Name: two-layered membrane sandwich method for laodelphax striatellus saliva collection
Uploaded: 2021-08-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Kinas nationella nyckelforsknings- och utvecklingsprogram (nr 2019YFC1200503), av National Science Foundation of China (nr 32072385) och av Youth Innovation Promotion Association CAS (2021084).

1. SBPH underhåll
<ol><li>Bakre viruliferous och RSV-fria SBPH-individer i en glasinkubator (65 x 200 mm) med 5-6 ris(Oryza sativa cv. Nipponbare) plantor per glaskammare i laboratoriet. Odla risplantorna vid 25 °C under en 16 h ljus / 8 h mörk fotoperiod. OBS: De viruliferous och RSV-fria SBPH-individerna fångades ursprungligen i Jiangsu-provinsen, Kina.</li>
	<li>Detektera RSV i SBPH med punkt-enzymlänkad immunosorbentanalys (punkt-ELISA) med en kanin RSV-specifik polyklonal antikropp (se Mat...

<ol>
	<li>Cheng, X., Zhu, L., He, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+understanding+of+molecular+interactions+between+rice+and+the+brown+planthopper.">Towards understanding of molecular interactions between rice and the brown planthopper.</a> Molecular Plant. 6 (3), 621-634 (2013).</li><li>Cho, W. K., Lian, S., Kim, S. M., Park, S. H., Kim, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+insights+into+research+on+Rice+Stripe+Virus.">Current insights into research on Rice Stripe Virus.</a> The Plant Pathology Journal. 29 (3), 223-233 (2013).</li><li>He, M., Guan, S. Y., He, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+rice+stripe+virus.">Evolution of rice stripe virus.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 109, 343-350 (2017).</li><li>Wu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonstructural+protein+NS4+of+Rice+Stripe+Virus+plays+a+critical+role+in+viral+spread+in+the+body+of+vector+insects.">Nonstructural protein NS4 of Rice Stripe Virus plays a critical role in viral spread in the body of vector insects.</a> PLoS One. 9 (2), 88636 (2014).</li><li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transovarial+transmission+of+a+plant+virus+is+mediated+by+vitellogenin+of+its+insect+vector.">Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector.</a> PLoS Pathogens. 10 (3), 1003949 (2014).</li><li>Taning, C. N., Andrade, E. C., Hunter, W. B., Christiaens, O., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asian+citrus+psyllid+RNAi+pathway-RNAi+evidence.">Asian citrus psyllid RNAi pathway-RNAi evidence.</a> Scientific Reports. 6, 38082 (2016).</li><li>Garbutt, J. S., Bell&#233;s, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+double-stranded+RNA+in+insect+hemolymph+as+a+potential+determiner+of+RNA+interference+success:+evidence+from+Manduca+sexta+and+Blattella+germanica.">Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: evidence from Manduca sexta and Blattella germanica.</a> Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).</li><li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+feeding+Rice+Stripe+Virus+enables+efficient+virus+infection+of+Laodelphax+striatellus.">Artificial feeding Rice Stripe Virus enables efficient virus infection of Laodelphax striatellus.</a> Journal of Virological Methods. 235, 139-143 (2016).</li><li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+tissue-specific+vitellogenin+facilitates+transmission+of+plant+virus.">Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus.</a> PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).</li><li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+Stripe+Virus+hitchhikes+the+vector+insect+vitellogenin+ligand-receptor+pathway+for+ovary+entry.">Rice Stripe Virus hitchhikes the vector insect vitellogenin ligand-receptor pathway for ovary entry.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374, 20180312 (2019).</li><li>Bao, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+intestine-specific+transcriptome+of+the+brown+planthopper+Nilaparvata+lugens+revealed+potential+functions+in+digestion,+detoxification+and+immune+response.">De novo intestine-specific transcriptome of the brown planthopper Nilaparvata lugens revealed potential functions in digestion, detoxification and immune response.</a> Genomics. 99 (4), 256-264 (2012).</li><li>Elzinga, D. A., Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+protein+effectors+in+plant-aphid+interactions.">The role of protein effectors in plant-aphid interactions.</a> Current Opinion In Plant Biology. 16 (4), 451-456 (2013).</li><li>Chung, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbivore+exploits+orally+secreted+bacteria+to+suppress+plant+defenses.">Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15728-15733 (2013).</li><li>Bos, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+genomics+approach+identifies+candidate+effectors+from+the+aphid+species+Myzus+persicae+(green+peach+aphid).">A functional genomics approach identifies candidate effectors from the aphid species Myzus persicae (green peach aphid).</a> PLoS Genetics. 6 (11), 1001216 (2010).</li><li>Liu, X., Zhou, H., Zhao, J., Hua, H., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+secreted+watery+saliva+proteins+of+the+rice+brown+planthopper,+Nilaparvata+lugens+(St&#229;l)+by+transcriptome+and+Shotgun+LC-MS/MS+approach.">Identification of the secreted watery saliva proteins of the rice brown planthopper, Nilaparvata lugens (St&#229;l) by transcriptome and Shotgun LC-MS/MS approach.</a> Journal of Insect Physiology. 89, 60-69 (2016).</li><li>Cao, T. T., L&#252;, J., Lou, Y. G., Cheng, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding-induced+interactions+between+two+rice+planthoppers,+Nilaparvata+lugens+and+Sogatella+furcifera+(Hemiptera:+Delphacidae):+effects+on+feeding+and+honeydew+excretion.">Feeding-induced interactions between two rice planthoppers, Nilaparvata lugens and Sogatella furcifera (Hemiptera: Delphacidae): effects on feeding and honeydew excretion.</a> Environmental Entomology. 42 (6), 1281-1291 (2013).</li><li>De Vos, M., Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myzus+persicae+(green+peach+aphid)+salivary+components+induce+defence+responses+in+Arabidopsis+thaliana.">Myzus persicae (green peach aphid) salivary components induce defence responses in Arabidopsis thaliana.</a> Plant, Cell &amp; Environment. 32 (11), 1548-1560 (2009).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+immune+system+architecture+and+transcriptome+responses+to+southern+rice+black-streaked+dwarf+virus+in+Sogatella+furcifera.">Understanding the immune system architecture and transcriptome responses to southern rice black-streaked dwarf virus in Sogatella furcifera.</a> Scientific Reports. 6, 36254 (2016).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetration+into+rice+tissues+by+brown+planthopper+and+fine+structure+of+the+salivary+sheaths.">Penetration into rice tissues by brown planthopper and fine structure of the salivary sheaths.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 129 (3), 295-307 (2008).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Armet+is+an+effector+protein+mediating+aphid-plant+interactions.">Armet is an effector protein mediating aphid-plant interactions.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 29 (5), 2032-2045 (2015).</li><li>Chaudhary, R., Atamian, H. S., Shen, Z., Briggs, S. P., Kaloshian, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GroEL+from+the+endosymbiont+Buchnera+aphidicola+betrays+the+aphid+by+triggering+plant+defense.">GroEL from the endosymbiont Buchnera aphidicola betrays the aphid by triggering plant defense.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 8919-8924 (2014).</li><li>Ma, R., Chen, J. L., Cheng, D. F., Sun, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+defense+mechanism+in+wheat+by+polyphenol+oxidase+from+aphid+saliva.">Activation of defense mechanism in wheat by polyphenol oxidase from aphid saliva.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 58 (4), 2410-2418 (2010).</li><li>Zheng, L., Seon, Y. J., McHugh, J., Papagerakis, S., Papagerakis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clock+genes+show+circadian+rhythms+in+salivary+glands.">Clock genes show circadian rhythms in salivary glands.</a> Journal of Dental Research. 91 (8), 783-788 (2012).</li><li>Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+transcriptomic/proteomic+analysis+of+salivary+gland+and+secreted+saliva+in+three+planthopper+species.">Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species.</a> Journal of Proteomics. 172, 25-35 (2018).</li><li>Huang, H. J., Liu, C. W., Xu, H. J., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucin-like+protein,+a+saliva+component+involved+in+brown+planthopper+virulence+and+host+adaptation.">Mucin-like protein, a saliva component involved in brown planthopper virulence and host adaptation.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 223-230 (2017).</li><li>Shangguan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mucin-like+protein+of+planthopper+is+required+for+feeding+and+induces+immunity+response+in+plants.">A mucin-like protein of planthopper is required for feeding and induces immunity response in plants.</a> Plant Physiology. 176 (1), 552-565 (2018).</li><li>Petrova, A., Smith, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodetection+of+a+brown+planthopper+(Nilaparvata+lugens+St&#229;l)+salivary+catalase-like+protein+into+tissues+of+rice,+Oryza+sativa.">Immunodetection of a brown planthopper (Nilaparvata lugens St&#229;l) salivary catalase-like protein into tissues of rice, Oryza sativa.</a> Insect Molecular Biology. 23 (1), 13-25 (2014).</li><li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+small+brown+planthopper,+Laodelphax+striatellus.">Genome sequence of the small brown planthopper, Laodelphax striatellus.</a> GigaScience. 6 (12), 1-12 (2017).</li><li>Van Bel, A. J., Will, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+evaluation+of+proteins+in+watery+and+gel+saliva+of+aphids.">Functional evaluation of proteins in watery and gel saliva of aphids.</a> Frontiers In Plant Science. 7, 1840 (2016).</li><li>Perez-Vilar, J., Hill, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+assembly+of+secreted+mucins.">The structure and assembly of secreted mucins.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (45), 31751-31754 (1999).</li><li>Pitino, M., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aphid+protein+effectors+promote+aphid+colonization+in+a+plant+species-specific+manner.">Aphid protein effectors promote aphid colonization in a plant species-specific manner.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 26 (1), 130-139 (2013).</li><li>Zhang, F., Zhu, L., He, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+expression+in+response+to+brown+planthopper+feeding+in+rice.">Differential gene expression in response to brown planthopper feeding in rice.</a> Journal of Plant Physiology. 161 (1), 53-62 (2004).</li><li>Hogenhout, S. A., Ammar, E. -. D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses.">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li><li>Boissot, N., Schoeny, A., Vanlerberghe-Masutti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vat,+an+amazing+gene+conferring+resistance+to+aphids+and+viruses+they+carry:+from+molecular+structure+to+field+effects.">Vat, an amazing gene conferring resistance to aphids and viruses they carry: from molecular structure to field effects.</a> Frontiers In Plant Science. 7, 1420 (2016).</li></ol>

Framgångsrik uppfödning av insekter på konstgjorda dieter rapporterades först 1962 när Mittler och Dadd beskrev Paraffin-membrantekniken för att hålla en konstgjord diet29,30. Och denna metod har utforskats i många aspekter av insektsbiologi och beteende, till exempel näringstillskott, dsRNA-utfodring och virusförvärv. Baserat på kraven för salivanalys används 5% sackaros som den allmänna konstgjorda kosten för att samla saliv av SBPH i denna stud...

Ris randvirus (RSV), ett negativt strandat RNA-virus i släktet Tenuivirus, orsakar allvarliga sjukdomar i risproduktionen i Östasien1,2,3. Överföring av RSV från infekterade risväxter till friska beror på insektsvektorer, främst Laodelphax striatellus, som överför RSV på ett ihållande förökningssätt. SBPH förvärvar viruset efter utfodring på RSV-infekterade växter. En gång inuti insekten infekterar RSV midgut epitelcellen en dag efter utfodring och passerar sedan genom midgutbarriären för att tränga in i hemolymfen. Därefter sprider sig RSV till olika vävnader via hemolymfen och sprider sig sedan. Efter en latent period på ca 10-14 dagar efter förvärvet kan viruset inuti salivkörteln överföras till de friska värdplantorna via det utsöndrade salivet medan SBPH suger sap från phloem4,5,6,7,8,9,10 . En effektiv utfodringsprocess och olika faktorer i saliven är viktiga för spridningen av RSV från insekten till värdväxten.
Insektssaliv som utsöndras av salivkörtlar tros förmedla insekter, virus och värdväxter. Hemipteran insekter producerar vanligtvis två typer av saliv: gelling saliv och vattnigt saliv11,12,13. Gelling saliv utsöndras huvudsakligen i apoplasman för att upprätthålla rörelsen av stylet bland värdceller och är också relaterad till att övervinna växtresistens och immunsvar14,15,16,17. Vid sonderingsstadiet av utfodring utsöndrar insekter periodvis gelling saliv som omedelbart oxideras för att bilda en ytfläns. Sedan omsluter enstaka eller grenade mantlar stylet för att reservera en rörformad kanal18,19,20. Ytflänsen på epidermis antas underlätta inträngning av stylet genom att fungera som en ankarpunkt, medan mantlar runt stylet kan ge mekanisk stabilitet och smörjning16,21,22,23. Nlshp identifierades som ett viktigt protein för salivary mantlade bildandet och framgångsrik utfodring av brun växthopper (Nilaparvata lugens, BPH). Hämning av uttrycket av det strukturella mantlade proteinet (SHP) som utsöndras av bladlusen Acyrthosiphon pisum minskade dess reproduktion genom att störa utfodring från värdsiktsrör24. Dessutom, i vissa insektsarter, gel salivfaktorer är tänkt att utlösa växten immunsvar genom att bilda så kallade växtätare-associerade molekylära mönster (HAMPs). I N. lugensinducerar NlMLP, ett mucinliknande protein relaterat till mantelbildning, växtförsvar mot utfodring, inklusive celldöd, uttryck för försvarsrelaterade gener och callose deposition 25,26. Vissa gel salivfaktorer i bladlöss har också visat sig utlösa växtförsvarssvar via gen-till-geninteraktioner som liknar patogenassocierade molekylära mönster12,15,27.
För att studera salivfaktorerna som är väsentliga för insektsmatning och / eller patogenöverföring är det nödvändigt att analysera utsöndrat saliv. Här beskrivs artificiella utfodrings- och insamlingsmetoder för att få tillräckliga mängder saliv för vidare analys. Med hjälp av ett medium som endast innehåller ett enda näringsämne samlades många salivproteiner in och analyserades av silverfärgning och västerländsk blotting. Denna metod kommer att vara till hjälp i ytterligare forskning om faktorer i saliv som är väsentliga för RSV överföring av SBPH.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10-KD centrifugal filter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>R5PA83496</td>
			<td>For concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Protein Transfer Buffer(wet)</td>
			<td>macGENE</td>
			<td>MP008</td>
			<td>Transfer buffer for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x TBST buffer</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>SL1328-500mL&#215;10</td>
			<td>Wash buffer for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azure c600 biosystems</td>
			<td>Azure Biosystems</td>
			<td>Azure c600</td>
			<td>Imaging system for western blotting and silver staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Color Prestained protein ladder</td>
			<td>GenStar</td>
			<td>M221-01</td>
			<td>Protein marker for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL&#160;western blotting detection reagents</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN2209</td>
			<td>Western blotting detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enchanced HRP-DAB Chromogenic Kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>#PA110</td>
			<td>Chromogenic reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>401393-2ML</td>
			<td>Polyclonal secondary antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon(R)-P Polyvinylidene difluoride membrane</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Transfer membrane for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1725125</td>
			<td>For quantitative real-time PCR (qRT-PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHES</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708891</td>
			<td>For Reverse-transcriptional PCR (RT-PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Filter, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td>For filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAB TGX Gels</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561043</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONEC-W</td>
			<td>Detection of protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon membrane</td>
			<td>PALL</td>
			<td>T42754</td>
			<td>Membrane for dot-ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M Membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>Making artifical diet sandwichs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-LssgMP polyclonal antibody against LssgMP peptides</td>
			<td>Genstript</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit primary anti-LssgMP polyclonal antibody for western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-RSV polyclonal antibody</td>
			<td>Genstript</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit primary anti-RSV polyclonal antibody for western blotting and dot-ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAprep pure Micro Kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>DP420</td>
			<td>For RNA Extraction</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-layered membrane sandwich method for laodelphax striatellus saliva collection

Ris randvirus (RSV), som orsakar betydande ekonomisk förlust av jordbruket i Östasien, beror helt på insektsvektorer för dess effektiva överföring bland värdris. Laodelphax striatellus (liten brun växthoppa, SBPH) är den primära insektsvektorn som horisontellt överför RSV medan du suger sap från phloem. Saliv spelar en viktig roll i insekternas utfodringsbeteende. En bekväm metod som kommer att vara användbar för forskning om insekters saliv med piercingsugande utfodringsbeteende beskrivs här. I denna metod tilläts insekter att mata på en konstgjord diet inklämd mellan två sträckta paraffinfilmlager. Dieten som innehåller saliven samlades in varje dag, filtrerades och koncentrerades för vidare analys. Slutligen undersöktes kvaliteten på insamlade saliv genom proteinfärgning och immunoblotting. Denna metod exemplifierades genom att upptäcka förekomsten av RSV och ett mucin-liknande protein i saliv av SBPH. Dessa konstgjorda utfodrings- och salivsamlingsmetod kommer att lägga en grund för ytterligare forskning om faktorer i insektssaliv relaterade till utfodringsbeteende och virusöverföring.

Scheman för artificiell utfodring installation och saliv samling Figur 1A föreställer den glascylinder (15 cm x 2,5 cm) som används som matkammare för att samla saliven. För det första svalt SBPH larverna i flera timmar för att förbättra insamlingseffektiviteten och immobiliserades sedan genom kylning i 5 min. Efter att insekterna överfördes till glascylindern täcktes båda öppna ändarna av kammaren med sträckt Paraffinmembran. I ena änden var 200 μL 5% ...

Watch this Scientific Journal Video about Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection at JoVE.com

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

Det nuvarande protokollet beskriver en metod för att samla tillräckligt med saliv från piercing-sugande insekter med hjälp av ett artificiellt medium. Detta är en bekväm metod för att samla insektssaliv och studera salivfunktion på insektsmatningsbeteende och vektorburen virusöverföring.

Membransmörgåsmetod i två lager för Laodelphax striatellus salivsamling

Rice stripe virus (RSV), which causes significant economic loss of agriculture in East Asia, entirely depends on insect vectors for its effective ...

Artificiell utfodring och salivsamling ger en direkt metod för att upptäcka effektorer i insektssaliv. Detta har dock inte beskrivits i detalj tidigare. Detta protokoll är effektivt för salivsamling från saprofytiska insekter.Dessutom är det en enkel teknik, eftersom vi använder medium som bara innehåller sackaros som en konstgjord diet. Saprofytiska insekters saliv kan påverka mot värdens immunsystem för att gynna utfodringsbeteendet och överföra patogener. Detta läkemedel som kan användas för insektsbeteende och insektsbenvägsforskning.Detta är en enkel metod att utföra. Detta tyder dock på att den rena experimentella miljön ökar när saliv samlas in för vidare forskning. Börja med att förbereda en 5% sackaroslösning för den konstgjorda kosten och filtrera lösningen genom ett 0,22 mikronfilter för att avlägsna bakteriell förorening och föroreningar.Svält cirka 200 små bruna växthopper larver i tre till fem timmar innan du introducerar dem i en utfodringskammare. Därefter, för att förbereda glascylindrarna som matkammare, täck en öppen ände av kammaren med ett paraffinmembran innan du introducerar de experimentella insekterna, överför sedan insekterna till glascylindern och täck den andra änden av kammaren med sträckt paraffinmembran. Tillsätt 200 mikroliter konstgjord kost på membranet och täck sedan vätskan med ett annat lager av sträckt paraffinmembran.Slutligen täck kammaren med aluminiumfolie och lämna änden med den konstgjorda dietanordningen utsatt för ljuset. Efter 24 timmar samlar du SBPH-saliven genom att kyla cylindern vid fyra grader Celsius för att immobilisera insekterna, avslöja sedan den yttre filmen och samla den konstgjorda kosten i 1,5 milliliter sterila rör med en steril pipett. Håll det insamlade salivet på minus 80 grader Celsius tills analysen.Skölj sedan det inre membranet med 50 mikroliter färsk konstgjord kost tre gånger genom att pipettera mjukt och samla den konstgjorda tvättdieten i 1,5 ml sterila rör. Efter de tre sköljningarna, tillsätt färsk konstgjord kost på det inre membranet och placera ett nysträckt paraffinmembran ovanpå. Filtrera slutligen de insamlade proverna genom en 0,22 mikron filterenhet för att avlägsna mikrober och andra föroreningar.Överför de kollektiva salivproverna i ett 500 mikroliter, 10 kilodalton centrifugalfilter. Centrifugera provet. Samla supernatanten och ta upp den slutliga volymen till 100 mikroliter.För att mäta koncentrationen av det insamlade salivet, slå på DEN UV-synliga spektrofotometern och tvätta piedestalerna tre gånger med dubbeldestillerat vatten. Välj alternativen på skärmen i följande ordning, proteiner, protein A280. Välj typ och en absorbansenhet som motsvarar ett milligram per milliliter.Markera sedan rutan för baslinjekorrigering, 340 nanometer. Ladda sedan två mikroliter med 5% sackarosvattenlösning som tom och tryck sedan på Blank längst ner på skärmen. Slutligen, efter att ha satt standarderna, ladda två mikroliter av det insamlade salivet och registrera proteinkoncentrationen.Vid utfodring på 5%sackaros överlevde mer än 80% av SBPH under de första fyra dagarna. Men från den femte dagen och framåt ökade dödligheten snabbt till 40%och på den sjunde dagen överlevde mindre än hälften av SBPH. En SDS-sidanalys visade att de koncentrerade salivproverna från RSV-infekterade SBPH saliv innehöll många fler proteiner än den 5%sackaros negativa kontrollen.I en västerländsk fläckanalys för detektion av RSV-kapsidproteinet, en icke-infekterad och viruliferous insekter. RSV capsid proteinet upptäcktes framgångsrikt i viruliferous provet, en antikropp utformad mot LssgMP genprodukten upptäckte en 78 kilodalton protein i icke-infekterade och viruliferous prover, visar att LssgMP är ett salivprotein. En QRT PCR analys av LssgMP transkription nivåer i olika vävnader visade att Lssg transkription nivåer i salivary körtel var 20-faldig högre än i hela kroppen och tarmen, bekräftar det specifika uttrycket av LssgMP i salivary körtel.Att svälta de experimentella insekterna innan de introduceras i kammaren är nödvändigt för att säkerställa effektiviteten i vår salivsamling. Dessutom bör ett artificiellt medium samlas in och bytas ut var 24:e timme för att minska mikrobiell kontaminering i det insamlade provet. Denna teknik ger en direkt metod för att studera salivens funktion vid överföring av patogener.Dessutom kan det hjälpa till att studera insektspatogen värdinteraktion.

Research

JoVE Journal

Biology

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Kristalliserande Membrane proteiner för strukturbestämning med Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Hög genomströmning Kristallisering av membranproteiner Använda Lipidic Bicelle Metod

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

Blodinsamling för biokemisk analys i vuxen Zebrafish

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Användning av en robot för hög kapacitet Kristallisering av membranproteiner i lipidisk mesofaser

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Avverkning och Cryo-kylning Kristaller av membranproteiner som odlas i lipida mesofaser för strukturbestämning genom Makromolekylär kristallografi

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation

En praktisk och ny metod att extrahera genomisk DNA från Kits blodinsamling för Plasma Protein Preservation

Laboratory tests can be done on the cellular or  fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes  determines the portion of the ...

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Insamling och analys av<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Phloem utsöndringar Använda EDTA-underlättas Metod

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Mikroperfusionskammarens Teknik för att undersöka Reglering av mikrokärls permeabilitet i Rat krös

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish

Upprepad Blood Collection för Blodprov i vuxen Zebrafish

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Grundtillståndet utarmning super resolution Imaging i däggdjursceller

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...