Name: two-layered membrane sandwich method for laodelphax striatellus saliva collection
Uploaded: 2021-08-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par le National Key Research and Development Program of China (n° 2019YFC1200503), par la National Science Foundation of China (n° 32072385) et par la Youth Innovation Promotion Association CAS (2021084).

1. Maintenance sbph
<ol><li>Élever les individus SBPH virulifères et sans VRS dans un incubateur en verre (65 x 200 mm) avec 5-6 plants de riz(Oryza sativa cv. Nipponbare) par chambre en verre dans le laboratoire. Cultivez les plants de riz à 25 °C sous une photopériode de 16 h de lumière / 8 h d’obscurité. NOTE: Les individus SBPH virulifères et exempts de VRS ont été initialement capturés dans la province du Jiangsu, en Chine.</li>
	<li>Détecter le VRS dans l’HBSP par un dosage immuno-enzy...

<ol>
	<li>Cheng, X., Zhu, L., He, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+understanding+of+molecular+interactions+between+rice+and+the+brown+planthopper.">Towards understanding of molecular interactions between rice and the brown planthopper.</a> Molecular Plant. 6 (3), 621-634 (2013).</li><li>Cho, W. K., Lian, S., Kim, S. M., Park, S. H., Kim, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+insights+into+research+on+Rice+Stripe+Virus.">Current insights into research on Rice Stripe Virus.</a> The Plant Pathology Journal. 29 (3), 223-233 (2013).</li><li>He, M., Guan, S. Y., He, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+rice+stripe+virus.">Evolution of rice stripe virus.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 109, 343-350 (2017).</li><li>Wu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonstructural+protein+NS4+of+Rice+Stripe+Virus+plays+a+critical+role+in+viral+spread+in+the+body+of+vector+insects.">Nonstructural protein NS4 of Rice Stripe Virus plays a critical role in viral spread in the body of vector insects.</a> PLoS One. 9 (2), 88636 (2014).</li><li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transovarial+transmission+of+a+plant+virus+is+mediated+by+vitellogenin+of+its+insect+vector.">Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector.</a> PLoS Pathogens. 10 (3), 1003949 (2014).</li><li>Taning, C. N., Andrade, E. C., Hunter, W. B., Christiaens, O., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asian+citrus+psyllid+RNAi+pathway-RNAi+evidence.">Asian citrus psyllid RNAi pathway-RNAi evidence.</a> Scientific Reports. 6, 38082 (2016).</li><li>Garbutt, J. S., Bell&#233;s, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+double-stranded+RNA+in+insect+hemolymph+as+a+potential+determiner+of+RNA+interference+success:+evidence+from+Manduca+sexta+and+Blattella+germanica.">Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: evidence from Manduca sexta and Blattella germanica.</a> Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).</li><li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+feeding+Rice+Stripe+Virus+enables+efficient+virus+infection+of+Laodelphax+striatellus.">Artificial feeding Rice Stripe Virus enables efficient virus infection of Laodelphax striatellus.</a> Journal of Virological Methods. 235, 139-143 (2016).</li><li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+tissue-specific+vitellogenin+facilitates+transmission+of+plant+virus.">Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus.</a> PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).</li><li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+Stripe+Virus+hitchhikes+the+vector+insect+vitellogenin+ligand-receptor+pathway+for+ovary+entry.">Rice Stripe Virus hitchhikes the vector insect vitellogenin ligand-receptor pathway for ovary entry.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374, 20180312 (2019).</li><li>Bao, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+intestine-specific+transcriptome+of+the+brown+planthopper+Nilaparvata+lugens+revealed+potential+functions+in+digestion,+detoxification+and+immune+response.">De novo intestine-specific transcriptome of the brown planthopper Nilaparvata lugens revealed potential functions in digestion, detoxification and immune response.</a> Genomics. 99 (4), 256-264 (2012).</li><li>Elzinga, D. A., Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+protein+effectors+in+plant-aphid+interactions.">The role of protein effectors in plant-aphid interactions.</a> Current Opinion In Plant Biology. 16 (4), 451-456 (2013).</li><li>Chung, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbivore+exploits+orally+secreted+bacteria+to+suppress+plant+defenses.">Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15728-15733 (2013).</li><li>Bos, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+genomics+approach+identifies+candidate+effectors+from+the+aphid+species+Myzus+persicae+(green+peach+aphid).">A functional genomics approach identifies candidate effectors from the aphid species Myzus persicae (green peach aphid).</a> PLoS Genetics. 6 (11), 1001216 (2010).</li><li>Liu, X., Zhou, H., Zhao, J., Hua, H., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+secreted+watery+saliva+proteins+of+the+rice+brown+planthopper,+Nilaparvata+lugens+(St&#229;l)+by+transcriptome+and+Shotgun+LC-MS/MS+approach.">Identification of the secreted watery saliva proteins of the rice brown planthopper, Nilaparvata lugens (St&#229;l) by transcriptome and Shotgun LC-MS/MS approach.</a> Journal of Insect Physiology. 89, 60-69 (2016).</li><li>Cao, T. T., L&#252;, J., Lou, Y. G., Cheng, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding-induced+interactions+between+two+rice+planthoppers,+Nilaparvata+lugens+and+Sogatella+furcifera+(Hemiptera:+Delphacidae):+effects+on+feeding+and+honeydew+excretion.">Feeding-induced interactions between two rice planthoppers, Nilaparvata lugens and Sogatella furcifera (Hemiptera: Delphacidae): effects on feeding and honeydew excretion.</a> Environmental Entomology. 42 (6), 1281-1291 (2013).</li><li>De Vos, M., Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myzus+persicae+(green+peach+aphid)+salivary+components+induce+defence+responses+in+Arabidopsis+thaliana.">Myzus persicae (green peach aphid) salivary components induce defence responses in Arabidopsis thaliana.</a> Plant, Cell &amp; Environment. 32 (11), 1548-1560 (2009).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+immune+system+architecture+and+transcriptome+responses+to+southern+rice+black-streaked+dwarf+virus+in+Sogatella+furcifera.">Understanding the immune system architecture and transcriptome responses to southern rice black-streaked dwarf virus in Sogatella furcifera.</a> Scientific Reports. 6, 36254 (2016).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetration+into+rice+tissues+by+brown+planthopper+and+fine+structure+of+the+salivary+sheaths.">Penetration into rice tissues by brown planthopper and fine structure of the salivary sheaths.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 129 (3), 295-307 (2008).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Armet+is+an+effector+protein+mediating+aphid-plant+interactions.">Armet is an effector protein mediating aphid-plant interactions.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 29 (5), 2032-2045 (2015).</li><li>Chaudhary, R., Atamian, H. S., Shen, Z., Briggs, S. P., Kaloshian, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GroEL+from+the+endosymbiont+Buchnera+aphidicola+betrays+the+aphid+by+triggering+plant+defense.">GroEL from the endosymbiont Buchnera aphidicola betrays the aphid by triggering plant defense.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 8919-8924 (2014).</li><li>Ma, R., Chen, J. L., Cheng, D. F., Sun, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+defense+mechanism+in+wheat+by+polyphenol+oxidase+from+aphid+saliva.">Activation of defense mechanism in wheat by polyphenol oxidase from aphid saliva.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 58 (4), 2410-2418 (2010).</li><li>Zheng, L., Seon, Y. J., McHugh, J., Papagerakis, S., Papagerakis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clock+genes+show+circadian+rhythms+in+salivary+glands.">Clock genes show circadian rhythms in salivary glands.</a> Journal of Dental Research. 91 (8), 783-788 (2012).</li><li>Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+transcriptomic/proteomic+analysis+of+salivary+gland+and+secreted+saliva+in+three+planthopper+species.">Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species.</a> Journal of Proteomics. 172, 25-35 (2018).</li><li>Huang, H. J., Liu, C. W., Xu, H. J., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucin-like+protein,+a+saliva+component+involved+in+brown+planthopper+virulence+and+host+adaptation.">Mucin-like protein, a saliva component involved in brown planthopper virulence and host adaptation.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 223-230 (2017).</li><li>Shangguan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mucin-like+protein+of+planthopper+is+required+for+feeding+and+induces+immunity+response+in+plants.">A mucin-like protein of planthopper is required for feeding and induces immunity response in plants.</a> Plant Physiology. 176 (1), 552-565 (2018).</li><li>Petrova, A., Smith, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodetection+of+a+brown+planthopper+(Nilaparvata+lugens+St&#229;l)+salivary+catalase-like+protein+into+tissues+of+rice,+Oryza+sativa.">Immunodetection of a brown planthopper (Nilaparvata lugens St&#229;l) salivary catalase-like protein into tissues of rice, Oryza sativa.</a> Insect Molecular Biology. 23 (1), 13-25 (2014).</li><li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+small+brown+planthopper,+Laodelphax+striatellus.">Genome sequence of the small brown planthopper, Laodelphax striatellus.</a> GigaScience. 6 (12), 1-12 (2017).</li><li>Van Bel, A. J., Will, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+evaluation+of+proteins+in+watery+and+gel+saliva+of+aphids.">Functional evaluation of proteins in watery and gel saliva of aphids.</a> Frontiers In Plant Science. 7, 1840 (2016).</li><li>Perez-Vilar, J., Hill, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+assembly+of+secreted+mucins.">The structure and assembly of secreted mucins.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (45), 31751-31754 (1999).</li><li>Pitino, M., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aphid+protein+effectors+promote+aphid+colonization+in+a+plant+species-specific+manner.">Aphid protein effectors promote aphid colonization in a plant species-specific manner.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 26 (1), 130-139 (2013).</li><li>Zhang, F., Zhu, L., He, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+expression+in+response+to+brown+planthopper+feeding+in+rice.">Differential gene expression in response to brown planthopper feeding in rice.</a> Journal of Plant Physiology. 161 (1), 53-62 (2004).</li><li>Hogenhout, S. A., Ammar, E. -. D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses.">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li><li>Boissot, N., Schoeny, A., Vanlerberghe-Masutti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vat,+an+amazing+gene+conferring+resistance+to+aphids+and+viruses+they+carry:+from+molecular+structure+to+field+effects.">Vat, an amazing gene conferring resistance to aphids and viruses they carry: from molecular structure to field effects.</a> Frontiers In Plant Science. 7, 1420 (2016).</li></ol>

L’élevage réussi d’insectes sur des régimes artificiels a été signalé pour la première fois en 1962 lorsque Mittler et Dadd ont décrit la technique de la membrane de paraffine pour tenir un régime artificiel29,30. Et cette méthode a été explorée dans de nombreux aspects de la biologie et du comportement des insectes, par exemple, le supplément nutritif, l’alimentation en ARNd et l’acquisition de virus. Sur la base des exigences de l’analys...

Le virus de la bande de riz (VRS), un virus à ARN à brin négatif du genre Tenuivirus,provoque des maladies graves dans la production de riz en Asie del’Est1,2,3. La transmission du VRS des plants de riz infectés aux plants sains dépend des insectes vecteurs, principalement Laodelphax striatellus, qui transmet le VRS de manière persistante. SBPH acquiert le virus après s’être nourri de plantes infectées par le VRS. Une fois à l’intérieur de l’insecte, le VRS infecte la cellule épithéliale de l’intestin moyen un jour après l’alimentation, puis traverse la barrière de l’intestin moyen pour pénétrer dans l’hémolymphe. Par la suite, le VRS se propage dans différents tissus via l’hémolymphe, puis se propage. Après une période de latence d’environ 10 à 14 jours après l’acquisition, le virus à l’intérieur de la glande salivaire peut être transmis aux plantes hôtes saines via la salive sécrétée tandis que SBPH aspire la sève du phloème4,5,6,7,8,9,10 . Un processus d’alimentation efficace et divers facteurs dans la salive sont essentiels pour la propagation du VRS de l’insecte à la plante hôte.
On pense que la salive d’insecte sécrétée par les glandes salivaires sert de médiateur aux insectes, aux virus et aux plantes hôtes. Les insectes hémiptères produisent généralement deux types de salive: la salive gélifiante et la saliveaqueuse 11,12,13. La salive gélifiante est principalement sécrétée dans l’apoplasme pour soutenir le mouvement du stylet entre les cellules hôtes et est également liée au dépassement de la résistance des plantes et des réponses immunitaires14,15,16,17. Au stade de l’alimentation, les insectes sécrètent par intermittence de la salive gélifiante qui s’oxyde immédiatement pour former une bride de surface. Ensuite, des gaines simples ou ramifiées enveloppent le stylet pour réserver un canal tubulaire18,19,20. La bride de surface sur l’épiderme est supposée faciliter la pénétration du stylet en servant de point d’ancrage, tandis que les gaines autour du stylet peuvent assurer la stabilité mécanique et la lubrification16,21,22,23. Nlshp a été identifié comme une protéine essentielle pour la formation de la gaine salivaire et l’alimentation réussie de la sauterelle brune (Nilaparvata lugens, BPH). L’inhibition de l’expression de la protéine de gaine structurelle (SHP) sécrétée par le puceron Acyrthosiphon pisum a réduit sa reproduction en perturbant l’alimentation à partir des tubes du tamis hôte24. De plus, chez certaines espèces d’insectes, les facteurs de salive en gel sont censés déclencher les réponses immunitaires des plantes en formant des modèles moléculaires dits associés aux herbivores (HAMPs). Chez N. lugens,NlMLP, une protéine semblable à la mucine liée à la formation de gaines, induit des défenses végétales contre l’alimentation, y compris la mort cellulaire, l’expression de gènes liés à la défense et le dépôt de callose 25,26. En outre, il a été prouvé que certains facteurs de salive en gel chez les pucerons déclenchent des réponses de défense des plantes via des interactions gène-à-gène similaires aux modèles moléculaires associés aux agents pathogènes12,15,27.
Pour étudier les facteurs salivaires essentiels à l’alimentation des insectes et / ou à la transmission des agents pathogènes, il est nécessaire d’analyser la salive sécrétée. Ici, les méthodes d’alimentation artificielle et de collecte pour obtenir des quantités suffisantes de salive sont décrites pour une analyse plus approfondie. En utilisant un milieu ne contenant qu’un seul élément nutritionnel, de nombreuses protéines salivaires ont été collectées et analysées par coloration à l’argent et western blotting. Cette méthode sera utile dans d’autres recherches sur les facteurs de la salive qui sont essentiels à la transmission du VRS par SBPH.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10-KD centrifugal filter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>R5PA83496</td>
			<td>For concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Protein Transfer Buffer(wet)</td>
			<td>macGENE</td>
			<td>MP008</td>
			<td>Transfer buffer for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x TBST buffer</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>SL1328-500mL&#215;10</td>
			<td>Wash buffer for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azure c600 biosystems</td>
			<td>Azure Biosystems</td>
			<td>Azure c600</td>
			<td>Imaging system for western blotting and silver staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Color Prestained protein ladder</td>
			<td>GenStar</td>
			<td>M221-01</td>
			<td>Protein marker for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL&#160;western blotting detection reagents</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN2209</td>
			<td>Western blotting detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enchanced HRP-DAB Chromogenic Kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>#PA110</td>
			<td>Chromogenic reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>401393-2ML</td>
			<td>Polyclonal secondary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon(R)-P Polyvinylidene difluoride membrane</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Transfer membrane for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1725125</td>
			<td>For quantitative real-time PCR (qRT-PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHES</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708891</td>
			<td>For Reverse-transcriptional PCR (RT-PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Filter, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td>For filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAB TGX Gels</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561043</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONEC-W</td>
			<td>Detection of protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon membrane</td>
			<td>PALL</td>
			<td>T42754</td>
			<td>Membrane for dot-ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M Membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>Making artifical diet sandwichs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-LssgMP polyclonal antibody against LssgMP peptides</td>
			<td>Genstript</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit primary anti-LssgMP polyclonal antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-RSV polyclonal antibody</td>
			<td>Genstript</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit primary anti-RSV polyclonal antibody for western blotting and dot-ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAprep pure Micro Kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>DP420</td>
			<td>For RNA Extraction</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-layered membrane sandwich method for laodelphax striatellus saliva collection

Le virus de la bande de riz (VRS), qui cause une perte économique importante de l’agriculture en Asie de l’Est, dépend entièrement des insectes vecteurs pour sa transmission efficace entre le riz hôte. Laodelphax striatellus (petite sauterelle brune, SBPH) est le principal insecte vecteur qui transmet horizontalement le VRS tout en aspirant la sève du phloème. La salive joue un rôle important dans le comportement alimentaire des insectes. Une méthode pratique qui sera utile pour la recherche sur la salive des insectes avec un comportement alimentaire perçant-suceur est décrite ici. Dans cette méthode, les insectes ont été autorisés à se nourrir d’un régime artificiel pris en sandwich entre deux couches de film de paraffine étirées. Le régime alimentaire contenant la salive a été recueilli chaque jour, filtré et concentré pour une analyse plus approfondie. Enfin, la qualité de la salive recueillie a été examinée par coloration protéique et immunobuvardage. Cette méthode a été illustrée par la détection de la présence du VRS et d’une protéine semblable à la mucine dans la salive de l’HBS. Ces méthodes d’alimentation artificielle et de collecte de la salive jetteront les bases de recherches supplémentaires sur les facteurs de la salive des insectes liés au comportement alimentaire et à la transmission du virus.

Schémas de l’installation d’alimentation artificielle et de la collecte de salive La figure 1A représente le cylindre de verre (15 cm x 2,5 cm) utilisé comme chambre d’alimentation pour recueillir la salive. Tout d’abord, les larves de SBPH ont été affamées pendant plusieurs heures pour améliorer l’efficacité de la collecte, puis immobilisées en refroidissant pendant 5 minutes. Après le transfert des insectes dans le cylindre de verre, les deux extrém...

Watch this Scientific Journal Video about Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection at JoVE.com

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

Le présent protocole décrit une méthode permettant de recueillir suffisamment de salive auprès d’insectes perçants-suceurs à l’aide d’un milieu artificiel. Il s’agit d’une méthode pratique pour collecter la salive des insectes et étudier la fonction salivaire sur le comportement alimentaire des insectes et la transmission du virus à transmission vectorielle.

Méthode sandwich à membrane à deux couches pour la collection de salive Laodelphax striatellus

Rice stripe virus (RSV), which causes significant economic loss of agriculture in East Asia, entirely depends on insect vectors for its effective ...

L’alimentation artificielle et la collecte de salive fournissent une méthode directe pour détecter les effecteurs dans la salive des insectes. Cependant, cela n’a pas été décrit en détail auparavant. Ce protocole est efficace pour la collecte de la salive des insectes saprophytes.De plus, c’est une technique simple, car nous utilisons un milieu contenant uniquement du saccharose comme régime artificiel. La salive des insectes saprophytes peut affecter le système immunitaire de l’hôte pour améliorer le comportement alimentaire et transmettre des agents pathogènes. Ce médicament qui peut être utilisé pour le comportement des insectes et la recherche sur la voie osseuse des insectes.C’est une méthode simple à effectuer. Cependant, cela suggère la mise en place d’un environnement expérimental propre car la salive est collectée pour d’autres recherches. Commencez par préparer une solution de saccharose à 5% pour l’alimentation artificielle et filtrez la solution à travers un filtre de 0,22 micron pour éliminer la contamination bactérienne et les impuretés.Affamer environ 200 petites larves de larves de plantes brunes pendant trois à cinq heures avant de les introduire dans une chambre d’alimentation. Ensuite, pour préparer les cylindres de verre en tant que chambres d’alimentation, couvrez une extrémité ouverte de la chambre avec une membrane de paraffine avant d’introduire les insectes expérimentaux, puis transférez les insectes dans le cylindre de verre et recouvrez l’autre extrémité de la chambre avec une membrane de paraffine tendue. Ajouter 200 microlitres de régime artificiel sur la membrane, puis couvrir le liquide avec une autre couche de membrane de paraffine étirée.Enfin, couvrez la chambre avec du papier d’aluminium, en laissant l’extrémité avec l’appareil de régime artificiel exposé à la lumière. Après 24 heures, recueillir la salive SBPH en refroidissant le cylindre à quatre degrés Celsius pour immobiliser les insectes, puis découvrir le film extérieur et recueillir le régime artificiel dans des tubes stériles de 1,5 millilitre à l’aide d’une pipette stérile. Conservez la salive recueillie à moins 80 degrés Celsius jusqu’à l’analyse.Ensuite, rincez la membrane interne avec 50 microlitres de régime artificiel frais trois fois en pipetant doucement et collectez le régime de lavage artificiel dans des tubes stériles de 1,5 millilitre. Après les trois rinçages, ajoutez un régime artificiel frais sur la membrane interne et placez une membrane de paraffine fraîchement étirée sur le dessus. Enfin, filtrez les échantillons prélevés à travers une unité de filtration de 0,22 micron pour éliminer les microbes et autres contaminants.Transférer les échantillons collectifs de salive dans un filtre centrifuge de 500 microlitres et 10 kilodaltons. Centrifuger l’échantillon. Collectez le surnageant et portez le volume final à 100 microlitres.Pour mesurer la concentration de la salive collectée, allumez le spectrophotomètre UV visible et lavez les piédestaux trois fois avec de l’eau doublement distillée. Sélectionnez les options à l’écran dans l’ordre suivant, protéines, protéine A280. Sélectionnez le type et une unité d’absorbance égale à un milligramme par millilitre.Cochez ensuite la case de correction de base, 340 nanomètres. Ensuite, chargez deux microlitres de solution aqueuse de saccharose à 5% à blanc, puis appuyez sur Blank en bas de l’écran. Enfin, après avoir établi les normes, chargez deux microlitres de la salive collectée et enregistrez la concentration en protéines.En se nourrissant de 5% de saccharose, plus de 80% de SBPH ont survécu pendant les quatre premiers jours. Cependant, à partir du cinquième jour, la mortalité a augmenté rapidement à 40% et le septième jour, moins de la moitié du SBPH a survécu. Une analyse de page SDS a montré que les échantillons de salive concentrés de salive SBPH infectée par le VRS contenaient beaucoup plus de protéines que le témoin négatif à 5% de saccharose.Dans une analyse par transfert western pour la détection de la protéine de la capside du VRS, un insecte non infecté et virulifère. La protéine de la capside du VRS a été détectée avec succès dans l’échantillon virulifère, un anticorps conçu contre le produit du gène LssgMP a détecté une protéine de 78 kilodaltons dans des échantillons non infectés et virulifères, démontrant que LssgMP est une protéine salivaire. Une analyse PAR PCR QRT des niveaux de transcription de LssgMP dans différents tissus a montré que les niveaux de transcription de Lssg dans la glande salivaire étaient 20 fois plus élevés que dans tout le corps et l’intestin, confirmant l’expression spécifique de LssgMP dans la glande salivaire.Affamer les insectes expérimentaux avant de les introduire dans la chambre est nécessaire pour assurer l’efficacité de notre collecte de salive. En outre, un milieu artificiel doit être collecté et échangé toutes les 24 heures pour réduire la contamination microbienne dans l’échantillon prélevé. Cette technique fournit une méthode directe pour étudier la fonction de la salive dans la transmission des agents pathogènes.En outre, il peut aider à étudier l’interaction de l’hôte pathogène des insectes.

Research

JoVE Journal

Biology

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Cristallisant protéines membranaires pour déterminer la structure à l&#39;aide mésophases lipidique

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Recherche

Biologie

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Haut débit cristallisation des protéines membranaires en utilisant la méthode lipidique Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

Collecte de sang pour analyse biochimique chez le poisson zèbre adulte

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Utilisation d&#39;un robot pour haut-débit cristallisation des protéines membranaires dans des mésophases lipidiques

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Cristaux de récolte et de Cryo-refroidissement de protéines membranaires cultivées dans des mésophases lipidiques pour la détermination de la structure par cristallographie macromoléculaire

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation

Une méthode pratique et roman d&#39;extraire l&#39;ADN génomique à partir de kits de prélèvement sanguin pour la préservation Plasma Protein

Laboratory tests can be done on the cellular or  fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes  determines the portion of the ...

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Collecte et analyse des<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Phloème exsudats Utilisation de la méthode EDTA-animé

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Microperfusion Technique chargé d&#39;enquêter sur le règlement des microvaisseaux perméabilité au Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish

Collecte de sang répétées pour des tests sanguins dans le poisson zèbre adulte

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

État fondamental l’appauvrissement Super-résolution imagerie dans les cellules de mammifères

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...