agaroshydrogelen till glastäcket. Plasmarengöring åstadkommer två saker: för det första tar det bort spår av organiskt material från glasytan; För det andra aktiverar den täckytan, vilket möjliggör en ökning av vätbarheten eftersom glasytans h...

Syntetiska modellmembran är kraftfulla verktyg i undersökningen av de grundläggande egenskaperna och funktionerna hos biomembraner. Giant unilamellar vesiklar (GUVs) är en av de mest framstående plattformarna för att studera en mängd olika plasmamembranegenskaper och kan konstrueras för att efterlikna olika fysiologiska förhållanden1,2,3,4,5,6,7,8. Det är välkänt att plasmamembranet och dess organisation spelar en nyckelroll i en mängd cellulära processer, såsom signaltransduktion, vidhäftning, endocytos och transport9,10,11,12,13,14,15.
GUVs har tillverkats med olika metoder, inklusive mild hydrering16, hydrogelsvullnad17, elektroformation18, mikrofluidiska tekniker19,20,21,22, jetting23 och lösningsmedelsutbyte24,25,26. På grund av utmaningar med att hantera integrerade membranproteiner (IMPs) har in vitro-plattformar för att studera dem begränsats. GUVs presenterar en förenklad plattform för att studera IMP: er i en miljö som efterliknar deras ursprungliga miljö. Även om det har funnits flera metoder för proteinrekonstitution i GUVs, uppstår utmaningar från att införliva proteiner med rätt orientering och upprätthålla protein funktionalitet27.
Den mest framgångsrika proteinrekonstitutionen i GUV kräver tvättmedelsutbytesmetoden. vilket innebär att proteinerna från deras ursprungliga miljö solubiliseras med tvättmedel, följt av proteinrening, och sedan ersätta tvättmedelsmolekylerna med lipider genom olika metoder28. Medan tvättmedel tjänar till att stabilisera den tertiära strukturen hos IMPs under rening, är tvättmedel micelles en relativt onaturlig miljö för dessa proteiner, som är bättre stabiliserade, särskilt för funktionella studier, i lipidbilayers28,29,30. Dessutom har det varit svårt att införliva funktionella transmembranproteiner i lipidbilayer med traditionella GUV-tillverkningstekniker på grund av dessa proteiners storlek, delikatess och de ytterligare åtgärder för utbyte av tvättmedel som skulle behövas27,31,32,33. Användningen av organiskt lösningsmedel för att avlägsna tvättmedel orsakar proteinaggregering och denaturering34. En förbättrad tvättmedelsmedierad metod har varit lovande, men försiktighet behövs för tvättmedelsborttagningssteget och optimering kan behövas för specifika proteiner31,35. Dessutom kan metoder som använder elektroformation begränsa valet av protein och kanske inte är lämpliga för alla lipidkompositioner speciellt laddade lipider31,36,37. En annan teknik som har använts är peptidinducerad fusion av stora unilamellerblåsor (LUVs) som innehåller önskat protein med GUVs, även om det befanns vara mödosamt och kan leda till införande av främmande molekyler-de fusogenic peptiderna33,38,39. Gigantiska plasmamembranblåsor (GPMVs), som härrör från levande celler, kan användas för att övervinna några av dessa problem, men de tillåter minimal kontroll av den resulterande lipid- och proteinsammansättningen14,40,41. Därför utgör integrationen av IMP i bilipidskiktet av GUVs med hjälp av vår modifierade agarose svullnad metod en tillförlitlig metod för att ytterligare undersöka dessa proteiner i membran miljön42,43,44,45.
Cellulär signalering och kommunikation involverar en familj av proteiner som kallas G-proteinkopplade receptorer (GPCR); GPCR är bland den största familjen av proteiner och är associerade med modulering humör, aptit, blodtryck, kardiovaskulär funktion, andning, och sömn bland många andra fysiologiska funktioner46. I denna studie använde vi human serotonin 1A-receptor (5-HT1AR) som är en prototypisk medlem av GPCR-familjen. 5-HT1AR finns i centrala nervsystemet (CNS) och blodkärlen; det påverkar många funktioner som kardiovaskulära, gastrointestinala, endokrina funktioner, samt deltar i regleringen av humör47. Ett stort hinder för GPCR-forskning uppstår från deras komplexa amfifila struktur, och GUVs presenterar en lovande plattform för undersökning av olika egenskaper av intresse, allt från proteinfunktionalitet, lipid-proteininteraktioner och protein-proteininteraktioner. Olika metoder har använts för att studera lipid-proteininteraktioner såsom ytplasmonresonans (SPR)48,49, nukleär magnetisk resonansspektroskopi (NMR)50,51, proteinfettöverlägg (PLO) analys51,52,53,54, infödd masspektrometri55, isoterm titreringskaorimetri (ITC)56,57 och liposom sedimenteringsanalys58,59. Vårt labb har använt den förenklade GUV-metoden för att undersöka effekten av lipid-proteininteraktioner på proteinfunktionalitet genom att inkapsla BODIPY-GTPγS, som binder till Giα-underenheten i receptorns aktiva tillstånd. Deras bindning släcker fluoroforen som producerar en fluorescenssignal som kan detekteras över tid45. Dessutom undersökte olika studier lipid-proteininteraktioner och proteiners roll för att känna av eller stabilisera membrankrökning60,61, och att använda en genomförbar GUV-metod kan vara en viktig fördel.
Detta protokoll visar en enkel metod för att införliva GPCRs i membranet av GUVs med hjälp av ett modifierat agarose hydrogel system17,42. Dessutom, baserat på vårt tidigare arbete, kan vår metod vara lämplig för IMP som kan bära kortvarig exponering för 30-40 °C. Kortfattat sprider vi en tunn film av agaros i kombination med membranfragment som innehåller GPCR av intresse. Efter gelering av detta lager deponerar vi en lipidlösning ovanpå agaroset och låter lösningsmedlet avdunsta. Rehydrering av systemet utfördes sedan med en vattenbuffert, vilket resulterade i bildandet av GUVs med protein som ingår i lipidbilayer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td>
			<td>850375C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;TI-Eclipse inverted microscope</td>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td>
			<td>850355C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13/16&#8243; ID, 1&#8243; OD silicon O-rings</td>
			<td>Sterling Seal &#38; Supply, Neptune, IN</td>
			<td>5-003-8770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera</td>
			<td>Photometrics, Huntington Beach, CA</td>
			<td>&#160;Cascade II 512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td>
			<td>850457C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm</td>
			<td>Coherent, Santa Clara, CA</td>
			<td>488/561-50-LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-HT1AR membrane fragments</td>
			<td>Perkin Elmer, Waltham, MA</td>
			<td>RBHS1AM400UA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE)</td>
			<td>ATTO-TEC, Siegen, Germany</td>
			<td>AD 488-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench top plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma, Ithaca, NY</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform (CHCl3)</td>
			<td>Millipore Sigma, Burlington, MA</td>
			<td>CX1055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol (Chol)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>C8667-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Flat Clear Bottom</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic</td>
			<td>Elma, Singen, Germany</td>
			<td>[no longer sold on main website]</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol (MeOH)</td>
			<td>Millipore Sigma, Burlington, MA</td>
			<td>MX0485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-1000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-Rhodamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>46406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS)</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>21-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning-disc CSUX confocal head</td>
			<td>Yokogawa,Tokyo, Japan</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>standard 25 mm no. 1 glass coverslips</td>
			<td>ChemGlass, Vineland, NJ</td>
			<td>CLS-1760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sykes-Moore chambers</td>
			<td>Bellco, Vineland, NJ</td>
			<td>1943-11111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low melting temperature agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Analog Heatblock</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>[no longer sold on main website]</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Tube Rotator</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>10136-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>89882</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of model lipid membranes incorporating g-protein coupled receptors (gpcrs)

Robusta in vitro-undersökningar av strukturen och funktionen hos integrerade membranproteiner har varit en utmaning på grund av plasmamembranets komplexitet och de många faktorer som påverkar proteinbeteendet i levande celler. Giant unilamellar vesiklar (GUVs) är ett biomimetiskt och mycket tunable in vitro-modellsystem för att undersöka protein-membraninteraktioner och undersöka proteinbeteende på ett exakt, stimulansberoende sätt. I detta protokoll presenterar vi en billig och effektiv metod för att tillverka GUVs med den mänskliga serotonin 1A-receptorn (5-HT1AR) stabilt integrerad i membranet. Vi tillverkar GUVs med en modifierad hydrogel svullnad metod; Genom att deponera en lipidfilm ovanpå en blandning av agaros och 5-HT1AR och sedan hydrera hela systemet, kan blåsor bildas med korrekt orienterad och funktionell 5-HT1AR införlivad i membranet. Dessa GUVs kan sedan användas för att undersöka protein-membran interaktioner och lokalisering beteende via mikroskopi. I slutändan kan detta protokoll öka vår förståelse av funktionaliteten hos integrerade membranproteiner, vilket ger djupgående fysiologisk insikt.

Koncentrationen av protein mättes, och graden av märkning beräknades som molarförhållandet mellan färgämnet och proteinet till 1:1. Genom att undersöka GUVs med hjälp av konfokal mikroskopi, kunde vi bekräfta framgångsrik bildandet och protein integration av blåsor. Lipiderna var märkt med 0,4 mol% ATTO 488-DPPE, och proteinet var kovalent märkt via rhodamin NHS-ester modifiering av primära aminer. Figur 2a och figur 2b visar en proteininkorporera...

Watch this Scientific Journal Video about Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors GPCRs at JoVE.com

Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors GPCRs

Detta protokoll använder agarose svullnad som en kraftfull och generaliserbar teknik för att införliva integrerade membranproteiner (IMPs) i jätte unilameller lipid vesicles (GUVs), som beskrivs här för rekonstitution av mänskliga 1A serotonin receptor protein (5-HT1AR), en av klasserna av farmakologiskt viktiga G protein-kopplade receptorer.

Konstruktion av modell lipidmembran som innehåller G-protein kopplade receptorer (GPCR)

Robust in vitro investigations of the structure and function of integral membrane proteins has been a challenge due to the complexities of the plasma ...

Att studera integrerade membranproteiner i deras ursprungliga miljö har varit en utmaning på grund av plasmamembranets komplexitet. Giant unilamellar lipid vesiklar, eller GUVs, är en av de mest framstående plattformarna för att studera biomembran egenskaper och de kan konstrueras för att efterlikna olika fysiologiska förhållanden. Detta protokoll beskriver en metod för att tillverka protein införlivade GUVs baserat på spontana införlivande, efter hydrogel svullnad. Traditionella metoder för att tillverka GUV är inte generaliserbara för integrerad membranproteininkorporering. Dessa metoder är ofta lågavkastande, metodologiskt komplexa och ad hoc, inte tillämpliga på breda klasser av proteiner. Å andra sidan representerar detta protokoll en flexibel, robust och enkel metod för att införliva funktionella integrerade membranproteiner i GUVs.We uppnådde detta genom att förbereda en hydrogelställning, som innehåller proteinet och deponera ett tunt lager lipid ovanpå det. I exemplet som presenteras här införlivade vi G proteinkopplad receptor, eller GPCR, i GUVs.Vid rehydrering av hela systemet, GUVs knoppar av ytan av hydrogelen med membranet innehåller korrekt orienterade GPCRs.Allow alla reagenser att komma till rumstemperatur. Rengör under denna tid täcksedlen genom att placera dem i metanol och soniska i 30 minuter vid 40

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Bioengineering

Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors (GPCRs)

Unit 1

Membrane Structure and Components

SCIENTISTS IN ACTION

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

Helical Organisation av koagulationsfaktor VIII på Lipid Nanorör

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

Användning av Label fria optiska biosensorer för att upptäcka Modulering av kaliumkanaler av G-proteinkopplade receptorer

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Lipiddubbelskiktet Blås Generation Använda Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

Konstruktion och karakterisering av en roman Vocal Fold Bioreaktor

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

Preparation of Light-responsive Membranes by a Combined Surface Grafting and Postmodification Process

Beredning av Light-responsiva Membran av en Kombinerad Surface Ympning och Postmodification Process

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Biomembran Fabrication av lösningsmedel assisterad lipiddubbelskiktet (SALB) Metod

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Konstruktion av Modular hydrogel Skivor för Micropatterned Makro skalas 3D Cellular Architecture

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Magnetic Levitation Coupled with Portable Imaging and Analysis for Disease Diagnostics

Magnetisk levitation Tillsammans med Portable Imaging och analys for Disease Diagnostics

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Syntes av Hydrogeler med Antifouling egenskaper som Membran för vattenrening

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

Construction and Setup of a Bench-scale Algal Photosynthetic Bioreactor with Temperature, Light, and pH Monitoring for Kinetic Growth Tests

Konstruktion och uppställning av en Bench-skala alga fotosyntetisk bioreaktor med temperatur, ljus och pH-övervakning för kinetiska tillväxttest

The optimal design and operation of photosynthetic bioreactors (PBRs) for microalgal cultivation is essential for improving the environmental and economic ...