Name: user-friendly, high-throughput, and fully automated data acquisition software for single-particle cryo-electron microscopy
Uploaded: 2021-07-29T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about User-friendly, High-throughput, and Fully Automated Data Acquisition Software for Single-particle Cryo-electron Microscopy at JoVE.com

نعترف بإدارة التكنولوجيا الحيوية، وإدارة العلوم والتكنولوجيا (DST) والعلوم، ووزارة تنمية الموارد البشرية (MHRD)، الهند، للتمويل ومرفق التبريد والتبريد في IISc-Bangalore. نعترف ببرنامج DBT-BUILDER (BT/INF/22/SP22844/2017) وDST-FIST (SR/FST/LSII-039/2015) لمنشأة Cryo-EM الوطنية في IISc، بنغالور. نعترف بالدعم المالي المقدم من مجلس البحوث العلمية والهندسية (SERB) (المنحة رقم SB/S2/RJN-145/2015، SERB-EMR/2016/000608 وSrb-IPA/2020/000094)، DBT (المنحة رقم BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). نشكر السيدة إيشيكا برامانيك على إعداد شبكات التبريد و EM وجمع بيانات cryo-EM وإعداد جدول المواد. كما نشكر السيد سومان ميشرا على معالجة الصور بالتبريد ومساعدتنا في إعداد الأرقام. نشكر البروفيسور راغافان فاراداراجان لمساعدتنا في الحصول على عينة بروتين سبايك النقية لهذه الدراسة.

ملاحظة: هناك حاجة إلى ثلاث خطوات مهمة لجمع البيانات cryo-EM: 1. إعداد شبكة cryo-EM، 2. معايرة ومحاذاة المجهر، 3. جمع البيانات التلقائي (الشكل 1). وعلاوة على ذلك، يتم تقسيم جمع البيانات الآلي إلى أ. اختيار منطقة مناسبة، ب. التحسين من Latitude-S، ج. بدء اختيار ثقب التلقائي، و د. بدء الحصول التل...

<ol>
	<li>Li, Y., Cash, J. N., Tesmer, J. J. G., Cianfrocco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+cryo-EM+enabled+by+user-free+preprocessing+routines.">High-throughput cryo-EM enabled by user-free preprocessing routines.</a> Structure. 28 (7), 858-869 (2020).</li><li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+An+automated+system+for+acquisition+of+images+from+vitreous+ice+specimens.">Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens.</a> Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).</li><li>Stagg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+cryoEM+data+acquisition+and+analysis+of+284+742+particles+of+GroEL.">Automated cryoEM data acquisition and analysis of 284 742 particles of GroEL.</a> Journal of Structural Biology. 155 (3), 470-481 (2006).</li><li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+in+electron+microscopy-30+years.">Single-particle reconstruction of biological macromolecules in electron microscopy-30 years.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 42 (3), 139-158 (2009).</li><li>Biyani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focus:+The+interface+between+data+collection+and+data+processing+in+cryo-EM.">Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM.</a> Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).</li><li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution.">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).</li><li>K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+resolution+revolution.">The resolution revolution.</a> Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).</li><li>McMullan, G., Chen, S., Henderson, R., Faruqi, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detective+quantum+efficiency+of+electron+area+detectors+in+electron+microscopy.">Detective quantum efficiency of electron area detectors in electron microscopy.</a> Ultramicroscopy. 109 (9), 1126-1143 (2009).</li><li>Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MotionCor2:+Anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy.">MotionCor2: Anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).</li><li>Grant, T., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+optimal+exposure+for+single+particle+cryo-EM+using+a+2.6+&#197;+reconstruction+of+rotavirus+VP6.">Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 &#197; reconstruction of rotavirus VP6.</a> eLife. 4, 06980 (2015).</li><li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+Implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FREALIGN:+High-resolution+refinement+of+single+particle+structures.">FREALIGN: High-resolution refinement of single particle structures.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CryoSPARC:+Algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CisTEM,+user-friendly+software+for+single-particle+image+processing.">CisTEM, user-friendly software for single-particle image processing.</a> eLife. 7, 35383 (2018).</li><li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>Zhang, P., Beatty, A., Milne, J. L. S., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+data+collection+with+a+Tecnai+12+electron+microscope:+Applications+for+molecular+imaging+by+cryomicroscopy.">Automated data collection with a Tecnai 12 electron microscope: Applications for molecular imaging by cryomicroscopy.</a> Journal of Structural Biology. 135 (3), 251-261 (2001).</li><li>Lei, J., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+acquisition+of+cryo-electron+micrographs+for+single+particle+reconstruction+on+an+FEI+Tecnai+electron+microscope.">Automated acquisition of cryo-electron micrographs for single particle reconstruction on an FEI Tecnai electron microscope.</a> Journal of Structural Biology. 150 (1), 69-80 (2005).</li><li>Potter, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+A+system+for+fully+automated+acquisition+of+1000+electron+micrographs+a+day.">Leginon: A system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day.</a> Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+molecular+microscopy:+The+new+Leginon+system.">Automated molecular microscopy: The new Leginon system.</a> Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).</li><li>Korinek, A., Beck, F., Baumeister, W., Nickell, S., Plitzko, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+controlled+cryo-electron+microscopy+-+TOM2+a+software+package+for+high-throughput+applications.">Computer controlled cryo-electron microscopy - TOM2 a software package for high-throughput applications.</a> Journal of Structural Biology. 175 (3), 394-405 (2011).</li><li>Shi, J., Williams, D. R., Stewart, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Script-Assisted+Microscopy+(SAM)+package+to+improve+data+acquisition+rates+on+FEI+Tecnai+electron+microscopes+equipped+with+Gatan+CCD+cameras.">A Script-Assisted Microscopy (SAM) package to improve data acquisition rates on FEI Tecnai electron microscopes equipped with Gatan CCD cameras.</a> Journal of Structural Biology. 164 (1), 166-169 (2008).</li><li>Marsh, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+software+platform+for+low-dose+electron+microscopy+and+tomography.">Modular software platform for low-dose electron microscopy and tomography.</a> Journal of Microscopy. 228, 384-389 (2007).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JADAS:+A+customizable+automated+data+acquisition+system+and+its+application+to+ice-embedded+single+particles.">JADAS: A customizable automated data acquisition system and its application to ice-embedded single particles.</a> Journal of Structural Biology. 165 (1), 1-9 (2009).</li><li>Pramanick, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+flexibility+and+structural+variability+of+SARS-CoV2+S+protein.">Conformational flexibility and structural variability of SARS-CoV2 S protein.</a> Structure. , (2021).</li><li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+neutralization+of+SARS-CoV-2+by+an+antibody+from+a+convalescent+patient.">Structural basis for the neutralization of SARS-CoV-2 by an antibody from a convalescent patient.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 27 (10), 950-958 (2020).</li><li>Hillen, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+replicating+SARS-CoV-2+polymerase.">Structure of replicating SARS-CoV-2 polymerase.</a> Nature. 584 (7819), 154-156 (2020).</li><li>Wrapp, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+2019-nCoV+spike+in+the+prefusion+conformation.">Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation.</a> Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).</li><li>Thoms, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+translational+shutdown+and+immune+evasion+by+the+Nsp1+protein+of+SARS-CoV-2.">Structural basis for translational shutdown and immune evasion by the Nsp1 protein of SARS-CoV-2.</a> Science. 369 (6508), 1249-1255 (2020).</li><li>Kumar, A., Sengupta, N., Dutta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+approach+for+preparing+graphene+oxide+tem+grids+for+stained+and+vitrified+biomolecules.">Simplified approach for preparing graphene oxide tem grids for stained and vitrified biomolecules.</a> Nanomaterials. 11 (3), 1-22 (2021).</li></ol>

Latitude-S هي واجهة مستخدم بديهية ، والتي توفر بيئة لإعداد وجمع الآلاف من الصور الدقيقة عالية الدقة أو ملفات الأفلام تلقائيا في يومين. ويوفر سهولة الملاحة عبر الشبكات ويحافظ على موقف مرحلة المجهر في حين أنه ينتقل من التكبير المنخفض إلى التكبير عالية. كل خطوة من خطوات الحصول على البيانات مع Latitud...

أصبح cryo-EM أحادي الجسيمات تقنية بيولوجية هيكلية سائدة لتحديد البنية عالية الدقة للجزيئات الجزيئية البيولوجية1. تعتمد إعادة بناء الجسيمات المفردة على الحصول على عدد كبير من الصور الدقيقة للعينات المهتزة لاستخراج صور الجسيمات ثنائية الأبعاد (ثنائية الأبعاد) ، والتي تستخدم بعد ذلك لإعادة بناء بنية ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) للجزيئات الجزيئية البيولوجية2،3. قبل تطوير DEDs، تراوحت الدقة التي تم تحقيقها من إعادة بناء جسيم واحد بين 4 و 30 Å4،5. في الآونة الأخيرة ، وصلت الدقة القابلة للتحقيق من cryo-EM أحادية الجسيمات إلى ما بعد 1.8 Å6. وكانت DED وبرامج الحصول الآلي على البيانات من المساهمين الرئيسيين في ثورة القرار هذه7 ، حيث التدخل البشري لجمع البيانات هو الحد الأدنى. عموما، يتم إجراء التصوير بالتبريد م بمعدلات جرعة الإلكترون منخفضة (20-100 e/Å2) لتقليل الأضرار الإشعاعية الناجمة عن شعاع الإلكترون من العينات البيولوجية، مما يساهم في انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) في الصورة. ويعوق هذا ال SNR المنخفض توصيف الهياكل عالية الاستبانة للجزيئات الجزيئية البيولوجية باستخدام تحليل جسيم واحد.
الجيل الجديد من أجهزة الكشف عن الإلكترونات هي أجهزة الكشف عن CMOS (التكميلية لأكسيد المعادن أشباه الموصلات) ، والتي يمكن التغلب على هذه العقبات المنخفضة المتعلقة SNR. تسمح كاميرات CMOS للكشف المباشر هذه بقراءة سريعة للإشارة ، والتي تساهم الكاميرا بسببها في وظيفة انتشار أفضل للنقاط ، وSNR مناسبة ، وكفاءة كمية ممتازة للمحققين (DQE) للجزيئات الكبيرة البيولوجية. توفر كاميرات الكشف المباشر SNR8 عالية وضوضاء منخفضة في الصور المسجلة ، مما يؤدي إلى زيادة كمية في كفاءة الكم المخبر (DQE) - وهو مقياس لمقدار الضوضاء التي يضيفها الكاشف إلى الصورة. هذه الكاميرات أيضا تسجيل الأفلام بسرعة مئات الإطارات في الثانية الواحدة، والتي تمكن من الحصول على البيانات بسرعة9،10. كل هذه الخصائص تجعل كاميرات الكشف المباشر السريع مناسبة لتطبيقات الجرعة المنخفضة.
تستخدم صور المكدس المصححة بالحركة لمعالجة البيانات لحساب التصنيف ثنائي الأبعاد وإعادة بناء خريطة كثافة ثلاثية الأبعاد للجزيئات الكبيرة باستخدام حزم برامج مختلفة مثل RELION11 وFREALIGN12 و cryoSPARC13 و cisTEM14 و EMAN215. ومع ذلك، بالنسبة لتحليل الجسيمات المفردة، هناك حاجة إلى مجموعة بيانات هائلة لتحقيق بنية عالية الدقة. ولذلك، فإن رسوم اكتساب البيانات التلقائية ضرورية للغاية لجمع البيانات. لتسجيل مجموعات بيانات cryo-EM كبيرة، تم استخدام العديد من حزم البرامج على مدى العقد الماضي. تم تطوير حزم برامج مخصصة، مثل AutoEM16 و AutoEMation17 و Leginon18 و SerialEM19 و UCSF-Image420 و TOM221 و SAM22 و JAMES23 و JADAS24 و EM-TOOLS و EPU، للحصول الآلي على البيانات.
تستخدم حزم البرامج هذه المهام الروتينية للعثور على مواقع الثقب تلقائيا من خلال ربط صور التكبير المنخفض بصور التكبير العالي ، مما يساعد في تحديد الثقوب ذات الجليد الزجاجي من سمك الجليد التكبيري للحصول على الصورة في ظل ظروف الجرعة المنخفضة. وقد خفضت هذه الحزم من البرامج عدد المهام المتكررة وزادت من الإنتاجية لجمع البيانات cryo-EM من خلال الحصول على كمية كبيرة من البيانات ذات نوعية جيدة لعدة أيام بشكل مستمر، دون أي انقطاع ووجود مادي للمشغل. Latitude-S هي حزمة برامج مماثلة، والتي تستخدم للحصول التلقائي على البيانات لتحليل الجسيمات المفردة. ومع ذلك ، فإن حزمة البرامج هذه مناسبة فقط لأجهزة الإزالة ال دي دي K2/K3 ويتم تزويدها بهذه الكاشفات.
يوضح هذا البروتوكول إمكانات Latitude-S في الحصول الآلي على صورة بروتين ارتفاع السارس-CoV-2 مع كاشف إلكترون مباشر مجهز ب 200 كيلو فولت كريو-م (انظر جدول المواد). باستخدام هذه الأداة لجمع البيانات ، يتم الحصول تلقائيا على 3000 ملف فيلم من بروتين ارتفاع السارس-CoV-2 ، ويتم إجراء المزيد من معالجة البيانات للحصول على بنية بروتين ارتفاع 3.9-4.4 Å.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blotting paper</td>
			<td>Ted Pella, INC.</td>
			<td>47000-100</td>
			<td>EM specimen preparation item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capsule</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>9432 909 97591</td>
			<td>EM specimen preparation unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1020863</td>
			<td>EM specimen preparation unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Clip</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036171</td>
			<td>EM specimen preparation item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Clip Insertion Tool</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>9432 909 97571</td>
			<td>EM specimen preparation tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Clip Ring</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036173</td>
			<td>EM specimen preparation item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM grid (Quantifoil)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Q3100AR1.3</td>
			<td>R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow discharge Machine</td>
			<td>Quorum</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Quorum GlowQube glow discharge machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 DED</td>
			<td>Gatan Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Cryo-EM data collection device (Camera)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latitude S Software</td>
			<td>Gatan Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading station</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1130698</td>
			<td>EM specimen preparation unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos 200 kV Arctica</td>
			<td>Thermo Scientific&#8482;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Cryo-Electron Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>EM specimen preparation unit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

user-friendly, high-throughput, and fully automated data acquisition software for single-particle cryo-electron microscopy

في السنوات القليلة الماضية، مهدت التطورات التكنولوجية والمنهجية في المجهر أحادي الجسيمات للإلكترونات المبردة (cryo-EM) طريقا جديدا لتحديد البنية عالية الدقة للجزيئات الكبيرة البيولوجية. على الرغم من التقدم الملحوظ في cryo-EM ، لا يزال هناك مجال للتحسين في جوانب مختلفة من سير عمل تحليل الجسيمات الواحدة. يتطلب تحليل الجسيمات المفردة حزمة برامج مناسبة للحصول التلقائي على البيانات عالية الإنتاجية. تم تطوير العديد من حزم برامج الحصول التلقائي على البيانات للتصوير التلقائي للجسيمات المفردة cryo-EM في السنوات الثماني الماضية. تقدم هذه الورقة تطبيقا لخط أنابيب مؤتمت بالكامل للحصول على صورة للجزيئات الحيوية المهتزة في ظروف الجرعة المنخفضة. 
وهو يوضح حزمة من البرامج ، والتي يمكن جمع البيانات cryo - EM تماما ، تلقائيا ، وعلى وجه التحديد. بالإضافة إلى ذلك، يتم التحكم بسهولة المعلمات المجهرية المختلفة من قبل هذه الحزمة من البرامج. يوضح هذا البروتوكول إمكانات حزمة البرامج هذه في التصوير الآلي للبروتين عالي الارتفاع 2 (SARS-CoV-2) من متلازمة الالتهاب الرئوي الحاد الحاد (SARS-CoV-2) مع مجهر إلكتروني كريو 200 كيلو فولت مجهز بكاشف إلكترون مباشر (DED). تم الحصول على حوالي 3000 صورة فيلم cryo-EM في جلسة واحدة (48 ساعة) من جمع البيانات ، مما أسفر عن بنية تحليل ذري للبروتين المرتفع من السارس-CoV-2. وعلاوة على ذلك، تشير هذه الدراسة الهيكلية إلى أن البروتين ارتفاع يعتمد اثنين من الامتثالات الرئيسية، 1-RBD (مجال ملزم المستقبلات) مفتوحة وجميع RBD أسفل الامتثال مغلقة.

وفي ظل الوضع الحالي للجائحة، تلعب منظمة التبريد والطوارئ دورا رئيسيا في توصيف هياكل مختلف البروتينات من السارس-COV-226,27,28,29، والتي قد تساعد في تطوير اللقاحات والأدوية المضادة للفيروس. هناك حاجة ملحة لجهود بحثية سريعة الخ...

Watch this Scientific Journal Video about User-friendly, High-throughput, and Fully Automated Data Acquisition Software for Single-particle Cryo-electron Microscopy at JoVE.com

User-friendly, High-throughput, and Fully Automated Data Acquisition Software for Single-particle Cryo-electron Microscopy

يتطلب المجهر أحادي الجسيمات cryo-electron حزمة برامج مناسبة وخطوط أنابيب سهلة الاستخدام للحصول على البيانات التلقائية عالية الإنتاجية. هنا، نقدم تطبيق حزمة برامج اقتناء الصور المؤتمتة بالكامل، Latitude-S، وخط أنابيب عملي لجمع البيانات من الجزيئات الحيوية المهتزة في ظل ظروف جرعة منخفضة.

سهلة الاستخدام، عالية الإنتاجية، والآلية بالكامل برنامج الحصول على البيانات للجسيمات واحد Cryo-الإلكترون المجهر

In the past several years, technological and methodological advancements in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) have paved a new avenue for ...

برنامج الحصول الآلي على البيانات ضروري للغاية لجمع كمية هائلة من البيانات cryo لتوصيف الهيكلية لل macromoleculess البيولوجية. تم استخدام حزمة برامج الحصول الآلي على البيانات هنا لتوصيف بنية مختلف الماكروموليكوليس البيولوجية ، والتي ترتبط مباشرة مع بيولوجيا مسببات الأمراض. على سبيل المثال، البكتيريا الفطرية وفيروس نقص المناعة البشرية وSASCO 2.لتبدأ ، بدء خط العرض - S برنامج الحصول على البيانات الآلية من خلال النقر على DigitalMicrograph من قائمة البداية. بعد ذلك، حدد إدارة التقنيات، ثم رمز Latitude-S لجمع البيانات التلقائية أحادية الجسيمات. لإنشاء جلسة عمل استنادا إلى إعدادات جلسة العمل السابقة، حدد خانة الاختيار استنادا إلى جلسة العمل السابقة في لوح الألوان، ثم حدد الزر الجديد أو لمتابعة جلسة عمل موجودة، اضغط على زر المتابعة.لبدء جلسة عمل جديدة تماما، انقر على علامة التبويب الجديدة في لوحة الألوان. اختر المجلد الذي يحتوي على جلسة العمل التي سيتم المتابعة وحدد المجلد لحفظ البيانات. بعد ذلك، انقر فوق رمز الإعداد وفي مربع استكشاف الحالة المدارة الذي يظهر، وإضافة الحالة، وتعيين شرط TEM، وحالة الكاميرا، والصورة أو خيار المخزون.ثم قم بتسمية الحالة أو افتح ملخص إعداد الحالة لفتح إعدادات الحفظ. بعد ذلك، قم بتكوين حالة أطلس بالنقر فوق لوحة حالة أطلس وتعيين معلمات التكبير وظروف الإضاءة ووقت تعرض الكاميرا، وانقر فوق التالي للانتقال إلى الحالة التالية. ثم قم بتكوين حالة الشبكة بالنقر على لوحة حالة الشبكة، ثم قم بتعيين معلمات بصريات التصوير بالمجهر وظروف الإضاءة ووقت تعرض الكاميرا، وانقر على التالي.تكوين حالة ثقب عن طريق النقر على لوحة حفرة وتعيين البصريات التصوير، وظروف الإضاءة، binning والمعلمات الوقت التعرض الكاميرا. بعد النقر على التالي، قم بتكوين حالة التركيز التالية بالنقر على لوحة التركيز وتعيين إعدادات المجهر للتصوير البصريات وظروف الإضاءة ووقت التعرض للكاميرا. ثم ركز على منطقة الكربون غير المتبلورة بالقرب من الحفرة وانقر بجوار للانتقال إلى الحالة التالية.تكوين حالة البيانات عن طريق النقر على لوحة البيانات وتعيين المعلمات لإعدادات المجهر، ثم انقر على التالي. انقر على لوحة تكوين التركيز لتحديد نطاق قيم defocus وحجم الخطوة في علامة التبويب المحددة واضغط على الزر التالي للانتقال إلى الخطوة التالية. التركيز على الميزات المطلوبة على الشبكة وانقر على زر التقاط.ثم ضع علامة الصليب الأحمر على نفس الميزة على كل صورة من حالات مختلفة. ابدأ بحالات التركيز والبيانات والثقب، لأن مجال الرؤية أكبر من حالات أطلس والشبكة. بعد ذلك، قم بتكبير حالات Atlas و Grid لوضع علامة الصليب الأحمر على نفس الميزة.لحساب المواضع والإزاحة بين كل حالة من الحالات الخمس المختلفة وعكس المواضع والإزاحات إلى إطار الإخراج، انقر فوق زر الحساب. انقر على لوحة التقاط واختيار حجم أطلس لتغطية الشبكة بأكملها أو جزء من الشبكة على أساس الشرط. لالتقاط الأطلس، انتقل على الأطلس وحدد مربع الشبكة استنادا إلى سمك الجليد.بمجرد تحديد مربعات الشبكة المطلوبة ، انقر على زر الجدول الزمني ولاحظ المربعات في مربع الشبكة تملأ كما يتم التقاط كل مربع الشبكة. بمجرد النقر فوق الزر الجدولة حدد ثقب تمثيلي في مربع الشبكة عن طريق إضافة موضع الفتحة. بمجرد الحصول على صورة الثقب، حدد البيانات ومواضع التركيز واحفظ التخطيط كقالب.انقر على البحث التلقائي، أدخل حجم الحفرة، وانقر على زر البحث في البرنامج للعثور تلقائيا على الثقوب على أساس القطر. إعداد كثافة لإزالة الثقوب من مربع الشبكة وتلوث الجليد. وبعد إضافة أدوات العلامة المحددة والصفراء من خلال البحث التلقائي ، انقر على زر الجدولة في مهام خط العرض.ووفقا للفحص اليدوي الأولي للصور الدقيقة المصححة للحركة باستخدام برنامج cisTEM، تبين أن معظم البيانات تقع ضمن نطاق الإشارة المطلوب. بالإضافة إلى ذلك ، تم فحص الصور التي تم جمعها في نطاقات defocus ، يدويا من قبل cisTEM. تم اختيار جزيئات الارتفاع يدويا لحساب متوسطات الفئة 2D للتصور الهيكلي ، مما اقترح بقوة ، ولكن كان من الممكن تحديد توصيف هيكلي عالي الدقة باستخدام مجموعة البيانات المعنية.وأشار تصنيف 3D أن سبايك بروتين لديه 1RBD في تأكيد مفتوح وجميع RBD أخرى في أسفل تأكيد وثيق. تم إعادة بناء 1RBD حتى تأكيدات مفتوحة من بروتين سبايك باستخدام التماثل C1. يتم تمثيل خريطة بروتين سبايك في وجهات النظر العلوية والسفلية الجانبية.وخريطة EM مزودة ببنية ذرية لتصور أفضل للسلاسل الجانبية. تم تحسين تأكيدات إغلاق RBD أسفل مع التماثل C3 والنموذج المكرر 3D ارتفاع وخريطة EM، مزودة بنية ذرية كما هو مبين. وأكد وسيطة من بروتين سبايك التي تم تحديدها على أنها المجال الفرعي S2 أشار إلى السلاسل الجانبية لمخلفات الأحماض الأمينية الفردية.وتشير النتائج إلى أن خط العرض-S يمكن أن يجمع بيانات عالية الدقة من الجزيئات الكبيرة البيولوجية. يمكن استخدام برنامج جمع البيانات الآلي هذا لأي نظام مجهر إلكتروني آخر لجمع البيانات تلقائيا.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

تحديد الهياكل الجزيئية لفيروس نقص المناعة البشرية جليكوبروتينات مغلف باستخدام البرد الكترون والتصوير المقطعي الآلي متوسط ​​الفرعية صورة مقطعية

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

هيكل HIV - 1 بواسطة جمعيات قفيصة البرد المجهر الإلكتروني وتكرارية حلزوني الإعمار الحقيقي الفضاء

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

تعيش خلية من التصوير<emالعصوية الرقيقة> و العقدية الرئوية الآلي باستخدام الميكروسكوب مرور الزمن

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

الإنتاجية العالية لطريقة الكشف عن فيروس الإنفلونزا

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

الكمية عالي الإنتاجية الفحص السمسة وحيدة الخلية لخلايا T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

الإنتاجية العالية للفحص واسع الطيف الكيميائية مثبطات الحمض النووي الريبي الفيروسات

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

تقنية عالية الإنتاجية فلوروميتريك تقييم بلعم البلعمة وأكتين البلمرة

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

فحوصات القائم على الفحص المجهري لفحص عالية الإنتاجية من العوامل المضيفة المعنية في<em&gt; البروسيلا</em&gt; إصابة خلايا هيلا

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

الإنتاجية العالية جين توصيف في<em&gt; المثقبية البروسية</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

منصة الفائق لفحص السالمونيلا spp./دوسنتاريا spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...