Name: two-layered membrane sandwich method for laodelphax striatellus saliva collection
Uploaded: 2021-08-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Key Research and Development Program of China (nr. 2019YFC1200503), af National Science Foundation of China (Nr. 32072385) og af Youth Innovation Promotion Association CAS (2021084).

1. SBPH vedligeholdelse
<ol><li>Bag de viruliferous og RSV-fri SBPH individer i et glas inkubator (65 x 200 mm) med 5-6 ris(Oryza sativa cv. Nipponbare) frøplanter pr glaskammer i laboratoriet. Dyrk risplanterne ved 25 °C under en 16 timers lys / 8 timers mørk fotoperiode. BEMÆRK: De viruliferous og RSV-fri SBPH individer blev oprindeligt fanget i Jiangsu-provinsen, Kina.</li>
	<li>Detekter RSV i SBPH ved dot-enzym-forbundet immunosorbent assay (dot-ELISA) med en kanin RSV-specifikke polyklonale antisto...

<ol>
	<li>Cheng, X., Zhu, L., He, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+understanding+of+molecular+interactions+between+rice+and+the+brown+planthopper.">Towards understanding of molecular interactions between rice and the brown planthopper.</a> Molecular Plant. 6 (3), 621-634 (2013).</li><li>Cho, W. K., Lian, S., Kim, S. M., Park, S. H., Kim, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+insights+into+research+on+Rice+Stripe+Virus.">Current insights into research on Rice Stripe Virus.</a> The Plant Pathology Journal. 29 (3), 223-233 (2013).</li><li>He, M., Guan, S. Y., He, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+rice+stripe+virus.">Evolution of rice stripe virus.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 109, 343-350 (2017).</li><li>Wu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonstructural+protein+NS4+of+Rice+Stripe+Virus+plays+a+critical+role+in+viral+spread+in+the+body+of+vector+insects.">Nonstructural protein NS4 of Rice Stripe Virus plays a critical role in viral spread in the body of vector insects.</a> PLoS One. 9 (2), 88636 (2014).</li><li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transovarial+transmission+of+a+plant+virus+is+mediated+by+vitellogenin+of+its+insect+vector.">Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector.</a> PLoS Pathogens. 10 (3), 1003949 (2014).</li><li>Taning, C. N., Andrade, E. C., Hunter, W. B., Christiaens, O., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asian+citrus+psyllid+RNAi+pathway-RNAi+evidence.">Asian citrus psyllid RNAi pathway-RNAi evidence.</a> Scientific Reports. 6, 38082 (2016).</li><li>Garbutt, J. S., Bell&#233;s, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+double-stranded+RNA+in+insect+hemolymph+as+a+potential+determiner+of+RNA+interference+success:+evidence+from+Manduca+sexta+and+Blattella+germanica.">Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: evidence from Manduca sexta and Blattella germanica.</a> Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).</li><li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+feeding+Rice+Stripe+Virus+enables+efficient+virus+infection+of+Laodelphax+striatellus.">Artificial feeding Rice Stripe Virus enables efficient virus infection of Laodelphax striatellus.</a> Journal of Virological Methods. 235, 139-143 (2016).</li><li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+tissue-specific+vitellogenin+facilitates+transmission+of+plant+virus.">Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus.</a> PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).</li><li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+Stripe+Virus+hitchhikes+the+vector+insect+vitellogenin+ligand-receptor+pathway+for+ovary+entry.">Rice Stripe Virus hitchhikes the vector insect vitellogenin ligand-receptor pathway for ovary entry.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374, 20180312 (2019).</li><li>Bao, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+intestine-specific+transcriptome+of+the+brown+planthopper+Nilaparvata+lugens+revealed+potential+functions+in+digestion,+detoxification+and+immune+response.">De novo intestine-specific transcriptome of the brown planthopper Nilaparvata lugens revealed potential functions in digestion, detoxification and immune response.</a> Genomics. 99 (4), 256-264 (2012).</li><li>Elzinga, D. A., Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+protein+effectors+in+plant-aphid+interactions.">The role of protein effectors in plant-aphid interactions.</a> Current Opinion In Plant Biology. 16 (4), 451-456 (2013).</li><li>Chung, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbivore+exploits+orally+secreted+bacteria+to+suppress+plant+defenses.">Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15728-15733 (2013).</li><li>Bos, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+genomics+approach+identifies+candidate+effectors+from+the+aphid+species+Myzus+persicae+(green+peach+aphid).">A functional genomics approach identifies candidate effectors from the aphid species Myzus persicae (green peach aphid).</a> PLoS Genetics. 6 (11), 1001216 (2010).</li><li>Liu, X., Zhou, H., Zhao, J., Hua, H., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+secreted+watery+saliva+proteins+of+the+rice+brown+planthopper,+Nilaparvata+lugens+(St&#229;l)+by+transcriptome+and+Shotgun+LC-MS/MS+approach.">Identification of the secreted watery saliva proteins of the rice brown planthopper, Nilaparvata lugens (St&#229;l) by transcriptome and Shotgun LC-MS/MS approach.</a> Journal of Insect Physiology. 89, 60-69 (2016).</li><li>Cao, T. T., L&#252;, J., Lou, Y. G., Cheng, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding-induced+interactions+between+two+rice+planthoppers,+Nilaparvata+lugens+and+Sogatella+furcifera+(Hemiptera:+Delphacidae):+effects+on+feeding+and+honeydew+excretion.">Feeding-induced interactions between two rice planthoppers, Nilaparvata lugens and Sogatella furcifera (Hemiptera: Delphacidae): effects on feeding and honeydew excretion.</a> Environmental Entomology. 42 (6), 1281-1291 (2013).</li><li>De Vos, M., Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myzus+persicae+(green+peach+aphid)+salivary+components+induce+defence+responses+in+Arabidopsis+thaliana.">Myzus persicae (green peach aphid) salivary components induce defence responses in Arabidopsis thaliana.</a> Plant, Cell &amp; Environment. 32 (11), 1548-1560 (2009).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+immune+system+architecture+and+transcriptome+responses+to+southern+rice+black-streaked+dwarf+virus+in+Sogatella+furcifera.">Understanding the immune system architecture and transcriptome responses to southern rice black-streaked dwarf virus in Sogatella furcifera.</a> Scientific Reports. 6, 36254 (2016).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetration+into+rice+tissues+by+brown+planthopper+and+fine+structure+of+the+salivary+sheaths.">Penetration into rice tissues by brown planthopper and fine structure of the salivary sheaths.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 129 (3), 295-307 (2008).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Armet+is+an+effector+protein+mediating+aphid-plant+interactions.">Armet is an effector protein mediating aphid-plant interactions.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 29 (5), 2032-2045 (2015).</li><li>Chaudhary, R., Atamian, H. S., Shen, Z., Briggs, S. P., Kaloshian, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GroEL+from+the+endosymbiont+Buchnera+aphidicola+betrays+the+aphid+by+triggering+plant+defense.">GroEL from the endosymbiont Buchnera aphidicola betrays the aphid by triggering plant defense.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 8919-8924 (2014).</li><li>Ma, R., Chen, J. L., Cheng, D. F., Sun, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+defense+mechanism+in+wheat+by+polyphenol+oxidase+from+aphid+saliva.">Activation of defense mechanism in wheat by polyphenol oxidase from aphid saliva.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 58 (4), 2410-2418 (2010).</li><li>Zheng, L., Seon, Y. J., McHugh, J., Papagerakis, S., Papagerakis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clock+genes+show+circadian+rhythms+in+salivary+glands.">Clock genes show circadian rhythms in salivary glands.</a> Journal of Dental Research. 91 (8), 783-788 (2012).</li><li>Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+transcriptomic/proteomic+analysis+of+salivary+gland+and+secreted+saliva+in+three+planthopper+species.">Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species.</a> Journal of Proteomics. 172, 25-35 (2018).</li><li>Huang, H. J., Liu, C. W., Xu, H. J., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucin-like+protein,+a+saliva+component+involved+in+brown+planthopper+virulence+and+host+adaptation.">Mucin-like protein, a saliva component involved in brown planthopper virulence and host adaptation.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 223-230 (2017).</li><li>Shangguan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mucin-like+protein+of+planthopper+is+required+for+feeding+and+induces+immunity+response+in+plants.">A mucin-like protein of planthopper is required for feeding and induces immunity response in plants.</a> Plant Physiology. 176 (1), 552-565 (2018).</li><li>Petrova, A., Smith, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodetection+of+a+brown+planthopper+(Nilaparvata+lugens+St&#229;l)+salivary+catalase-like+protein+into+tissues+of+rice,+Oryza+sativa.">Immunodetection of a brown planthopper (Nilaparvata lugens St&#229;l) salivary catalase-like protein into tissues of rice, Oryza sativa.</a> Insect Molecular Biology. 23 (1), 13-25 (2014).</li><li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+small+brown+planthopper,+Laodelphax+striatellus.">Genome sequence of the small brown planthopper, Laodelphax striatellus.</a> GigaScience. 6 (12), 1-12 (2017).</li><li>Van Bel, A. J., Will, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+evaluation+of+proteins+in+watery+and+gel+saliva+of+aphids.">Functional evaluation of proteins in watery and gel saliva of aphids.</a> Frontiers In Plant Science. 7, 1840 (2016).</li><li>Perez-Vilar, J., Hill, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+assembly+of+secreted+mucins.">The structure and assembly of secreted mucins.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (45), 31751-31754 (1999).</li><li>Pitino, M., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aphid+protein+effectors+promote+aphid+colonization+in+a+plant+species-specific+manner.">Aphid protein effectors promote aphid colonization in a plant species-specific manner.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 26 (1), 130-139 (2013).</li><li>Zhang, F., Zhu, L., He, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+expression+in+response+to+brown+planthopper+feeding+in+rice.">Differential gene expression in response to brown planthopper feeding in rice.</a> Journal of Plant Physiology. 161 (1), 53-62 (2004).</li><li>Hogenhout, S. A., Ammar, E. -. D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses.">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li><li>Boissot, N., Schoeny, A., Vanlerberghe-Masutti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vat,+an+amazing+gene+conferring+resistance+to+aphids+and+viruses+they+carry:+from+molecular+structure+to+field+effects.">Vat, an amazing gene conferring resistance to aphids and viruses they carry: from molecular structure to field effects.</a> Frontiers In Plant Science. 7, 1420 (2016).</li></ol>

Vellykket opdræt af insekter på kunstig kost blev først rapporteret i 1962, da Mittler og Dadd beskrev Paraffin membran teknik til at holde en kunstig kost29,30. Og denne metode er blevet udforsket i mange aspekter af insektbiologi og adfærd, for eksempel næringsstoftilskud, dsRNA fodring og virusopsamling. Baseret på kravene til spytanalyse anvendes 5% saccharose som den generelle kunstige kost til at indsamle spyt af SBPH i denne undersøgelse. For vellyk...

Risstribevirus (RSV), en negativstrenget RNA-virus i slægten Tenuivirus, forårsager alvorlige sygdomme i risproduktionen i Østasien1,2,3. Overførsel af RSV fra inficerede risplanter til sunde afhænger af insektvektorer, hovedsagelig Laodelphax striatellus, som overfører RSV på en vedvarende formeringsiv måde. SBPH erhverver virus efter fodring på RSV-inficerede planter. En gang inde i insektet inficerer RSV midgut epitelcellen en dag efter fodring og passerer derefter gennem midgutbarrieren for at trænge ind i hæmolymfen. Efterfølgende spredes RSV til forskellige væv via hæmolymfen og formerer sig derefter. Efter en latent periode på ca. 10-14 dage efter erhvervelsen kan virussen inde i spytkirtlen overføres til de sunde værtsplanter via det udskillede spyt, mens SBPH suger saft fra phloem4,5,6,7,8,9,10 . En effektiv fodringsproces og forskellige faktorer i spyt er afgørende for spredningen af RSV fra insektet til værtsplanten.
Insekt spyt udskilles af spytkirtler menes at mægle insekter, vira og værtsplanter. Hemipteran insekter normalt producere to typer spyt: gelling spyt og vandig spyt11,12,13. Gelering spyt udskilles hovedsageligt i apoplasmen for at opretholde stilens bevægelse blandt værtsceller og er også relateret til at overvinde planteresistens og immunrespons14,15,16,17. På sonderingsstadiet for fodring udskiller insekter periodisk geleringspyt, der straks bliver oxideret til at danne en overfladeflange. Derefter omslutter enkelt- eller forgrenede kapper stylet for at reservere en rørformet kanal18,19,20. Overfladen flange på epidermis formodes at lette penetration af stylet ved at tjene som et ankerpunkt, mens skeder omkring stylet kan give mekanisk stabilitet og smøring16,21,22,23. Nlshp blev identificeret som et vigtigt protein for spyt kappe dannelse og vellykket fodring af brun planthopper (Nilaparvata lugens, BPH). Hæmning af udtrykket af det strukturelle kappeprotein (SHP), der udskilles af bladlusen Acyrthosiphon pisum, reducerede reproduktionen ved at forstyrre fodring fra værtssigterør24. Desuden, i nogle insektarter, gel spyt faktorer formodes at udløse planten immunrespons ved at danne såkaldte planteæder-associerede molekylære mønstre (HAMPs). I N. lugens, NlMLP, en mucin-lignende protein relateret til kappe dannelse, inducerer planteforsvar mod fodring, herunder celledød, udtryk for forsvar-relaterede gener, og callose deposition 25,26. Også, nogle gel spyt faktorer i bladlus har vist sig at udløse planteforsvar svar via gen-til-gen interaktioner svarende til patogen-associerede molekylære mønstre12,15,27.
For at studere spytfaktorerne, der er afgørende for insektfodring og / eller patogenoverførsel, er det nødvendigt at analysere udskillet spyt. Her beskrives kunstige fodrings- og indsamlingsmetoder til at opnå tilstrækkelige mængder spyt til yderligere analyse. Ved hjælp af et medium, der kun indeholder et enkelt ernæringsmæssigt element, blev mange spytproteiner indsamlet og analyseret ved sølvfarvning og vestlig blotting. Denne metode vil være nyttig i yderligere forskning i faktorer i spyt, der er afgørende for RSV transmission af SBPH.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10-KD centrifugal filter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>R5PA83496</td>
			<td>For concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Protein Transfer Buffer(wet)</td>
			<td>macGENE</td>
			<td>MP008</td>
			<td>Transfer buffer for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x TBST buffer</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>SL1328-500mL&#215;10</td>
			<td>Wash buffer for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azure c600 biosystems</td>
			<td>Azure Biosystems</td>
			<td>Azure c600</td>
			<td>Imaging system for western blotting and silver staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Color Prestained protein ladder</td>
			<td>GenStar</td>
			<td>M221-01</td>
			<td>Protein marker for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL&#160;western blotting detection reagents</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN2209</td>
			<td>Western blotting detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enchanced HRP-DAB Chromogenic Kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>#PA110</td>
			<td>Chromogenic reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>401393-2ML</td>
			<td>Polyclonal secondary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon(R)-P Polyvinylidene difluoride membrane</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Transfer membrane for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1725125</td>
			<td>For quantitative real-time PCR (qRT-PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHES</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708891</td>
			<td>For Reverse-transcriptional PCR (RT-PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Filter, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td>For filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAB TGX Gels</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561043</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONEC-W</td>
			<td>Detection of protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon membrane</td>
			<td>PALL</td>
			<td>T42754</td>
			<td>Membrane for dot-ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M Membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>Making artifical diet sandwichs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-LssgMP polyclonal antibody against LssgMP peptides</td>
			<td>Genstript</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit primary anti-LssgMP polyclonal antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-RSV polyclonal antibody</td>
			<td>Genstript</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit primary anti-RSV polyclonal antibody for western blotting and dot-ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAprep pure Micro Kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>DP420</td>
			<td>For RNA Extraction</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-layered membrane sandwich method for laodelphax striatellus saliva collection

Ris stribe virus (RSV), som forårsager betydelige økonomiske tab af landbrug i Østasien, helt afhænger af insekt vektorer for sin effektive transmission blandt vært ris. Laodelphax striatellus (lille brun planthopper, SBPH) er den primære insektvektor, der vandret overfører RSV, mens suger saft fra phloem. Spyt spiller en væsentlig rolle i insekternes fodringsadfærd. En bekvem metode, der vil være nyttig til forskning i insekters spyt med piercingsugende fodringsadfærd, er beskrevet her. I denne metode fik insekter lov til at fodre på en kunstig kost klemt inde mellem to strakte paraffinfilmlag. Kosten, der indeholder spyt blev indsamlet hver dag, filtreret, og koncentreret til yderligere analyse. Endelig blev kvaliteten af indsamlet spyt undersøgt af proteinfarvning og immunblæseri. Denne metode blev eksemplificeret ved at opdage tilstedeværelsen af RSV og et mucin-lignende protein i spyt af SBPH. Disse kunstige fodring og spyt indsamling metode vil lægge et fundament for yderligere forskning i faktorer i insekt spyt relateret til fodring adfærd og virus transmission.

Skemaer for kunstig fodring installation og spyt indsamling Figur 1A skildrer glascylinderen (15 cm x 2,5 cm), der bruges som foderkammer til at opsamle spyt. For det første blev SBPH larverne sultet i flere timer for at forbedre indsamlingseffektiviteten og derefter immobiliseret ved at køle i 5 minutter. Efter at insekterne blev overført til glascylinderen, blev begge åbne ender af kammeret dækket af strakt paraffinmembran. I den ene ende blev 200 μL 5% saccharose...

Watch this Scientific Journal Video about Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection at JoVE.com

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

Den nuværende protokol beskriver en metode til at indsamle tilstrækkeligt spyt fra piercing-sugende insekter ved hjælp af et kunstigt medium. Dette er en bekvem metode til indsamling af insekt spyt og studere spytfunktion på insekt fodring adfærd og vektorbårne virus transmission.

To-lags membran Sandwich Metode til Laodelphax striatellus Spyt Collection

Rice stripe virus (RSV), which causes significant economic loss of agriculture in East Asia, entirely depends on insect vectors for its effective ...

Kunstig fodring og spytsamling giver en direkte metode til påvisning af effektorer i insektspyt. Dette er dog ikke blevet beskrevet i detaljer før. Denne protokol er effektiv til spytsamling fra saprofytiske insekter.Derudover er det en simpel teknik, da vi bruger medium, der kun indeholder saccharose som kunstig kost. Saprofitiske insekter spyt kan påvirke mod værtens immunsystem til gavn for fodring adfærd og overføre patogener. Denne medicin, der kan bruges til insektadfærd og insektbenstiforskning.Dette er en simpel metode til at udføre. Dette tyder dog på montering af rent eksperimentelt miljø, da spyt indsamles til yderligere forskning. Begynd med at forberede en 5% saccharoseopløsning til den kunstige kost, og filtrer opløsningen gennem et 0,22 mikron filter for at fjerne bakteriel forurening og urenheder.Sult ca. 200 små brune plantebeholderlarver i tre til fem timer, før de indføres i et fodringskammer. Dernæst for at forberede glascylindrene som fodringskamre, dække den ene åbne ende af kammeret med en paraffinmembran, før du introducerer de eksperimentelle insekter, overfør derefter insekterne til glascylinderen og dækker den anden ende af kammeret med strakt paraffinmembran. Tilsæt 200 mikroliter kunstig kost på membranen, og dæk derefter væsken med et andet lag strakt paraffinmembran.Endelig dække kammeret med aluminiumsfolie, forlader enden med den kunstige kost enhed udsat for lyset. Efter 24 timer skal du samle SBPH-spyt ved at afkøle cylinderen ved fire grader Celsius for at immobilisere insekterne, derefter afdække den ydre film og samle den kunstige kost i 1,5 milliliter sterile rør ved hjælp af en steril pipette. Hold den indsamlede spyt på minus 80 grader Celsius indtil analyse.Skyl derefter den indre membran med 50 mikroliter frisk kunstig kost tre gange ved at pipettere blødt og samle den kunstige vaskediæt i 1,5 milliliter sterile rør. Efter de tre skylninger tilsættes frisk kunstig kost på den indre membran og læg en frisk strakt paraffinmembran ovenpå. Endelig filtreres de indsamlede prøver gennem en 0,22 mikron filterenhed for at fjerne mikrober og andre forurenende stoffer.Overfør de kollektive spytprøver i et 500 mikroliter, 10 kilodalton centrifugalfilter. Centrifuge prøven. Saml supernatant og opdrage det endelige volumen til 100 mikroliter.For at måle koncentrationen af det indsamlede spyt skal du tænde for UV-synligt spektrofotometer og vaske piedestalerne tre gange med dobbeltdestilleret vand. Vælg indstillingerne på skærmen i følgende rækkefølge, proteiner, protein A280. Vælg type og én absorbansenhed svarende til et milligram pr. milliliter.Markér derefter afkrydsningsfeltet for oprindelig korrektion, 340 nanometer. Derefter skal du indlæse to mikroliter på 5% saccharose vandig opløsning som tom, og tryk derefter på Tom nederst på skærmen. Endelig, efter at have sat standarderne, skal du indlæse to mikroliter af det indsamlede spyt og registrere proteinkoncentrationen.Ved fodring på 5% saccharose overlevede mere end 80% af SBPH i de første fire dage. Men fra den femte dag og fremefter steg dødeligheden hurtigt til 40%, og på den syvende dag overlevede mindre end halvdelen af SBPH. En SDS side analyse viste den koncentrerede spyt prøver fra RSV-inficerede SBPH spyt indeholdt mange flere proteiner end 5% saccharose negativ kontrol.I en vestlig blotanalyse til påvisning af RSV capsidproteinet, et ikke-inficeret og viruliferous insekter. RSV capsidproteinet blev med succes påvist i den viruliferøse prøve, et antistof designet mod LssgMP-genproduktet opdagede et 78 kilodaltonprotein i ikke-inficerede og viruliferøse prøver, hvilket viser, at LssgMP er et spytprotein. En QRT PCR-analyse af LssgMP-udskriftsniveauer i forskellige væv viste, at Lssg-udskriftsniveauerne i spytkirtlen var 20 gange højere end i hele kroppen og tarmen, hvilket bekræftede det specifikke udtryk for LssgMP i spytkirtlen.Sultende de eksperimentelle insekter, før de introduceres i kammeret, er nødvendig for at sikre effektiviteten af vores spytsamling. Desuden bør der indsamles og udveksles et kunstigt medium hver 24. time for at reducere mikrobiel forurening i den indsamlede prøve. Denne teknik giver en direkte metode til at studere funktionen af spyt i transmission af patogener.Derudover kan det hjælpe med at studere insektpatogen host interaktion.

Research

JoVE Journal

Biology

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

High-throughput krystallisering af membranproteiner Brug af Lipidic Bicelle Metode

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

Blodprøvetagningssystem for Biokemisk Analyse i Voksen Zebrafisk

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Anvendelse af en robot til Højkapacitetsforskning Krystallisation af membranproteiner i Lipidiske mesofaser

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Høst og Cryo-køling Krystaller af membranproteiner dyrket i Lipidiske mesofaser for Structure Bestemmelse ved makromolekylær krystallografi

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation

En praktisk og Novel metode til at udvinde Genomisk DNA fra Blood Collection Kits til Plasma Protein Preservation

Laboratory tests can be done on the cellular or  fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes  determines the portion of the ...

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Indsamling og analyse af<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Phloem exudater Brug af EDTA-lettet Method

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Mikroperfusionskammerindretning Teknik at undersøge Regulering af mikrokardannelse permeabilitet i rotte mesenterium

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish

Gentagen Blodprøvetagning for blodprøver Voksen Zebrafisk

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Grundtilstand udtynding super-resolution Imaging i pattedyrceller

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...