Name: two-layered membrane sandwich method for laodelphax striatellus saliva collection
Uploaded: 2021-08-27T13:00:00
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Diese Arbeit wurde vom National Key Research and Development Program of China (Nr. 2019YFC1200503), von der National Science Foundation of China (Nr. 32072385) und von der Youth Innovation Promotion Association CAS (2021084) unterstützt.

1. SBPH-Wartung
<ol><li>Aufzucht der viruliferen und RSV-freien SBPH-Individuen in einem Glasinkubator (65 x 200 mm) mit 5-6 Reissämlingen(Oryza sativa cv. Nipponbare) pro Glaskammer im Labor. Wachsen Sie die Reispflanzen bei 25 ° C unter einer 16 h hellen / 8 h dunklen Photoperiode. HINWEIS: Die viruliferen und RSV-freien SBPH-Individuen wurden ursprünglich in der Provinz Jiangsu, China, gefangen.</li>
	<li>Nachweis von RSV in SBPH durch dot-enzym-linked immunosorbent assay (dot-ELISA) mit einem Kaninch...

<ol>
	<li>Cheng, X., Zhu, L., He, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+understanding+of+molecular+interactions+between+rice+and+the+brown+planthopper.">Towards understanding of molecular interactions between rice and the brown planthopper.</a> Molecular Plant. 6 (3), 621-634 (2013).</li><li>Cho, W. K., Lian, S., Kim, S. M., Park, S. H., Kim, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+insights+into+research+on+Rice+Stripe+Virus.">Current insights into research on Rice Stripe Virus.</a> The Plant Pathology Journal. 29 (3), 223-233 (2013).</li><li>He, M., Guan, S. Y., He, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+rice+stripe+virus.">Evolution of rice stripe virus.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 109, 343-350 (2017).</li><li>Wu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonstructural+protein+NS4+of+Rice+Stripe+Virus+plays+a+critical+role+in+viral+spread+in+the+body+of+vector+insects.">Nonstructural protein NS4 of Rice Stripe Virus plays a critical role in viral spread in the body of vector insects.</a> PLoS One. 9 (2), 88636 (2014).</li><li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transovarial+transmission+of+a+plant+virus+is+mediated+by+vitellogenin+of+its+insect+vector.">Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector.</a> PLoS Pathogens. 10 (3), 1003949 (2014).</li><li>Taning, C. N., Andrade, E. C., Hunter, W. B., Christiaens, O., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asian+citrus+psyllid+RNAi+pathway-RNAi+evidence.">Asian citrus psyllid RNAi pathway-RNAi evidence.</a> Scientific Reports. 6, 38082 (2016).</li><li>Garbutt, J. S., Bell&#233;s, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+double-stranded+RNA+in+insect+hemolymph+as+a+potential+determiner+of+RNA+interference+success:+evidence+from+Manduca+sexta+and+Blattella+germanica.">Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: evidence from Manduca sexta and Blattella germanica.</a> Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).</li><li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+feeding+Rice+Stripe+Virus+enables+efficient+virus+infection+of+Laodelphax+striatellus.">Artificial feeding Rice Stripe Virus enables efficient virus infection of Laodelphax striatellus.</a> Journal of Virological Methods. 235, 139-143 (2016).</li><li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+tissue-specific+vitellogenin+facilitates+transmission+of+plant+virus.">Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus.</a> PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).</li><li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+Stripe+Virus+hitchhikes+the+vector+insect+vitellogenin+ligand-receptor+pathway+for+ovary+entry.">Rice Stripe Virus hitchhikes the vector insect vitellogenin ligand-receptor pathway for ovary entry.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374, 20180312 (2019).</li><li>Bao, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+intestine-specific+transcriptome+of+the+brown+planthopper+Nilaparvata+lugens+revealed+potential+functions+in+digestion,+detoxification+and+immune+response.">De novo intestine-specific transcriptome of the brown planthopper Nilaparvata lugens revealed potential functions in digestion, detoxification and immune response.</a> Genomics. 99 (4), 256-264 (2012).</li><li>Elzinga, D. A., Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+protein+effectors+in+plant-aphid+interactions.">The role of protein effectors in plant-aphid interactions.</a> Current Opinion In Plant Biology. 16 (4), 451-456 (2013).</li><li>Chung, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbivore+exploits+orally+secreted+bacteria+to+suppress+plant+defenses.">Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15728-15733 (2013).</li><li>Bos, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+genomics+approach+identifies+candidate+effectors+from+the+aphid+species+Myzus+persicae+(green+peach+aphid).">A functional genomics approach identifies candidate effectors from the aphid species Myzus persicae (green peach aphid).</a> PLoS Genetics. 6 (11), 1001216 (2010).</li><li>Liu, X., Zhou, H., Zhao, J., Hua, H., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+secreted+watery+saliva+proteins+of+the+rice+brown+planthopper,+Nilaparvata+lugens+(St&#229;l)+by+transcriptome+and+Shotgun+LC-MS/MS+approach.">Identification of the secreted watery saliva proteins of the rice brown planthopper, Nilaparvata lugens (St&#229;l) by transcriptome and Shotgun LC-MS/MS approach.</a> Journal of Insect Physiology. 89, 60-69 (2016).</li><li>Cao, T. T., L&#252;, J., Lou, Y. G., Cheng, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding-induced+interactions+between+two+rice+planthoppers,+Nilaparvata+lugens+and+Sogatella+furcifera+(Hemiptera:+Delphacidae):+effects+on+feeding+and+honeydew+excretion.">Feeding-induced interactions between two rice planthoppers, Nilaparvata lugens and Sogatella furcifera (Hemiptera: Delphacidae): effects on feeding and honeydew excretion.</a> Environmental Entomology. 42 (6), 1281-1291 (2013).</li><li>De Vos, M., Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myzus+persicae+(green+peach+aphid)+salivary+components+induce+defence+responses+in+Arabidopsis+thaliana.">Myzus persicae (green peach aphid) salivary components induce defence responses in Arabidopsis thaliana.</a> Plant, Cell &amp; Environment. 32 (11), 1548-1560 (2009).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+immune+system+architecture+and+transcriptome+responses+to+southern+rice+black-streaked+dwarf+virus+in+Sogatella+furcifera.">Understanding the immune system architecture and transcriptome responses to southern rice black-streaked dwarf virus in Sogatella furcifera.</a> Scientific Reports. 6, 36254 (2016).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetration+into+rice+tissues+by+brown+planthopper+and+fine+structure+of+the+salivary+sheaths.">Penetration into rice tissues by brown planthopper and fine structure of the salivary sheaths.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 129 (3), 295-307 (2008).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Armet+is+an+effector+protein+mediating+aphid-plant+interactions.">Armet is an effector protein mediating aphid-plant interactions.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 29 (5), 2032-2045 (2015).</li><li>Chaudhary, R., Atamian, H. S., Shen, Z., Briggs, S. P., Kaloshian, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GroEL+from+the+endosymbiont+Buchnera+aphidicola+betrays+the+aphid+by+triggering+plant+defense.">GroEL from the endosymbiont Buchnera aphidicola betrays the aphid by triggering plant defense.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 8919-8924 (2014).</li><li>Ma, R., Chen, J. L., Cheng, D. F., Sun, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+defense+mechanism+in+wheat+by+polyphenol+oxidase+from+aphid+saliva.">Activation of defense mechanism in wheat by polyphenol oxidase from aphid saliva.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 58 (4), 2410-2418 (2010).</li><li>Zheng, L., Seon, Y. J., McHugh, J., Papagerakis, S., Papagerakis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clock+genes+show+circadian+rhythms+in+salivary+glands.">Clock genes show circadian rhythms in salivary glands.</a> Journal of Dental Research. 91 (8), 783-788 (2012).</li><li>Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+transcriptomic/proteomic+analysis+of+salivary+gland+and+secreted+saliva+in+three+planthopper+species.">Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species.</a> Journal of Proteomics. 172, 25-35 (2018).</li><li>Huang, H. J., Liu, C. W., Xu, H. J., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucin-like+protein,+a+saliva+component+involved+in+brown+planthopper+virulence+and+host+adaptation.">Mucin-like protein, a saliva component involved in brown planthopper virulence and host adaptation.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 223-230 (2017).</li><li>Shangguan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mucin-like+protein+of+planthopper+is+required+for+feeding+and+induces+immunity+response+in+plants.">A mucin-like protein of planthopper is required for feeding and induces immunity response in plants.</a> Plant Physiology. 176 (1), 552-565 (2018).</li><li>Petrova, A., Smith, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodetection+of+a+brown+planthopper+(Nilaparvata+lugens+St&#229;l)+salivary+catalase-like+protein+into+tissues+of+rice,+Oryza+sativa.">Immunodetection of a brown planthopper (Nilaparvata lugens St&#229;l) salivary catalase-like protein into tissues of rice, Oryza sativa.</a> Insect Molecular Biology. 23 (1), 13-25 (2014).</li><li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+small+brown+planthopper,+Laodelphax+striatellus.">Genome sequence of the small brown planthopper, Laodelphax striatellus.</a> GigaScience. 6 (12), 1-12 (2017).</li><li>Van Bel, A. J., Will, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+evaluation+of+proteins+in+watery+and+gel+saliva+of+aphids.">Functional evaluation of proteins in watery and gel saliva of aphids.</a> Frontiers In Plant Science. 7, 1840 (2016).</li><li>Perez-Vilar, J., Hill, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+assembly+of+secreted+mucins.">The structure and assembly of secreted mucins.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (45), 31751-31754 (1999).</li><li>Pitino, M., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aphid+protein+effectors+promote+aphid+colonization+in+a+plant+species-specific+manner.">Aphid protein effectors promote aphid colonization in a plant species-specific manner.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 26 (1), 130-139 (2013).</li><li>Zhang, F., Zhu, L., He, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+expression+in+response+to+brown+planthopper+feeding+in+rice.">Differential gene expression in response to brown planthopper feeding in rice.</a> Journal of Plant Physiology. 161 (1), 53-62 (2004).</li><li>Hogenhout, S. A., Ammar, E. -. D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses.">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li><li>Boissot, N., Schoeny, A., Vanlerberghe-Masutti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vat,+an+amazing+gene+conferring+resistance+to+aphids+and+viruses+they+carry:+from+molecular+structure+to+field+effects.">Vat, an amazing gene conferring resistance to aphids and viruses they carry: from molecular structure to field effects.</a> Frontiers In Plant Science. 7, 1420 (2016).</li></ol>

Die erfolgreiche Aufzucht von Insekten auf künstlicher Diät wurde erstmals 1962 berichtet, als Mittler und Dadd die Paraffinmembrantechnik zur Durchführung einer künstlichen Diät beschrieben29,30. Und diese Methode wurde in vielen Aspekten der Insektenbiologie und des Verhaltens erforscht, zum Beispiel in den Bereichen Nahrungsergänzungsmittel, dsRNA-Fütterung und Virusakquisition. Basierend auf den Anforderungen der Speichelanalyse wird in dieser Studie 5...

Reisstreifenvirus (RSV), ein negativ gestrandetes RNA-Virus der Gattung Tenuivirus,verursacht schwere Erkrankungen in der Reisproduktion in Ostasien1,2,3. Die Übertragung von RSV von infizierten Reispflanzen auf gesunde pflanzen hängt von Insektenvektoren ab, hauptsächlich Laodelphax striatellus, die RSV persistent-propagierend übertragen. SBPH erwirbt das Virus nach der Fütterung von RSV-infizierten Pflanzen. Einmal im Inneren des Insekts infiziert RSV einen Tag nach der Fütterung die Mitteldarmepithelzelle und passiert dann die Mitteldarmbarriere, um die Hämolymphe zu durchdringen. Anschließend breitet sich RSV über die Hämolymphe in verschiedene Gewebe aus und vermehrt sich dann. Nach einer Latenzzeit von etwa 10-14 Tagen nach dem Erwerb kann das Virus in der Speicheldrüse über den sezernierten Speichel auf die gesunden Wirtspflanzen übertragen werden, während SBPH Saft aus dem Phloemsaugt 4,5,6,7,8,9,10 . Ein effizienter Fütterungsprozess und verschiedene Faktoren im Speichel sind für die Ausbreitung von RSV vom Insekt auf die Wirtspflanze unerlässlich.
Es wird angenommen, dass Insektenspeichel, der von Speicheldrüsen abgesondert wird, Insekten, Viren und Wirtspflanzen vermittelt. Hemiptera-Insekten produzieren normalerweise zwei Arten von Speichel: gelierenden Speichel und wässrigen Speichel11,12,13. Gelierender Speichel wird hauptsächlich in das Apoplasma ausgeschieden, um die Bewegung des Stylets zwischen den Wirtszellen aufrechtzuerhalten, und ist auch mit der Überwindung der Pflanzenresistenz und der Immunantworten verbunden14,15,16,17. In der Sondierungsphase der Fütterung sezernieren Insekten intermittieren sie gelierenden Speichel, der sofort oxidiert wird, um einen Oberflächenflansch zu bilden. Dann umschließen einzelne oder verzweigte Hüllen den Stylet, um einen röhrenförmigen Kanal18,19,20zu reservieren. Es wird angenommen, dass der Oberflächenflansch an der Epidermis das Eindringen in den Stylet erleichtert, indem er als Ankerpunkt dient, während die Ummantelungen um den Stylet mechanische Stabilität und Schmierung bieten können16,21,22,23. Nlshp wurde als essentielles Protein für die Speichelscheidenbildung und die erfolgreiche Fütterung der braunen Zwergzikade(Nilaparvata lugens,BPH) identifiziert. Die Hemmung der Expression des strukturellen Mantelproteins (SHP), das von der Blattlaus Acyrthosiphon pisum sezerniert wird, reduzierte seine Fortpflanzung, indem die Fütterung aus wirtsiebröhren unterbrochen wurde24. Darüber hinaus sollen Gelspeichelfaktoren bei einigen Insektenarten pflanzliche Immunantworten auslösen, indem sie sogenannte Pflanzenfresser-assoziierte molekulare Muster (HAMPs) bilden. In N. lugensinduziert NlMLP, ein Mucin-ähnliches Protein, das mit der Scheidenbildung zusammenhängt, pflanzliche Abwehrkräfte gegen die Fütterung, einschließlich Zelltod, die Expression von verteidigungsbezogenen Genen und Kallosettenablagerung 25,26. Es wurde auch nachgewiesen, dass einige Gelspeichelfaktoren bei Blattläusen pflanzenabwehrreaktionen über Gen-zu-Gen-Interaktionen ähnlich den pathogenassoziierten molekularen Musternauslösen 12,15,27.
Für die Untersuchung der Speichelfaktoren, die für die Fütterung von Insekten und / oder die Übertragung von Krankheitserregern unerlässlich sind, ist es notwendig, den sekretierten Speichel zu analysieren. Hier werden künstliche Fütterungs- und Entnahmemethoden beschrieben, um ausreichende Mengen an Speichel für die weitere Analyse zu erhalten. Mit einem Medium, das nur ein einziges Nährstoff enthielt, wurden viele Speichelproteine gesammelt und durch Silberfärbung und Western Blotting analysiert. Diese Methode wird bei der weiteren Erforschung von Faktoren im Speichel hilfreich sein, die für die RSV-Übertragung durch SBPH unerlässlich sind.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10-KD centrifugal filter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>R5PA83496</td>
			<td>For concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Protein Transfer Buffer(wet)</td>
			<td>macGENE</td>
			<td>MP008</td>
			<td>Transfer buffer for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x TBST buffer</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>SL1328-500mL&#215;10</td>
			<td>Wash buffer for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azure c600 biosystems</td>
			<td>Azure Biosystems</td>
			<td>Azure c600</td>
			<td>Imaging system for western blotting and silver staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Color Prestained protein ladder</td>
			<td>GenStar</td>
			<td>M221-01</td>
			<td>Protein marker for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL&#160;western blotting detection reagents</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN2209</td>
			<td>Western blotting detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enchanced HRP-DAB Chromogenic Kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>#PA110</td>
			<td>Chromogenic reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>401393-2ML</td>
			<td>Polyclonal secondary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon(R)-P Polyvinylidene difluoride membrane</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Transfer membrane for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1725125</td>
			<td>For quantitative real-time PCR (qRT-PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHES</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708891</td>
			<td>For Reverse-transcriptional PCR (RT-PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Filter, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td>For filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAB TGX Gels</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561043</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONEC-W</td>
			<td>Detection of protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon membrane</td>
			<td>PALL</td>
			<td>T42754</td>
			<td>Membrane for dot-ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M Membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>Making artifical diet sandwichs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-LssgMP polyclonal antibody against LssgMP peptides</td>
			<td>Genstript</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit primary anti-LssgMP polyclonal antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-RSV polyclonal antibody</td>
			<td>Genstript</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit primary anti-RSV polyclonal antibody for western blotting and dot-ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAprep pure Micro Kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>DP420</td>
			<td>For RNA Extraction</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-layered membrane sandwich method for laodelphax striatellus saliva collection

Das Reisstreifenvirus (RSV), das in Ostasien zu erheblichen wirtschaftlichen Verlusten der Landwirtschaft führt, hängt für seine effektive Übertragung unter wirtseigenem Reis vollständig von Insektenvektoren ab. Laodelphax striatellus (Kleine braune Zwergzikade, SBPH) ist der primäre Insektenvektor, der RSV horizontal überträgt, während er Saft aus dem Phloem saugt. Speichel spielt eine bedeutende Rolle im Fressverhalten von Insekten. Eine praktische Methode, die für die Erforschung des Speichels von Insekten mit piercing-saugendem Fressverhalten nützlich sein wird, wird hier beschrieben. Bei dieser Methode durften sich Insekten von einer künstlichen Diät ernähren, die zwischen zwei gestreckten Paraffinfilmschichten eingeklemmt war. Die Diät, die den Speichel enthielt, wurde jeden Tag gesammelt, filtriert und für weitere Analysen konzentriert. Schließlich wurde die Qualität des gesammelten Speichels durch Proteinfärbung und Immunoblotting untersucht. Diese Methode wurde durch den Nachweis von RSV und einem Mucin-ähnlichen Protein im Speichel von SBPH veranschaulicht. Diese künstliche Fütterungs- und Speichelsammelmethode wird eine Grundlage für die weitere Erforschung von Faktoren im Speichel von Insekten im Zusammenhang mit dem Fressverhalten und der Virusübertragung bilden.

Schematische Darstellung der künstlichen Fütterungsanlage und Speichelsammlung Abbildung 1A zeigt den Glaszylinder (15 cm x 2,5 cm), der als Futterkammer zum Sammeln des Speichels verwendet wird. Zuerst wurden die SBPH-Larven für mehrere Stunden ausgehungert, um die Sammeleffizienz zu verbessern, und dann durch Abkühlen für 5 Minuten immobilisiert. Nachdem die Insekten in den Glaszylinder überführt wurden, wurden beide offenen Enden der Kammer mit gestreckter Paraf...

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Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode, um mit einem künstlichen Medium ausreichend Speichel von piercing-saugenden Insekten zu sammeln. Dies ist eine bequeme Methode, um Insektenspeichel zu sammeln und die Speichelfunktion auf das Fressverhalten von Insekten und die Übertragung von vektorübertragenen Viren zu untersuchen.

Zweischichtige Membran-Sandwich-Methode für Laodelphax striatellus Speichelsammlung

Rice stripe virus (RSV), which causes significant economic loss of agriculture in East Asia, entirely depends on insect vectors for its effective ...

Künstliche Fütterung und Speichelsammlung bieten eine direkte Methode zum Nachweis von Effektoren im Speichel von Insekten. Dies wurde jedoch bisher nicht ausführlich beschrieben. Dieses Protokoll ist wirksam für die Speichelsammlung von saprophytischen Insekten.Darüber hinaus ist es eine einfache Technik, da wir Medium, das nur Saccharose enthält, als künstliche Diät verwenden. Der Speichel saprophytischer Insekten kann auf das Immunsystem des Wirts einwirken, um das Fressverhalten zu fördern und Krankheitserreger zu übertragen. Dieses Medikament, das für das Insektenverhalten und die Insektenknochenpfadforschung verwendet werden kann.Dies ist eine einfache Methode. Dies deutet jedoch auf die Montage einer sauberen experimentellen Umgebung hin, da Speichel für weitere Forschungen gesammelt wird. Beginnen Sie mit der Zubereitung einer 5% igen Saccharoselösung für die künstliche Ernährung und filtern Sie die Lösung durch einen 0,22-Mikron-Filter, um bakterielle Verunreinigungen und Verunreinigungen zu entfernen.Verhungern Sie etwa 200 kleine braune Pflanzentrichterlarven für drei bis fünf Stunden, bevor Sie sie in eine Futterkammer einführen. Als nächstes, um die Glaszylinder als Zufuhrkammern vorzubereiten, bedecken Sie ein offenes Ende der Kammer mit einer Paraffinmembran, bevor Sie die experimentellen Insekten einführen, dann übertragen Sie die Insekten in den Glaszylinder und bedecken Sie das andere Ende der Kammer mit gestreckter Paraffinmembran. Fügen Sie 200 Mikroliter künstliche Diät auf die Membran hinzu und bedecken Sie die Flüssigkeit mit einer weiteren Schicht gestreckter Paraffinmembran.Zum Schluss decken Sie die Kammer mit Aluminiumfolie ab und lassen Sie das Ende mit dem künstlichen Diätgerät dem Licht ausgesetzt. Sammeln Sie nach 24 Stunden den SBPH-Speichel, indem Sie den Zylinder bei vier Grad Celsius abkühlen, um die Insekten zu immobilisieren, dann den äußeren Film freilegen und die künstliche Diät in 1,5 Milliliter sterile röhrchen mit einer sterilen Pipette sammeln. Halten Sie den gesammelten Speichel bis zur Analyse bei minus 80 Grad Celsius.Als nächstes spülen Sie die innere Membran dreimal mit 50 Mikrolitern frischer künstlicher Diät durch sanftes Pipettieren ab und sammeln Sie die künstliche Waschdiät in sterile 1,5 Milliliter Röhrchen. Nach den drei Spülungen frische künstliche Diät auf die innere Membran geben und eine frisch gedehnte Paraffinmembran darauf legen. Filtern Sie schließlich die gesammelten Proben durch eine 0,22-Mikron-Filtereinheit, um Mikroben und andere Verunreinigungen zu entfernen.Übertragen Sie die kollektiven Speichelproben in einem 500 Mikroliter, 10 Kilodalton Zentrifugalfilter. Zentrifugieren Sie die Probe. Sammeln Sie den Überstand und erhöhen Sie das Endvolumen auf 100 Mikroliter.Um die Konzentration des gesammelten Speichels zu messen, schalten Sie das UV-sichtbare Spektralphotometer ein und waschen Sie die Sockel dreimal mit doppelt destilliertem Wasser. Wählen Sie die Optionen auf dem Bildschirm in der folgenden Reihenfolge aus: Proteine, Protein A280. Wählen Sie typ und eine Absorptionseinheit, die einem Milligramm pro Milliliter entspricht.Aktivieren Sie dann das Kontrollkästchen für die Baseline-Korrektur, 340 Nanometer. Als nächstes laden Sie zwei Mikroliter 5% iger Saccharose-wässriger Lösung als Rohling und berühren Sie dann Blank am unteren Bildschirmrand. Laden Sie schließlich nach dem Setzen der Standards zwei Mikroliter des gesammelten Speichels und zeichnen Sie die Proteinkonzentration auf.Bei der Fütterung von 5% Saccharose überlebten mehr als 80% der SBPH die ersten vier Tage. Ab dem fünften Tag stieg die Sterblichkeit jedoch schnell auf 40% und am siebten Tag überlebte weniger als die Hälfte der SBPH. Eine SDS-Seitenanalyse zeigte, dass die konzentrierten Speichelproben aus RSV-infiziertem SBPH-Speichel viel mehr Proteine enthielten als die 5% Saccharose-Negativkontrolle.In einer Western-Blot-Analyse zum Nachweis des RSV-Kapsidproteins handelt es sich um ein nicht infiziertes und viruliferes Insekt. Das RSV-Kapsidprotein wurde erfolgreich in der viruliferen Probe nachgewiesen, ein Antikörper, der gegen das LssgMP-Genprodukt entwickelt wurde, wies ein 78 Kilodalton-Protein in nicht infizierten und viruliferen Proben nach und zeigte, dass LssgMP ein Speichelprotein ist. Eine QRT-PCR-Analyse der LssgMP-Transkriptspiegel in verschiedenen Geweben zeigte, dass die Lssg-Transkriptspiegel in der Speicheldrüse 20-mal höher waren als im ganzen Körper und Darm, was die spezifische Expression von LssgMP in der Speicheldrüse bestätigt.Das Aushungern der experimentellen Insekten vor dem Einbringen in die Kammer ist notwendig, um die Effizienz unserer Speichelsammlung zu gewährleisten. Außerdem sollte alle 24 Stunden ein künstliches Medium gesammelt und ausgetauscht werden, um die mikrobielle Kontamination in der gesammelten Probe zu reduzieren. Diese Technik bietet eine direkte Methode, um die Funktion des Speichels bei der Übertragung von Krankheitserregern zu untersuchen.Darüber hinaus kann es helfen, die Interaktion zwischen Insektenpathogenen zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Biology

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Crystallizing Membranproteinen zur Strukturaufklärung mittels Lipidische Mesophasen

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Forschung

Biologie

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen mit dem Lipidische Bicellen Methode

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

Blutentnahme für Biochemische Untersuchungen an adulten Zebrafisch

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Einsatz eines Roboters für High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Ernte-und Cryo-Kühlung Kristalle von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen zur Strukturaufklärung von Makromolekulare Kristallographie Grown

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation

Eine praktische und neuartige Methode, um genomische DNA aus Blutentnahme Kits Auszug für Plasma Protein Preservation

Laboratory tests can be done on the cellular or  fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes  determines the portion of the ...

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Sammlung und Analyse von<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Phloemexsudaten Mit der EDTA-Methode erleichtert

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Mikroperfusion Technik zur Untersuchung von Mikrogefäßdurchlässigkeit Verordnung in Rattengekröse

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish

Wiederholte Blutentnahme für Bluttests in Adult Zebrafisch

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Grundzustand Erschöpfung Super-Resolution Imaging in Säugerzellen

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...