Name: two-layered membrane sandwich method for laodelphax striatellus saliva collection
Uploaded: 2021-08-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door het National Key Research and Development Program of China (nr. 2019YFC1200503), door de National Science Foundation of China (nr. 32072385) en door Youth Innovation Promotion Association CAS (2021084).

1. SBPH onderhoud
<ol><li>Kweek de virulifere en RSV-vrije SBPH-individuen in een glazen incubator (65 x 200 mm) met 5-6 rijst(Oryza sativa cv. Nipponbare) zaailingen per glazen kamer in het laboratorium. Kweek de rijstplanten bij 25 °C onder een 16 uur licht / 8 uur donkere fotoperiode. OPMERKING: De virulifere en RSV-vrije SBPH-individuen werden aanvankelijk gevangen in de provincie Jiangsu, China.</li>
	<li>Detecteer RSV in SBPH door dot-enzyme-linked immunosorbent assay (dot-ELISA) met een konijn RSV-s...

<ol>
	<li>Cheng, X., Zhu, L., He, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+understanding+of+molecular+interactions+between+rice+and+the+brown+planthopper.">Towards understanding of molecular interactions between rice and the brown planthopper.</a> Molecular Plant. 6 (3), 621-634 (2013).</li><li>Cho, W. K., Lian, S., Kim, S. M., Park, S. H., Kim, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+insights+into+research+on+Rice+Stripe+Virus.">Current insights into research on Rice Stripe Virus.</a> The Plant Pathology Journal. 29 (3), 223-233 (2013).</li><li>He, M., Guan, S. Y., He, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+rice+stripe+virus.">Evolution of rice stripe virus.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 109, 343-350 (2017).</li><li>Wu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonstructural+protein+NS4+of+Rice+Stripe+Virus+plays+a+critical+role+in+viral+spread+in+the+body+of+vector+insects.">Nonstructural protein NS4 of Rice Stripe Virus plays a critical role in viral spread in the body of vector insects.</a> PLoS One. 9 (2), 88636 (2014).</li><li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transovarial+transmission+of+a+plant+virus+is+mediated+by+vitellogenin+of+its+insect+vector.">Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector.</a> PLoS Pathogens. 10 (3), 1003949 (2014).</li><li>Taning, C. N., Andrade, E. C., Hunter, W. B., Christiaens, O., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asian+citrus+psyllid+RNAi+pathway-RNAi+evidence.">Asian citrus psyllid RNAi pathway-RNAi evidence.</a> Scientific Reports. 6, 38082 (2016).</li><li>Garbutt, J. S., Bell&#233;s, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+double-stranded+RNA+in+insect+hemolymph+as+a+potential+determiner+of+RNA+interference+success:+evidence+from+Manduca+sexta+and+Blattella+germanica.">Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: evidence from Manduca sexta and Blattella germanica.</a> Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).</li><li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+feeding+Rice+Stripe+Virus+enables+efficient+virus+infection+of+Laodelphax+striatellus.">Artificial feeding Rice Stripe Virus enables efficient virus infection of Laodelphax striatellus.</a> Journal of Virological Methods. 235, 139-143 (2016).</li><li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+tissue-specific+vitellogenin+facilitates+transmission+of+plant+virus.">Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus.</a> PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).</li><li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+Stripe+Virus+hitchhikes+the+vector+insect+vitellogenin+ligand-receptor+pathway+for+ovary+entry.">Rice Stripe Virus hitchhikes the vector insect vitellogenin ligand-receptor pathway for ovary entry.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374, 20180312 (2019).</li><li>Bao, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+intestine-specific+transcriptome+of+the+brown+planthopper+Nilaparvata+lugens+revealed+potential+functions+in+digestion,+detoxification+and+immune+response.">De novo intestine-specific transcriptome of the brown planthopper Nilaparvata lugens revealed potential functions in digestion, detoxification and immune response.</a> Genomics. 99 (4), 256-264 (2012).</li><li>Elzinga, D. A., Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+protein+effectors+in+plant-aphid+interactions.">The role of protein effectors in plant-aphid interactions.</a> Current Opinion In Plant Biology. 16 (4), 451-456 (2013).</li><li>Chung, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbivore+exploits+orally+secreted+bacteria+to+suppress+plant+defenses.">Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15728-15733 (2013).</li><li>Bos, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+genomics+approach+identifies+candidate+effectors+from+the+aphid+species+Myzus+persicae+(green+peach+aphid).">A functional genomics approach identifies candidate effectors from the aphid species Myzus persicae (green peach aphid).</a> PLoS Genetics. 6 (11), 1001216 (2010).</li><li>Liu, X., Zhou, H., Zhao, J., Hua, H., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+secreted+watery+saliva+proteins+of+the+rice+brown+planthopper,+Nilaparvata+lugens+(St&#229;l)+by+transcriptome+and+Shotgun+LC-MS/MS+approach.">Identification of the secreted watery saliva proteins of the rice brown planthopper, Nilaparvata lugens (St&#229;l) by transcriptome and Shotgun LC-MS/MS approach.</a> Journal of Insect Physiology. 89, 60-69 (2016).</li><li>Cao, T. T., L&#252;, J., Lou, Y. G., Cheng, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding-induced+interactions+between+two+rice+planthoppers,+Nilaparvata+lugens+and+Sogatella+furcifera+(Hemiptera:+Delphacidae):+effects+on+feeding+and+honeydew+excretion.">Feeding-induced interactions between two rice planthoppers, Nilaparvata lugens and Sogatella furcifera (Hemiptera: Delphacidae): effects on feeding and honeydew excretion.</a> Environmental Entomology. 42 (6), 1281-1291 (2013).</li><li>De Vos, M., Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myzus+persicae+(green+peach+aphid)+salivary+components+induce+defence+responses+in+Arabidopsis+thaliana.">Myzus persicae (green peach aphid) salivary components induce defence responses in Arabidopsis thaliana.</a> Plant, Cell &amp; Environment. 32 (11), 1548-1560 (2009).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+immune+system+architecture+and+transcriptome+responses+to+southern+rice+black-streaked+dwarf+virus+in+Sogatella+furcifera.">Understanding the immune system architecture and transcriptome responses to southern rice black-streaked dwarf virus in Sogatella furcifera.</a> Scientific Reports. 6, 36254 (2016).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetration+into+rice+tissues+by+brown+planthopper+and+fine+structure+of+the+salivary+sheaths.">Penetration into rice tissues by brown planthopper and fine structure of the salivary sheaths.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 129 (3), 295-307 (2008).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Armet+is+an+effector+protein+mediating+aphid-plant+interactions.">Armet is an effector protein mediating aphid-plant interactions.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 29 (5), 2032-2045 (2015).</li><li>Chaudhary, R., Atamian, H. S., Shen, Z., Briggs, S. P., Kaloshian, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GroEL+from+the+endosymbiont+Buchnera+aphidicola+betrays+the+aphid+by+triggering+plant+defense.">GroEL from the endosymbiont Buchnera aphidicola betrays the aphid by triggering plant defense.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 8919-8924 (2014).</li><li>Ma, R., Chen, J. L., Cheng, D. F., Sun, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+defense+mechanism+in+wheat+by+polyphenol+oxidase+from+aphid+saliva.">Activation of defense mechanism in wheat by polyphenol oxidase from aphid saliva.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 58 (4), 2410-2418 (2010).</li><li>Zheng, L., Seon, Y. J., McHugh, J., Papagerakis, S., Papagerakis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clock+genes+show+circadian+rhythms+in+salivary+glands.">Clock genes show circadian rhythms in salivary glands.</a> Journal of Dental Research. 91 (8), 783-788 (2012).</li><li>Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+transcriptomic/proteomic+analysis+of+salivary+gland+and+secreted+saliva+in+three+planthopper+species.">Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species.</a> Journal of Proteomics. 172, 25-35 (2018).</li><li>Huang, H. J., Liu, C. W., Xu, H. J., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucin-like+protein,+a+saliva+component+involved+in+brown+planthopper+virulence+and+host+adaptation.">Mucin-like protein, a saliva component involved in brown planthopper virulence and host adaptation.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 223-230 (2017).</li><li>Shangguan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mucin-like+protein+of+planthopper+is+required+for+feeding+and+induces+immunity+response+in+plants.">A mucin-like protein of planthopper is required for feeding and induces immunity response in plants.</a> Plant Physiology. 176 (1), 552-565 (2018).</li><li>Petrova, A., Smith, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodetection+of+a+brown+planthopper+(Nilaparvata+lugens+St&#229;l)+salivary+catalase-like+protein+into+tissues+of+rice,+Oryza+sativa.">Immunodetection of a brown planthopper (Nilaparvata lugens St&#229;l) salivary catalase-like protein into tissues of rice, Oryza sativa.</a> Insect Molecular Biology. 23 (1), 13-25 (2014).</li><li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+small+brown+planthopper,+Laodelphax+striatellus.">Genome sequence of the small brown planthopper, Laodelphax striatellus.</a> GigaScience. 6 (12), 1-12 (2017).</li><li>Van Bel, A. J., Will, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+evaluation+of+proteins+in+watery+and+gel+saliva+of+aphids.">Functional evaluation of proteins in watery and gel saliva of aphids.</a> Frontiers In Plant Science. 7, 1840 (2016).</li><li>Perez-Vilar, J., Hill, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+assembly+of+secreted+mucins.">The structure and assembly of secreted mucins.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (45), 31751-31754 (1999).</li><li>Pitino, M., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aphid+protein+effectors+promote+aphid+colonization+in+a+plant+species-specific+manner.">Aphid protein effectors promote aphid colonization in a plant species-specific manner.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 26 (1), 130-139 (2013).</li><li>Zhang, F., Zhu, L., He, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+expression+in+response+to+brown+planthopper+feeding+in+rice.">Differential gene expression in response to brown planthopper feeding in rice.</a> Journal of Plant Physiology. 161 (1), 53-62 (2004).</li><li>Hogenhout, S. A., Ammar, E. -. D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses.">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li><li>Boissot, N., Schoeny, A., Vanlerberghe-Masutti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vat,+an+amazing+gene+conferring+resistance+to+aphids+and+viruses+they+carry:+from+molecular+structure+to+field+effects.">Vat, an amazing gene conferring resistance to aphids and viruses they carry: from molecular structure to field effects.</a> Frontiers In Plant Science. 7, 1420 (2016).</li></ol>

Succesvolle kweek van insecten op kunstmatige diëten werd voor het eerst gemeld in 1962 toen Mittler en Dadd de Paraffine-membraantechniek beschreven om een kunstmatig dieet te houden29,30. En deze methode is onderzocht in vele aspecten van insectenbiologie en -gedrag, bijvoorbeeld voedingssupplement, dsRNA-voeding en virusacquisitie. Op basis van de vereisten van speekselanalyse wordt 5% sucrose gebruikt als het algemene kunstmatige dieet om speeksel van SBPH i...

Rijststreepvirus (RSV), een negatief gestrand RNA-virus in het geslacht Tenuivirus, veroorzaakt ernstige ziekten in de rijstproductie in Oost-Azië1,2,3. Overdracht van RSV van geïnfecteerde rijstplanten naar gezonde is afhankelijk van insectenvectoren, voornamelijk Laodelphax striatellus, die RSV op een persistent-propagatieve manier overbrengt. SBPH verwerft het virus na het voeden met RSV-geïnfecteerde planten. Eenmaal in het insect infecteert RSV de midgut-epitheelcel een dag na het voeden en gaat vervolgens door de midgutbarrière om de hemolymfe te penetreren. Vervolgens verspreidt RSV zich via de hemolymfe in verschillende weefsels en plant zich vervolgens voort. Na een latente periode van ongeveer 10-14 dagen na de verwerving kan het virus in de speekselklier via het uitgescheiden speeksel worden overgedragen op de gezonde waardplanten, terwijl SBPH sap uit het floëemzuigt 4,5,6,7,8,9,10 . Een efficiënt voedingsproces en verschillende factoren in het speeksel zijn essentieel voor de verspreiding van RSV van het insect naar de waardplant.
Insectenspeeksel dat wordt uitgescheiden door speekselklieren wordt verondersteld insecten, virussen en waardplanten te bemiddelen. Hemipteran insecten produceren meestal twee soorten speeksel: geleer speeksel en waterig speeksel11,12,13. Geleerspeeksel wordt voornamelijk uitgescheiden in het apoplasma om de beweging van de stylet tussen gastheercellen te ondersteunen en is ook gerelateerd aan het overwinnen van plantresistentie en immuunresponsen14,15,16,17. In het tasterige stadium van het voeden scheiden insecten met tussenpozen geleerspeeksel af dat onmiddellijk wordt geoxideerd om een oppervlakteflens te vormen. Vervolgens omhullen enkele of vertakte omhulsels de stylet om een buisvormig kanaal18,19,20te reserveren. De oppervlakteflens op de opperhuid wordt verondersteld de penetratie van de stylet te vergemakkelijken door als ankerpunt te dienen, terwijl de mantels rond de stylet mechanische stabiliteit en smering kunnen bieden16,21,22,23. Nlshp werd geïdentificeerd als een essentieel eiwit voor speekselschedevorming en succesvolle voeding van bruine planthopper(Nilaparvata lugens, BPH). Remming van de expressie van het structurele schede-eiwit (SHP) dat wordt uitgescheiden door de bladluis Acyrthosiphon pisum verminderde de reproductie door het voeden van gastheerzeefbuizen te verstoren24. Bovendien wordt bij sommige insectensoorten verondersteld dat gelspeekselfactoren immuunresponsen van planten veroorzaken door zogenaamde herbivore-geassocieerde moleculaire patronen (HAMPs) te vormen. In N. lugensinduceert NlMLP, een mucine-achtig eiwit gerelateerd aan schedevorming, de afweer van planten tegen voeding, waaronder celdood, de expressie van verdedigingsgerelateerde genen en callose-afzetting 25,26. Ook is bewezen dat sommige gelspeekselfactoren bij bladluizen afweerreacties van planten veroorzaken via gen-naar-gen interacties vergelijkbaar met pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen12,15,27.
Voor het bestuderen van de speekselfactoren die essentieel zijn voor insectenvoeding en / of pathogene overdracht, is het noodzakelijk om uitgescheiden speeksel te analyseren. Hier worden kunstmatige voedings- en verzamelmethoden beschreven om voldoende hoeveelheden speeksel te verkrijgen voor verdere analyse. Met behulp van een medium dat slechts één voedingselement bevatte, werden veel speekseleiwitten verzameld en geanalyseerd door zilverkleuring en western blotting. Deze methode zal nuttig zijn bij verder onderzoek naar factoren in speeksel die essentieel zijn voor RSV-overdracht door SBPH.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10-KD centrifugal filter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>R5PA83496</td>
			<td>For concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Protein Transfer Buffer(wet)</td>
			<td>macGENE</td>
			<td>MP008</td>
			<td>Transfer buffer for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x TBST buffer</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>SL1328-500mL&#215;10</td>
			<td>Wash buffer for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azure c600 biosystems</td>
			<td>Azure Biosystems</td>
			<td>Azure c600</td>
			<td>Imaging system for western blotting and silver staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Color Prestained protein ladder</td>
			<td>GenStar</td>
			<td>M221-01</td>
			<td>Protein marker for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL&#160;western blotting detection reagents</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN2209</td>
			<td>Western blotting detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enchanced HRP-DAB Chromogenic Kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>#PA110</td>
			<td>Chromogenic reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>401393-2ML</td>
			<td>Polyclonal secondary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon(R)-P Polyvinylidene difluoride membrane</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Transfer membrane for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1725125</td>
			<td>For quantitative real-time PCR (qRT-PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHES</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708891</td>
			<td>For Reverse-transcriptional PCR (RT-PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Filter, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td>For filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAB TGX Gels</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561043</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONEC-W</td>
			<td>Detection of protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon membrane</td>
			<td>PALL</td>
			<td>T42754</td>
			<td>Membrane for dot-ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M Membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>Making artifical diet sandwichs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-LssgMP polyclonal antibody against LssgMP peptides</td>
			<td>Genstript</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit primary anti-LssgMP polyclonal antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-RSV polyclonal antibody</td>
			<td>Genstript</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit primary anti-RSV polyclonal antibody for western blotting and dot-ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAprep pure Micro Kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>DP420</td>
			<td>For RNA Extraction</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-layered membrane sandwich method for laodelphax striatellus saliva collection

Rijststreepvirus (RSV), dat een aanzienlijk economisch verlies van landbouw in Oost-Azië veroorzaakt, is volledig afhankelijk van insectenvectoren voor zijn effectieve overdracht onder gastheerrijst. Laodelphax striatellus (kleine bruine planthopper, SBPH) is de primaire insectenvector die RSV horizontaal doorgeeft terwijl sap uit het floëem wordt gezogen. Speeksel speelt een belangrijke rol in het voedingsgedrag van insecten. Een handige methode die nuttig zal zijn voor onderzoek naar het speeksel van insecten met piercing-zuigend voedingsgedrag wordt hier beschreven. Bij deze methode mochten insecten zich voeden met een kunstmatig dieet ingeklemd tussen twee uitgerekte paraffinefilmlagen. Het dieet met het speeksel werd elke dag verzameld, gefilterd en geconcentreerd voor verdere analyse. Ten slotte werd de kwaliteit van het verzamelde speeksel onderzocht door eiwitkleuring en immunoblotting. Deze methode werd geïllustreerd door de aanwezigheid van RSV en een mucine-achtig eiwit in het speeksel van SBPH te detecteren. Deze kunstmatige voedings- en speekselverzamelingsmethode zal een basis leggen voor verder onderzoek naar factoren in insectenspeeksel gerelateerd aan voedingsgedrag en virusoverdracht.

Schema's van kunstmatige voedingsinstallatie en speekselverzameling Figuur 1A toont de glazen cilinder (15 cm x 2,5 cm) die wordt gebruikt als voedingskamer om het speeksel op te vangen. Ten eerste werden de SBPH-larven enkele uren uitgehongerd om de verzamelefficiëntie te verbeteren en vervolgens geïmmobiliseerd door gedurende 5 minuten te koelen. Nadat de insecten in de glazen cilinder waren overgebracht, werden beide open uiteinden van de kamer bedekt met uitgerekt p...

Watch this Scientific Journal Video about Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection at JoVE.com

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

Het huidige protocol beschrijft een methode om voldoende speeksel van priemzuigende insecten te verzamelen met behulp van een kunstmatig medium. Dit is een handige methode voor het verzamelen van insectenspeeksel en het bestuderen van speekselfunctie op insectenvoedingsgedrag en vectoroverdraagbare virusoverdracht.

Tweelaagse membraansandwichmethode voor Laodelphax striatellus Speekselcollectie

Rice stripe virus (RSV), which causes significant economic loss of agriculture in East Asia, entirely depends on insect vectors for its effective ...

Kunstmatige voeding en speekselverzameling bieden een directe methode voor het detecteren van effectoren in insectenspeeksel. Dit is echter nog niet eerder in detail beschreven. Dit protocol is effectief voor speekselverzameling van saprofytische insecten.Bovendien is het een eenvoudige techniek, omdat we medium gebruiken dat alleen sucrose bevat als een kunstmatig dieet. Het speeksel van saprofytische insecten kan van invloed zijn op het immuunsysteem van de gastheer om het voedingsgedrag te bevorderen en ziekteverwekkers over te brengen. Dit geneesmiddel dat kan worden gebruikt voor insectengedrag en het onderzoek naar insectenbottenpaden.Dit is een eenvoudige methode om uit te voeren. Dit suggereert echter de opbouw van een schone experimentele omgeving omdat speeksel wordt verzameld voor verder onderzoek. Begin met het bereiden van een 5% sucrose-oplossing voor het kunstmatige dieet en filter de oplossing door een filter van 0,22 micron om bacteriële besmetting en onzuiverheden te verwijderen.Honger ongeveer 200 kleine bruine plantentrechterlarven drie tot vijf uur uit voordat ze in een voedingskamer worden geïntroduceerd. Om vervolgens de glazen cilinders als voedingskamers voor te bereiden, bedek u het ene open uiteinde van de kamer met een paraffinemembraan voordat u de experimentele insecten introduceert, breng vervolgens de insecten over in de glazen cilinder en bedek het andere uiteinde van de kamer met uitgerekt paraffinemembraan. Voeg 200 microliter kunstmatig dieet toe aan het membraan en bedek de vloeistof met een andere laag uitgerekt paraffinemembraan.Bedek ten slotte de kamer met aluminiumfolie en laat het uiteinde met het kunstmatige dieetapparaat blootgesteld aan het licht. Verzamel na 24 uur het SBPH-speeksel door de cilinder op vier graden Celsius te koelen om de insecten te immobiliseren, ontdek vervolgens de buitenste film en verzamel het kunstmatige dieet in steriele buisjes van 1,5 milliliter met behulp van een steriele pipet. Houd het verzamelde speeksel op min 80 graden Celsius tot de analyse.Spoel vervolgens het binnenmembraan drie keer met 50 microliter vers kunstmatig dieet door zacht te pipetteren en verzamel het kunstmatige wasdieet in steriele buisjes van 1,5 milliliter. Voeg na de drie spoelingen vers kunstmatig dieet toe aan het binnenmembraan en plaats er een vers uitgerekt paraffinemembraan op. Filter ten slotte de verzamelde monsters door een filtereenheid van 0,22 micron om microben en andere verontreinigingen te verwijderen.Breng de collectieve speekselmonsters over in een centrifugaalfilter van 500 microliter en 10 kilodalton. Centrifugeer het monster. Verzamel het supernatant en breng het uiteindelijke volume op 100 microliter.Om de concentratie van het verzamelde speeksel te meten, schakelt u de UV-zichtbare spectrofotometer in en wast u de sokkels drie keer met dubbel gedestilleerd water. Selecteer de opties op het scherm in de volgende volgorde, eiwitten, eiwit A280. Selecteer het type en één absorptie-eenheid gelijk aan één milligram per milliliter.Vink vervolgens het vakje aan voor basislijncorrectie, 340 nanometer. Laad vervolgens twee microliter van 5% sucrose waterige oplossing als blanco en raak vervolgens Leeg aan de onderkant van het scherm aan. Ten slotte, na het instellen van de normen, laadt u twee microliter van het verzamelde speeksel en registreert u de eiwitconcentratie.Bij het voeden met 5% sucrose overleefde meer dan 80% van SBPH de eerste vier dagen. Vanaf de vijfde dag nam de sterfte echter snel toe tot 40% en op de zevende dag overleefde minder dan de helft van de SBPH. Een sds-pagina-analyse toonde aan dat de geconcentreerde speekselmonsters van RSV-geïnfecteerd SBPH-speeksel veel meer eiwitten bevatten dan de 5% sucrose-negatieve controle.In een Western blot analyse voor detectie van het RSV capsid eiwit, een niet-geïnfecteerde en virulifere insecten. Het RSV-capsid-eiwit werd met succes gedetecteerd in het virulifere monster, een antilichaam ontworpen tegen het LssgMP-genproduct detecteerde een eiwit van 78 kilodalton in niet-geïnfecteerde en virulifere monsters, wat aantoont dat LssgMP een speekseleiwit is. Een QRT PCR-analyse van LssgMP-transcriptniveaus in verschillende weefsels toonde aan dat de Lssg-transcriptniveaus in de speekselklier 20-voudig hoger waren dan in het hele lichaam en de darm, wat de specifieke expressie van LssgMP in de speekselklier bevestigde.Het uithongeren van de experimentele insecten voordat ze in de kamer worden geïntroduceerd, is noodzakelijk om de efficiëntie van onze speekselverzameling te waarborgen. Bovendien moet elke 24 uur een kunstmatig medium worden verzameld en uitgewisseld om microbiële besmetting in het verzamelde monster te verminderen. Deze techniek biedt een directe methode om de functie van speeksel bij het overbrengen van pathogenen te bestuderen.Bovendien kan het helpen bij het bestuderen van de interactie tussen insectenpathogenen.

Research

JoVE Journal

Biology

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Kristalliseren membraaneiwitten voor structuurbepaling met behulp van lipide mesofasen

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

High-throughput Kristallisatie van membraaneiwitten Met behulp van de lipidische Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

Bloedafname voor biochemische analyse bij volwassen zebravis

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Gebruik van een robot voor High-throughput Kristallisatie van membraaneiwitten in lipide mesofasen

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Oogst en Cryo-koeling kristallen van membraaneiwitten Grown in lipide mesofasen voor structuurbepaling door Macromoleculaire Kristallografie

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation

Een praktische en nieuwe methode om Genomic DNA Uittreksel uit Bloedafname Kits voor Plasma Protein Preservation

Laboratory tests can be done on the cellular or  fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes  determines the portion of the ...

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Verzameling en analyse van<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Bastweefsel wondvocht De EDTA-methode vergemakkelijkt

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Microperfusion techniek te onderzoeken verordening van microvessel permeabiliteit in Rat Mesenterium

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish

Herhaalde bloedafname voor Blood Tests in Adult zebravis

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Super resolutie beeldvorming van de uitputting van de grondtoestand in zoogdiercellen

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...