Name: construction of model lipid membranes incorporating g-protein coupled receptors (gpcrs)
Uploaded: 2022-02-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors GPCRs at JoVE.com

Matthew Blosser'a değerli tartışmalar ve tavsiyeler için teşekkür ederiz. Bu çalışma Deniz Araştırmaları Ofisi (N00014-16-1-2382) ve Ulusal Bilim Vakfı (PHY-1915017) tarafından desteklendi.

1. Protein etiketleme
<ol><li>NHS-Rhodamine, 5-HT1A membran parçaları ve bir adet 7 K MWCO spin tuzdan arındırma kolonunun oda sıcaklığında dengede olmasını sağlar.</li>
	<li>100 μL dimetil sülfit (DMSO) içinde 1 mg NHS-rhodamin çözün.</li>
	<li>pH 8'e 5-HT1AR çözeltisinin pH'ını artırmak için 5 μL 1 M sodyum bikarbonat çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>5-HT1AR çözeltisinin 50 μL'sine 3,66 μL NHS-rhodamin çözeltisi ekleyin ve pipet bir mikrosantrifüj tüpünd...

Genel protokolün başarısı için kritik olan iki adım belirledik: plazma tedavisi ve lipid birikimi. Kapak kapaklarının plazma temizliği, agarose hidrojelinin cam kapak kapağına yeterli kapsama alanı ve yapıştırılmasının sağlanmasında esastır. Plazma temizliği iki şeyi gerçekleştirir: birincisi, cam yüzeyinden organik madde izlerini temizler; ikinci olarak, kapak yüzeyini aktive eder, cam yüzey hidrofilizliği arttıkça ıslanabilirlikte bir artış sağlar62,63</su...

Sentetik model membranlar, biyomembranların temel özelliklerinin ve işlevlerinin araştırılmasında güçlü araçlardır. Dev unilamellar veziküller (GUV'ler) çeşitli plazma membran özelliklerini incelemek için en belirgin platformlardan biridir ve farklı fizyolojik durumları taklit etmek için tasarlanmış olabilir1,2,3,4,5,6,7,8. Plazma membranının ve organizasyonunun sinyal transdüksiyonu, yapışıklık, endositoz ve transport9,10,11,12,13,14,15 gibi çok sayıda hücresel işlemde kilit rol oynadığı iyi belirlenmiştir.
GUV'lar nazik hidrasyon16, hidrojel şişme17, elektroformasyon18, mikroakışkan teknikler19,20,21,22, jetting23 ve solvent değişimi24,25,26 dahil olmak üzere çeşitli yöntemler kullanılarak üretilmiştir. İntegral membran proteinlerinin (IMP) işlenmesindeki zorluklar nedeniyle, bunları incelemek için in vitro platformlar sınırlı olmuştur. GUV'ler, IMP'leri yerel ortamlarını taklit eden bir ortamda incelemek için basitleştirilmiş bir platform sunar. GUV'lerde protein rekonsesi için çeşitli yaklaşımlar olmasına rağmen, proteinlerin doğru oryantasyonla birleştirilmesi ve protein işlevselliğinin korunmasından kaynaklanan zorluklar ortaya çıkmaktadır27.
GUV'larda en başarılı protein rekonsesi deterjan değişim yöntemini gerektirir; proteinlerin deterjanlarla kendi çevrelerinden çözünür hale getirilmesini, ardından protein saflaştırılmasını ve daha sonra deterjan moleküllerinin çeşitli yöntemlerle lipitlerle değiştirilmesini içerir28. Deterjanlar saflaştırma sırasında IMP'lerin üçüncül yapısını stabilize etmeye hizmet ederken, deterjan miselleri lipid bilayers28,29,30'da özellikle fonksiyonel çalışmalar için daha iyi stabilize edilen bu proteinler için nispeten doğal olmayan bir ortamdır. Ayrıca, geleneksel GUV imalat teknikleri kullanılarak fonksiyonel transmembran proteinlerinin lipid bilayer içine dahil edilmesi, bu proteinlerin büyüklüğü, inceliği ve ihtiyaç duyulacak ek deterjan değişim adımları nedeniyle zor olmuştur27,31,32,33. Deterjanları çıkarmak için organik çözücü kullanımı protein toplama ve denatüre edilmesine neden olur34. Geliştirilmiş deterjan aracılı bir yöntem umut vericidir, ancak deterjan giderme adımı için dikkatli olunması ve belirli proteinler için optimizasyon gerekebilir31,35. Ek olarak, elektroformasyon kullanan yöntemler protein seçimini kısıtlayabilir ve özellikle yüklü lipitler için tüm lipit bileşimleri için uygun olmayabilir31,36,37. Kullanılan bir diğer teknik, istenen proteini içeren büyük unilameller vesicles'in (LUV) PEPTİD kaynaklı füzyonudur, ancak zahmetli olduğu ve yabancı moleküllerin yerleştirilmesine yol açabileceği bulunmuştur-fusojenik peptitler33,38,39. Canlı hücrelerden elde edilen dev plazma membran veziklikleri (GPMV'ler) bu sorunların bazılarının üstesinden gelmek için kullanılabilir, ancak ortaya çıkan lipit ve protein bileşiminin minimum kontrolüne izin verir14,40,41. Bu nedenle, modifiye agarose şişme yöntemimizi kullanarak IMP'lerin GUV'lerin bilipid tabakasına entegrasyonu, bu proteinleri membran ortamında daha fazla incelemek için güvenilir bir yöntem sürmektedir42,43,44,45.
Hücresel sinyalizasyon ve iletişim, G protein bağlantılı reseptörler (GPCR) olarak bilinen bir protein ailesini içerir; GPCR'ler en büyük protein ailesi arasındadır ve diğer birçok fizyolojik fonksiyon arasında ruh hali, iştah, kan basıncı, kardiyovasküler fonksiyon, solunum ve uyku modülasyonu ile ilişkilidir46. Bu çalışmada GPCR ailesinin prototipik bir üyesi olan insan serotonin 1A reseptörü (5-HT1AR) kullanıldı. 5-HT1AR merkezi sinir sistemi (CNS) ve kan damarlarında bulunabilir; kardiyovasküler, gastrointestinal, endokrin fonksiyonlar gibi çok sayıda işlevi etkiler ve mood47'nin düzenlenmesine katılır. GPCR araştırmalarının önündeki büyük bir engel karmaşık amfifilik yapılarından kaynaklanmaktadır ve GUV'lar protein işlevselliği, lipid-protein etkileşimleri ve protein-protein etkileşimleri gibi çeşitli ilgi çekici özelliklerin araştırılması için umut verici bir platform sunun. Yüzey plazmon rezonansı (SPR)48,49, nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (NMR)50,51, protein lipid kaplaması (FKÖ) tahlil51,52,53,54, yerli kütle spektrometresi55, izotermal titrasyon kalorimetresi (ITC)56,57 ve lipozom sedimentasyon tahlil58,59. Laboratuvarımız, reseptörün aktif durumunda Giα alt birliğine bağlanan BODIPY-GTPφS'yi yalıtarak lipid-protein etkileşimlerinin protein işlevselliği üzerindeki etkisini araştırmak için basitleştirilmiş GUV yaklaşımını kullanmıştır. Bağlamaları, zaman içinde tespit edilebilen bir floresan sinyali üreten floroforu çözer45. Ayrıca, çeşitli çalışmalar Lipid-protein etkileşimlerini ve proteinlerin membran eğriliğini algılama veya stabilize etmedeki rolünü araştırdı60,61 ve uygulanabilir bir GUV yaklaşımı kullanmak önemli bir avantaj olabilir.
Bu protokol, modifiye edilmiş bir agarose hidrojel sistemi17,42 kullanarak GPCR'leri GUV'lerin membranına dahil etmek için basit bir yöntem göstermektedir. Ayrıca, önceki çalışmalarımıza dayanarak, yöntemimiz 30-40 ° C'ye kısa süreli maruz kalabilen IMP'ler için uygun olabilir. Kısaca, ilgi GPCR'sini içeren membran parçalarıyla birlikte ince bir agarose filmi yaydık. Bu tabakanın jelasyonunu takiben, agarose üzerine bir lipit çözeltisi biriktiriyoruz ve çözücüyün buharlaşmasını sağlıyoruz. Sistemin yeniden sulanması daha sonra sulu bir tampon ile gerçekleştirildi ve lipid bilayer'e dahil protein içeren GUV'lerin oluşumuna neden oldu.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td>
			<td>850375C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;TI-Eclipse inverted microscope</td>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td>
			<td>850355C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13/16&#8243; ID, 1&#8243; OD silicon O-rings</td>
			<td>Sterling Seal &#38; Supply, Neptune, IN</td>
			<td>5-003-8770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera</td>
			<td>Photometrics, Huntington Beach, CA</td>
			<td>&#160;Cascade II 512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td>
			<td>850457C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm</td>
			<td>Coherent, Santa Clara, CA</td>
			<td>488/561-50-LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-HT1AR membrane fragments</td>
			<td>Perkin Elmer, Waltham, MA</td>
			<td>RBHS1AM400UA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE)</td>
			<td>ATTO-TEC, Siegen, Germany</td>
			<td>AD 488-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench top plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma, Ithaca, NY</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform (CHCl3)</td>
			<td>Millipore Sigma, Burlington, MA</td>
			<td>CX1055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol (Chol)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>C8667-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Flat Clear Bottom</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic</td>
			<td>Elma, Singen, Germany</td>
			<td>[no longer sold on main website]</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol (MeOH)</td>
			<td>Millipore Sigma, Burlington, MA</td>
			<td>MX0485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-1000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-Rhodamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>46406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS)</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>21-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning-disc CSUX confocal head</td>
			<td>Yokogawa,Tokyo, Japan</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>standard 25 mm no. 1 glass coverslips</td>
			<td>ChemGlass, Vineland, NJ</td>
			<td>CLS-1760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sykes-Moore chambers</td>
			<td>Bellco, Vineland, NJ</td>
			<td>1943-11111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low melting temperature agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Analog Heatblock</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>[no longer sold on main website]</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Tube Rotator</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>10136-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>89882</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of model lipid membranes incorporating g-protein coupled receptors (gpcrs)

İntegral membran proteinlerinin yapısı ve işlevinin sağlam in vitro incelemeleri, plazma zarının karmaşıklığı ve canlı hücrelerde protein davranışını etkileyen çok sayıda faktör nedeniyle zor olmuştur. Dev unilamellar vesicles (GUVs), protein-membran etkileşimlerini araştırmak ve protein davranışını kesin, uyarana bağlı bir şekilde araştırmak için biyomimetik ve yüksek oranda tonlanabilir bir in vitro model sistemidir. Bu protokolde, membrana saplanmış insan serotonin 1A reseptörü (5-HT1AR) ile GUV'ların üretimi için ucuz ve etkili bir yöntem sunuyoruz. Modifiye hidrojel şişme yöntemi kullanarak GUV'lar imal ediyoruz; agarose ve 5-HT1AR karışımının üzerine bir lipid filmi biriktirerek ve daha sonra tüm sistemi nemlendirerek, membran içine dahil edilmiş düzgün yönlendirilmiş ve fonksiyonel 5-HT1AR ile vezikliler oluşturulabilir. Bu GUV'lar daha sonra mikroskopi ile protein-membran etkileşimlerini ve lokalizasyon davranışını incelemek için kullanılabilir. Sonuç olarak, bu protokol, derin fizyolojik içgörü sağlayarak integral membran proteinlerinin işlevselliği hakkındaki anlayışımızı ilerletebilir.

Protein konsantrasyonu ölçüldü ve etiketleme derecesi boya ile protein arasındaki azı dişi oranı olarak 1:1 olarak hesaplandı. Konfokal mikroskopi kullanarak GUV'ları inceleyerek veziklin başarılı oluşumunu ve protein entegrasyonunu doğrulayabildik. Lipitler %0.4 atto 488-DPPE ile etiketlendi ve protein rhodamine NHS-ester birincil aminlerin modifikasyonu ile birlikte etiketlendi. Şekil 2a ve Şekil 2b sırasıyla ATTO 488 ve rhodamin kanalların...

Watch this Scientific Journal Video about Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors GPCRs at JoVE.com

Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors GPCRs

Bu protokol, farmakolojik olarak önemli G proteini bağlantılı reseptör sınıflarından biri olan insan 1A serotonin reseptör proteininin (5-HT1AR) yeniden uzlaştırılması için burada açıklandığı gibi, integral membran proteinlerini (IMP'ler) dev unilamellar lipid veziküllerine (GUVs) dahil etmek için güçlü ve genelleştirilebilir bir teknik olarak agarose şişmesini kullanır.

G-protein Bağlantılı Reseptörleri (GPCR) içeren Model Lipid Membranlarının yapımı

Robust in vitro investigations of the structure and function of integral membrane proteins has been a challenge due to the complexities of the plasma ...

İntegral membran proteinlerinin kendi ortamlarında incelenmesi, plazma zarının karmaşıklığı nedeniyle zor olmuştur. Dev unilamellar lipid vezikülleri veya GUV'lar, biyomembran özelliklerini incelemek için en belirgin platformlardan biridir ve çeşitli fizyolojik durumları taklit etmek için tasarlanmıştır. Bu protokol, hidrojel şişmeden sonra, spontan bir bütünleşmeye dayalı protein dahil GUV'ler imal etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. GUV'leri imal etmek için geleneksel yöntemler integral membran proteini birleştirilmesi için genelleştirilemez. Bu yöntemler genellikle düşük verim, metodolojik olarak karmaşık ve geçicidir, geniş protein sınıfları için geçerli değildir. Öte yandan, bu protokol GUV'larda fonksiyonel integral membran proteinlerini dahil etmek için esnek, sağlam ve basit bir yöntemi temsil eder.Bunu, proteini içeren bir hidrojel iskele hazırlayarak ve üzerine ince bir lipit tabakası biriktirerek başardık. Burada sunulan örnekte, G protein bağlantılı reseptör veya GPCR'yi GUV'lara dahil ettik.Tüm sistemin yeniden sulanması üzerine, GUV'lar hidrojel yüzeyinden düzgün yönlendirilmiş GPCR'ler içeren membranla tomurcuklandı.Tüm reaktiflerin oda sıcaklığına gelmesine izin verin. Bu süre zarfında, kapak kaymalarını metanol içine yerleştirerek ve 40'ta 30 dakika sonicating yaparak temizleyin

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Bioengineering

Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors (GPCRs)

Unit 1

Membrane Structure and Components

SCIENTISTS IN ACTION

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

Lipid Nanotüpler Kan Pıhtılaşma Faktör VIII Sarmal Organizasyonu

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

Biyomühendislik

Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

G-protein bağlı reseptörler ile Potasyum kanallarının modülasyonunu Algılama Label içermeyen optik Biyosensör kullanımı

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Mikroakışkan jeti kullanarak çift katlı lipid Vesikül Üretimi

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

Bir Roman Vokal Fold Bioreactor İnşaatı ve Karakterizasyonu

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

Preparation of Light-responsive Membranes by a Combined Surface Grafting and Postmodification Process

Bir Kombine Yüzey Tırnak ve Postmodification Süreci Işık duyarlı Membranların Hazırlanması

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Solvent destekli çift katlı lipid (SALB) Yöntemi ile biyomembran Fabrikasyon

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Micropatterned Makro ölçekli 3D Hücresel Mimarlık Modüler Hidrojel Levhaların İnşaatı

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Magnetic Levitation Coupled with Portable Imaging and Analysis for Disease Diagnostics

Hastalık Teşhis için Taşınabilir Görüntüleme ve Analiz ile birleştiğinde Manyetik Levitasyonunun

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Su Arıtma Membranlar olarak Zehirli Özelliklere Sahip Hidrojeller Sentezi

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

Construction and Setup of a Bench-scale Algal Photosynthetic Bioreactor with Temperature, Light, and pH Monitoring for Kinetic Growth Tests

Kinetik Büyüme Testleri için Sıcaklık, Işık ve pH İzleme ile Bir Bench Ölçekli Algal Fotosentetik Biyoreaktörün Kurulması ve Kurulması

The optimal design and operation of photosynthetic bioreactors (PBRs) for microalgal cultivation is essential for improving the environmental and economic ...