Name: two-layered membrane sandwich method for laodelphax striatellus saliva collection
Uploaded: 2021-08-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי התוכנית הלאומית למחקר ופיתוח מפתח של סין (מס '2019YFC1200503), על ידי הקרן הלאומית למדע של סין (מס '32072385), ועל ידי האגודה לקידום חדשנות נוער CAS (2021084).

1. תחזוקת SBPH
<ol><li>לגדל את האנשים SBPH ארסיים ללא RSV בחממה זכוכית (65 x 200 מ"מ) עם 5-6 אורז(Oryza sativa cv. Nipponbare) שתילים לכל תא זכוכית במעבדה. לגדל את צמחי האורז ב 25 °C (5 °F) תחת אור 16 שעות / 8 שעות פוטופריוד כהה. הערה: האנשים בעלי החיים הנמרצים והפטורים מ- RSV נתפסו בתחילה במחוז ג'יאנגסו, סין.</li>
	<li>זהה RSV ב- S...

<ol>
	<li>Cheng, X., Zhu, L., He, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+understanding+of+molecular+interactions+between+rice+and+the+brown+planthopper.">Towards understanding of molecular interactions between rice and the brown planthopper.</a> Molecular Plant. 6 (3), 621-634 (2013).</li><li>Cho, W. K., Lian, S., Kim, S. M., Park, S. H., Kim, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+insights+into+research+on+Rice+Stripe+Virus.">Current insights into research on Rice Stripe Virus.</a> The Plant Pathology Journal. 29 (3), 223-233 (2013).</li><li>He, M., Guan, S. Y., He, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+rice+stripe+virus.">Evolution of rice stripe virus.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 109, 343-350 (2017).</li><li>Wu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonstructural+protein+NS4+of+Rice+Stripe+Virus+plays+a+critical+role+in+viral+spread+in+the+body+of+vector+insects.">Nonstructural protein NS4 of Rice Stripe Virus plays a critical role in viral spread in the body of vector insects.</a> PLoS One. 9 (2), 88636 (2014).</li><li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transovarial+transmission+of+a+plant+virus+is+mediated+by+vitellogenin+of+its+insect+vector.">Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector.</a> PLoS Pathogens. 10 (3), 1003949 (2014).</li><li>Taning, C. N., Andrade, E. C., Hunter, W. B., Christiaens, O., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asian+citrus+psyllid+RNAi+pathway-RNAi+evidence.">Asian citrus psyllid RNAi pathway-RNAi evidence.</a> Scientific Reports. 6, 38082 (2016).</li><li>Garbutt, J. S., Bell&#233;s, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+double-stranded+RNA+in+insect+hemolymph+as+a+potential+determiner+of+RNA+interference+success:+evidence+from+Manduca+sexta+and+Blattella+germanica.">Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: evidence from Manduca sexta and Blattella germanica.</a> Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).</li><li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+feeding+Rice+Stripe+Virus+enables+efficient+virus+infection+of+Laodelphax+striatellus.">Artificial feeding Rice Stripe Virus enables efficient virus infection of Laodelphax striatellus.</a> Journal of Virological Methods. 235, 139-143 (2016).</li><li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+tissue-specific+vitellogenin+facilitates+transmission+of+plant+virus.">Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus.</a> PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).</li><li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+Stripe+Virus+hitchhikes+the+vector+insect+vitellogenin+ligand-receptor+pathway+for+ovary+entry.">Rice Stripe Virus hitchhikes the vector insect vitellogenin ligand-receptor pathway for ovary entry.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374, 20180312 (2019).</li><li>Bao, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+intestine-specific+transcriptome+of+the+brown+planthopper+Nilaparvata+lugens+revealed+potential+functions+in+digestion,+detoxification+and+immune+response.">De novo intestine-specific transcriptome of the brown planthopper Nilaparvata lugens revealed potential functions in digestion, detoxification and immune response.</a> Genomics. 99 (4), 256-264 (2012).</li><li>Elzinga, D. A., Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+protein+effectors+in+plant-aphid+interactions.">The role of protein effectors in plant-aphid interactions.</a> Current Opinion In Plant Biology. 16 (4), 451-456 (2013).</li><li>Chung, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbivore+exploits+orally+secreted+bacteria+to+suppress+plant+defenses.">Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15728-15733 (2013).</li><li>Bos, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+genomics+approach+identifies+candidate+effectors+from+the+aphid+species+Myzus+persicae+(green+peach+aphid).">A functional genomics approach identifies candidate effectors from the aphid species Myzus persicae (green peach aphid).</a> PLoS Genetics. 6 (11), 1001216 (2010).</li><li>Liu, X., Zhou, H., Zhao, J., Hua, H., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+secreted+watery+saliva+proteins+of+the+rice+brown+planthopper,+Nilaparvata+lugens+(St&#229;l)+by+transcriptome+and+Shotgun+LC-MS/MS+approach.">Identification of the secreted watery saliva proteins of the rice brown planthopper, Nilaparvata lugens (St&#229;l) by transcriptome and Shotgun LC-MS/MS approach.</a> Journal of Insect Physiology. 89, 60-69 (2016).</li><li>Cao, T. T., L&#252;, J., Lou, Y. G., Cheng, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding-induced+interactions+between+two+rice+planthoppers,+Nilaparvata+lugens+and+Sogatella+furcifera+(Hemiptera:+Delphacidae):+effects+on+feeding+and+honeydew+excretion.">Feeding-induced interactions between two rice planthoppers, Nilaparvata lugens and Sogatella furcifera (Hemiptera: Delphacidae): effects on feeding and honeydew excretion.</a> Environmental Entomology. 42 (6), 1281-1291 (2013).</li><li>De Vos, M., Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myzus+persicae+(green+peach+aphid)+salivary+components+induce+defence+responses+in+Arabidopsis+thaliana.">Myzus persicae (green peach aphid) salivary components induce defence responses in Arabidopsis thaliana.</a> Plant, Cell &amp; Environment. 32 (11), 1548-1560 (2009).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+immune+system+architecture+and+transcriptome+responses+to+southern+rice+black-streaked+dwarf+virus+in+Sogatella+furcifera.">Understanding the immune system architecture and transcriptome responses to southern rice black-streaked dwarf virus in Sogatella furcifera.</a> Scientific Reports. 6, 36254 (2016).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetration+into+rice+tissues+by+brown+planthopper+and+fine+structure+of+the+salivary+sheaths.">Penetration into rice tissues by brown planthopper and fine structure of the salivary sheaths.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 129 (3), 295-307 (2008).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Armet+is+an+effector+protein+mediating+aphid-plant+interactions.">Armet is an effector protein mediating aphid-plant interactions.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 29 (5), 2032-2045 (2015).</li><li>Chaudhary, R., Atamian, H. S., Shen, Z., Briggs, S. P., Kaloshian, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GroEL+from+the+endosymbiont+Buchnera+aphidicola+betrays+the+aphid+by+triggering+plant+defense.">GroEL from the endosymbiont Buchnera aphidicola betrays the aphid by triggering plant defense.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 8919-8924 (2014).</li><li>Ma, R., Chen, J. L., Cheng, D. F., Sun, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+defense+mechanism+in+wheat+by+polyphenol+oxidase+from+aphid+saliva.">Activation of defense mechanism in wheat by polyphenol oxidase from aphid saliva.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 58 (4), 2410-2418 (2010).</li><li>Zheng, L., Seon, Y. J., McHugh, J., Papagerakis, S., Papagerakis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clock+genes+show+circadian+rhythms+in+salivary+glands.">Clock genes show circadian rhythms in salivary glands.</a> Journal of Dental Research. 91 (8), 783-788 (2012).</li><li>Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+transcriptomic/proteomic+analysis+of+salivary+gland+and+secreted+saliva+in+three+planthopper+species.">Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species.</a> Journal of Proteomics. 172, 25-35 (2018).</li><li>Huang, H. J., Liu, C. W., Xu, H. J., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucin-like+protein,+a+saliva+component+involved+in+brown+planthopper+virulence+and+host+adaptation.">Mucin-like protein, a saliva component involved in brown planthopper virulence and host adaptation.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 223-230 (2017).</li><li>Shangguan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mucin-like+protein+of+planthopper+is+required+for+feeding+and+induces+immunity+response+in+plants.">A mucin-like protein of planthopper is required for feeding and induces immunity response in plants.</a> Plant Physiology. 176 (1), 552-565 (2018).</li><li>Petrova, A., Smith, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodetection+of+a+brown+planthopper+(Nilaparvata+lugens+St&#229;l)+salivary+catalase-like+protein+into+tissues+of+rice,+Oryza+sativa.">Immunodetection of a brown planthopper (Nilaparvata lugens St&#229;l) salivary catalase-like protein into tissues of rice, Oryza sativa.</a> Insect Molecular Biology. 23 (1), 13-25 (2014).</li><li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+small+brown+planthopper,+Laodelphax+striatellus.">Genome sequence of the small brown planthopper, Laodelphax striatellus.</a> GigaScience. 6 (12), 1-12 (2017).</li><li>Van Bel, A. J., Will, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+evaluation+of+proteins+in+watery+and+gel+saliva+of+aphids.">Functional evaluation of proteins in watery and gel saliva of aphids.</a> Frontiers In Plant Science. 7, 1840 (2016).</li><li>Perez-Vilar, J., Hill, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+assembly+of+secreted+mucins.">The structure and assembly of secreted mucins.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (45), 31751-31754 (1999).</li><li>Pitino, M., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aphid+protein+effectors+promote+aphid+colonization+in+a+plant+species-specific+manner.">Aphid protein effectors promote aphid colonization in a plant species-specific manner.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 26 (1), 130-139 (2013).</li><li>Zhang, F., Zhu, L., He, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+expression+in+response+to+brown+planthopper+feeding+in+rice.">Differential gene expression in response to brown planthopper feeding in rice.</a> Journal of Plant Physiology. 161 (1), 53-62 (2004).</li><li>Hogenhout, S. A., Ammar, E. -. D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses.">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li><li>Boissot, N., Schoeny, A., Vanlerberghe-Masutti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vat,+an+amazing+gene+conferring+resistance+to+aphids+and+viruses+they+carry:+from+molecular+structure+to+field+effects.">Vat, an amazing gene conferring resistance to aphids and viruses they carry: from molecular structure to field effects.</a> Frontiers In Plant Science. 7, 1420 (2016).</li></ol>

גידול מוצלח של חרקים על דיאטות מלאכותיות דווח לראשונה בשנת 1962 כאשר מיטלר ואבא תיארו את טכניקת קרום פרפין להחזיק דיאטה מלאכותית29,30. שיטה זו נחקרה בהיבטים רבים של ביולוגיה והתנהגות חרקים, למשל, תוספת תזונתית, האכלת dsRNA, ורכישת וירוסים. בהתבסס על הדרישות של נית?...

וירוס פסים אורז (RSV), וירוס RNA שלילי תקוע בסוג Tenuivirus, גורם למחלות קשות בייצור אורז במזרח אסיה1,2,3. העברת RSV מצמחי אורז נגועים לבריאים תלויה בווקטורים של חרקים, בעיקר לאודלפקס סטריאטלוס, המעביר RSV באופן מתמשך-מפיץ. SBPH רוכש את הנגיף לאחר האכלה על צמחים נגועים RSV. ברגע שבתוך החרק, RSV מדביק את תא האפיתל midgut יום אחד לאחר האכלה ולאחר מכן עובר דרך מחסום midgut לחדור המולימף. לאחר מכן, RSV מתפשט לתוך רקמות שונות באמצעות ההמולימפה ולאחר מכן מתפשט. לאחר תקופה סמויה של כ 10-14 ימים לאחר הרכישה, הנגיף בתוך בלוטת הרוק יכול להיות מועבר לצמחים המארחים בריאים באמצעות הרוק המופרש בעוד SBPH מוצץ sap מן phloem4,5,6,7,8,9,10 . תהליך האכלה יעיל וגורמים שונים ברוק חיוניים להתפשטות RSV מהחרק לצמח המארח.
רוק חרקים המופרש על ידי בלוטות הרוק הוא האמין לתווך חרקים, וירוסים, צמחים מארחים. חרקים Hemipteran בדרך כלל לייצר שני סוגים של רוק: רוק ג'לינג ורוק מימי11,12,13. רוק גלינג מופרש בעיקר לתוך apoplasm כדי לקיים את התנועה של stylet בין תאים מארחים והוא קשור גם להתגברות על התנגדות הצמח ותגובות חיסוניות14,15,16,17. בשלב החיטוט של האכלה, חרקים מפרישים לסירוגין רוק ג'לינג שמיד מתחמצן ויוצר אוגן על פני השטח. לאחר מכן, נדן יחיד או מסועף עטוף את הסגנון כדי להזמין ערוץ צינורי18,19,20. אוגן פני השטח על האפידרמיס הוא הניח כדי להקל על חדירה של stylet על ידי משמש כנקודת עיגון, בעוד נדן סביב stylet עשוי לספק יציבות מכנית סיכה16,21,22,23. Nlshp זוהה כחלבון חיוני להיווצרות נדן הרוק והאכלה מוצלחת של צמח חום(Nilaparvata lugens,BPH). עיכוב הביטוי של חלבון הנדן המבני (SHP) המופרש על ידי pisum Acyrthosiphon כנימות הפחית את הרבייה שלה על ידי שיבוש האכלה מצינורות מסננת מארח24. יתר על כן, בכמה מינים חרקים, גורמי רוק ג'ל אמורים לעורר תגובות חיסוניות צמח על ידי יצירת מה שנקרא דפוסים מולקולריים הקשורים אוכלי עשב (HAMPs). ב N. lugens, NlMLP, חלבון דמוי מוצין הקשור להיווצרות נדן, גורם להגנות צמחים מפני האכלה, כולל מוות תאים, ביטוי של גנים הקשורים להגנה, ותצהיר callose 25,26. כמו כן, כמה גורמי רוק ג'ל כנימות הוכחו לעורר תגובות הגנה צמחית באמצעות אינטראקציות בין גנים לגן דומה דפוסים מולקולריים הקשוריםפתוגן 12,15,27.
לחקר גורמי הרוק החיוניים להאכלת חרקים ו/או להעברת פתוגן, יש צורך לנתח רוק מופרש. כאן, שיטות האכלה ואיסוף מלאכותיות כדי להשיג כמויות מספיקות של רוק מתוארים לניתוח נוסף. באמצעות מדיום המכיל רק אלמנט תזונתי אחד, חלבוני רוק רבים נאספו ונותחו על ידי כתמי כסף וכתמים מערביים. שיטה זו תהיה מועילה במחקר נוסף על גורמים ברוק כי הם חיוניים להעברת RSV על ידי SBPH.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10-KD centrifugal filter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>R5PA83496</td>
			<td>For concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Protein Transfer Buffer(wet)</td>
			<td>macGENE</td>
			<td>MP008</td>
			<td>Transfer buffer for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x TBST buffer</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>SL1328-500mL&#215;10</td>
			<td>Wash buffer for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azure c600 biosystems</td>
			<td>Azure Biosystems</td>
			<td>Azure c600</td>
			<td>Imaging system for western blotting and silver staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Color Prestained protein ladder</td>
			<td>GenStar</td>
			<td>M221-01</td>
			<td>Protein marker for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL&#160;western blotting detection reagents</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN2209</td>
			<td>Western blotting detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enchanced HRP-DAB Chromogenic Kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>#PA110</td>
			<td>Chromogenic reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>401393-2ML</td>
			<td>Polyclonal secondary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon(R)-P Polyvinylidene difluoride membrane</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Transfer membrane for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1725125</td>
			<td>For quantitative real-time PCR (qRT-PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHES</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708891</td>
			<td>For Reverse-transcriptional PCR (RT-PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Filter, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td>For filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAB TGX Gels</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561043</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONEC-W</td>
			<td>Detection of protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon membrane</td>
			<td>PALL</td>
			<td>T42754</td>
			<td>Membrane for dot-ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M Membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>Making artifical diet sandwichs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-LssgMP polyclonal antibody against LssgMP peptides</td>
			<td>Genstript</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit primary anti-LssgMP polyclonal antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-RSV polyclonal antibody</td>
			<td>Genstript</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit primary anti-RSV polyclonal antibody for western blotting and dot-ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAprep pure Micro Kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>DP420</td>
			<td>For RNA Extraction</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-layered membrane sandwich method for laodelphax striatellus saliva collection

וירוס פס האורז (RSV), שגורם לאובדן כלכלי משמעותי של החקלאות במזרח אסיה, תלוי לחלוטין בווקטורים של חרקים להעברתו האפקטיבית בקרב אורז מארח. לאודלפקס סטריאטלוס (באנגלית: Laodelphax striatellus) הוא וקטור החרקים העיקרי המעביר אופקית RSV תוך מציצת שרף מהפלום. הרוק ממלא תפקיד משמעותי בהתנהגות ההאכלה של החרקים. שיטה נוחה שתהיה שימושית למחקר על רוק חרקים עם התנהגות האכלה מוצצת פירסינג מתוארת כאן. בשיטה זו, חרקים הורשו לאכול על דיאטה מלאכותית בין שתי שכבות סרט פרפין מתוח. הדיאטה המכילה את הרוק נאספה מדי יום, מסוננת ומרוכזת לניתוח נוסף. לבסוף, איכות הרוק שנאסף נבדקה על ידי כתמי חלבון וחיסון. שיטה זו באה לידית על ידי זיהוי נוכחות של RSV וחלבון דמוי מוצין ברוק של SBPH. שיטת האכלה מלאכותית ואיסוף רוקים אלה תכשיר בסיס למחקר נוסף על גורמים ברוק חרקים הקשורים להתנהגות האכלה ולהעברת וירוסים.

שרטוטים של התקנת הזנה מלאכותית ואיסוף רוק איור 1A מתאר את גליל הזכוכית (15 ס"מ על 2.5 ס"מ) המשמש כתא האכלה לאיסוף הרוק. ראשית, זחלי SBPH היו מורעבים במשך כמה שעות כדי לשפר את יעילות האיסוף ולאחר מכן משותק על ידי צינון במשך 5 דקות. לאחר החרקים הועברו לתוך גליל זכוכית, שני הק...

Watch this Scientific Journal Video about Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection at JoVE.com

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לאיסוף מספיק רוק מחרקים יונקים באמצעות מדיום מלאכותי. זוהי שיטה נוחה לאיסוף רוק חרקים וחקר תפקוד הרוק על התנהגות האכלת חרקים והעברת וירוסים המועברים בווקטורים.

שיטת כריך ממברנה דו שכבתית עבור אוסף הרוק של לאודלפקס

Rice stripe virus (RSV), which causes significant economic loss of agriculture in East Asia, entirely depends on insect vectors for its effective ...

האכלה מלאכותית ואיסוף רוק מספקים שיטה ישירה לאיתור משפיעים ברוק חרקים. עם זאת, זה לא תואר בפירוט לפני. פרוטוקול זה יעיל לאיסוף רוק מחרקים ספורופיטיים.בנוסף, זוהי טכניקה פשוטה, כפי שאנו משתמשים בינוני המכיל רק סוכרוז כמו דיאטה מלאכותית. רוק חרקים ספורופיטיים עלול להשפיע על המערכת החיסונית של הפונדקאי לטובת התנהגות האכלה והעברת פתוגנים. תרופה זו שיכולה לשמש להתנהגות חרקים ולמחקר נתיב עצם החרק.זוהי שיטה פשוטה לביצוע. עם זאת, זה מצביע על הרכבה של סביבה ניסיונית נקייה כמו רוק נאסף למחקר נוסף. התחל על ידי הכנת פתרון 5% סוכרוז לתזונה המלאכותית, ולסנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.22 מיקרון כדי להסיר זיהום חיידקים וזיהומים.להרעיב כ -200 זחלי הופר צמחים חומים קטנים במשך שלוש עד חמש שעות לפני החדרתם לתא האכלה. לאחר מכן, כדי להכין את גלילי הזכוכית כתאי האכלה, לכסות קצה פתוח אחד של התא עם קרום פרפין לפני הצגת החרקים הניסיוניים, ולאחר מכן להעביר את החרקים לתוך גליל זכוכית לכסות את הקצה השני של התא עם קרום פרפין מתוח. מוסיפים 200 מיקרוליטרים של דיאטה מלאכותית על הממברנה, ולאחר מכן לכסות את הנוזל עם שכבה נוספת של קרום פרפין מתוח.לבסוף, לכסות את התא עם רדיד אלומיניום, משאיר את הסוף עם מכשיר דיאטה מלאכותית חשוף לאור. לאחר 24 שעות, לאסוף את הרוק SBPH על ידי קירור הגליל בארבע מעלות צלזיוס כדי לשתק את החרקים, ואז לחשוף את הסרט החיצוני ולאסוף את הדיאטה המלאכותית לתוך צינורות סטריליים 1.5 מיליליטר באמצעות פיפטה סטרילית. שמור את הרוק שנאסף במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לניתוח.לאחר מכן, לשטוף את הממברנה הפנימית עם 50 microliters של דיאטה מלאכותית טרי שלוש פעמים על ידי pipetting ברכות, ולאסוף את דיאטת כביסה מלאכותית לתוך צינורות סטריליים 1.5 מיליליטר. לאחר שלוש שטיפות, מוסיפים דיאטה מלאכותית טרייה על הממברנה הפנימית ומניחים קרום פרפין טרי על גבי. לבסוף, לסנן את הדגימות שנאספו באמצעות יחידת מסנן מיקרון 0.22 כדי להסיר חיידקים ומזהמים אחרים.מעבירים את דגימות הרוק הקולקטיביות במסנן צנטריפוגלי 500 מיקרוליטר, 10 קילודלטון. צנטריפוגה הדגימה. לאסוף את supernatant ולהביא את הנפח הסופי ל 100 microliters.כדי למדוד את הריכוז של הרוק שנאסף, להפעיל את ספקטרופוטומטר הנראה UV ולשטוף את המעמדים שלוש פעמים עם מים מזוקקים כפולים. בחרו את האפשרויות על המסך בסדר הבא, חלבונים, חלבון A280. בחר סוג ויחידת ספיגה אחת השווה למיליגרם אחד למיליליטר.לאחר מכן סמן את התיבה לתיקון בסיסי, 340 ננומטר. לאחר מכן, לטעון שני microliters של 5% תמיסה מימית כמו ריק, ולאחר מכן לגעת ריק בתחתית המסך. לבסוף, לאחר קביעת הסטנדרטים, לטעון שני microliters של הרוק שנאסף ולתעד את ריכוז החלבון.כאשר ניזונים מ-5% סוכרוז, יותר מ-80% מה-SBPH שרדו בארבעת הימים הראשונים. עם זאת, מהיום החמישי ואילך, התמותה עלתה במהירות ל -40% וביום השביעי, פחות ממחצית SBPH שרד. ניתוח דף SDS הראה את דגימות הרוק המרוכזות מרוק SBPH נגוע RSV הכיל הרבה יותר חלבונים מאשר 5% שליטה שלילית סוכרוז.בניתוח כתם מערבי לגילוי חלבון קבסיד RSV, חרקים לא נגועים ונמרצים. חלבון קפסיד RSV זוהה בהצלחה במדגם המרץ, נוגדן שתוכנן נגד מוצר הגן LssgMP זיהה חלבון 78 קילודלטון בדגימות לא נגועות ומרץ, והוכיח כי LssgMP הוא חלבון רוק. ניתוח QRT PCR של רמות תעתיק LssgMP ברקמות שונות הראה כי רמות התמליל Lssg בבלוטת הרוק היה גבוה פי 20 מאשר בכל הגוף והמעיים, המאשר את הביטוי הספציפי של LssgMP בבלוטת הרוק.להרעיב את החרקים הניסיוניים לפני הכנסתם לתאים יש צורך להבטיח את היעילות של אוסף הרוק שלנו. חוץ מזה, מדיום מלאכותי צריך להיות נאסף והחלפה כל 24 שעות כדי להפחית זיהום מיקרוביאלי במדגם שנאסף. טכניקה זו מספקת שיטה ישירה ללמוד את תפקוד הרוק בהעברת פתוגנים.בנוסף, זה יכול לעזור ללמוד אינטראקציה מארח פתוגן חרקים.

Research

JoVE Journal

Biology

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

גיבוש חלבונים בממברנה עבור קביעת מבנה באמצעות Mesophases Lipidic

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

תפוקה גבוהה התגבשות של חלבונים בממברנה שימוש בשיטה Lipidic Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

הדם אוסף של ניתוח ביוכימי דג הזברה למבוגרים בלבד

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

שימוש ברובוט להתגבשות תפוקה גבוהה של חלבונים בממברנה בMesophases Lipidic

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

קצירה וCryo-קירור גבישים של חלבונים בממברנה גדלו בMesophases Lipidic לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה Macromolecular

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation

שיטה מעשית ורומן לחלץ הדנ&quot;א הגנומי מערכות דם אוסף לשימור חלבון פלזמה

Laboratory tests can be done on the cellular or  fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes  determines the portion of the ...

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

איסוף וניתוח של<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; השיפה exudates שימוש בשיטת EDTA-הקלה

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Microperfusion טכניקה לחקירת הסדרת כלי דם קטן חדירות בחולדה לפדר

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish

איסוף דם חוזרים ונשנים לבדיקות דם בדג הזברה למבוגרים

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

הדמיה סופר-ברזולוציה המחסור בקרקע בתאים בתרבית

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...