Name: user-friendly, high-throughput, and fully automated data acquisition software for single-particle cryo-electron microscopy
Uploaded: 2021-07-29T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about User-friendly, High-throughput, and Fully Automated Data Acquisition Software for Single-particle Cryo-electron Microscopy at JoVE.com

Vi anerkender Department of Biotechnology, Department of Science and Technology (DST) og Science, og Ministry of Human Resource Development (MHRD), Indien, for finansiering og cryo-EM facilitet på IISc-Bangalore. Vi anerkender DBT-BUILDER Program (BT/INF/22/SP22844/2017) og DST-FIST (SR/FST/LSII-039/2015) for National Cryo-EM facilitet på IISc, Bangalore. Vi anerkender finansiel støtte fra Science and Engineering Research Board (SERB) (Grant No.-SB/S2/RJN-145/2015, SERB-EMR/2016/000608 og SERB-IPA/2020/000094), DBT (bevilling nr. BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). Vi takker Ms Ishika Pramanick for at forberede cryo-EM gitre, cryo-EM dataindsamling, og forberede tabellen over materialer. Vi takker også Mr. Suman Mishra for cryo-EM billedbehandling og for at hjælpe os med at forberede tallene. Vi takker Prof. Raghavan Varadarajan for at hjælpe os med at få den rensede spike proteinprøve til denne undersøgelse.

BEMÆRK: Der kræves tre vigtige trin til indsamling af cryo-EM-dataindsamling: 1. kryo-EM-gitterforberedelse, 2. kalibrering og justering af mikroskopet, 3. automatisk dataindsamling (figur 1). Desuden er automatiseret dataindsamling opdelt i a. passende områdevalg, b. optimering af Latitude-S, c. start automatisk hulvalg og d. start automatisk dataindsamling (figur 1).
1. Kryo-EM-gitterforberedelse og prøveindlæsning til automatisk...

<ol>
	<li>Li, Y., Cash, J. N., Tesmer, J. J. G., Cianfrocco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+cryo-EM+enabled+by+user-free+preprocessing+routines.">High-throughput cryo-EM enabled by user-free preprocessing routines.</a> Structure. 28 (7), 858-869 (2020).</li><li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+An+automated+system+for+acquisition+of+images+from+vitreous+ice+specimens.">Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens.</a> Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).</li><li>Stagg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+cryoEM+data+acquisition+and+analysis+of+284+742+particles+of+GroEL.">Automated cryoEM data acquisition and analysis of 284 742 particles of GroEL.</a> Journal of Structural Biology. 155 (3), 470-481 (2006).</li><li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+in+electron+microscopy-30+years.">Single-particle reconstruction of biological macromolecules in electron microscopy-30 years.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 42 (3), 139-158 (2009).</li><li>Biyani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focus:+The+interface+between+data+collection+and+data+processing+in+cryo-EM.">Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM.</a> Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).</li><li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution.">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).</li><li>K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+resolution+revolution.">The resolution revolution.</a> Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).</li><li>McMullan, G., Chen, S., Henderson, R., Faruqi, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detective+quantum+efficiency+of+electron+area+detectors+in+electron+microscopy.">Detective quantum efficiency of electron area detectors in electron microscopy.</a> Ultramicroscopy. 109 (9), 1126-1143 (2009).</li><li>Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MotionCor2:+Anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy.">MotionCor2: Anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).</li><li>Grant, T., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+optimal+exposure+for+single+particle+cryo-EM+using+a+2.6+&#197;+reconstruction+of+rotavirus+VP6.">Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 &#197; reconstruction of rotavirus VP6.</a> eLife. 4, 06980 (2015).</li><li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+Implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FREALIGN:+High-resolution+refinement+of+single+particle+structures.">FREALIGN: High-resolution refinement of single particle structures.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CryoSPARC:+Algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CisTEM,+user-friendly+software+for+single-particle+image+processing.">CisTEM, user-friendly software for single-particle image processing.</a> eLife. 7, 35383 (2018).</li><li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>Zhang, P., Beatty, A., Milne, J. L. S., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+data+collection+with+a+Tecnai+12+electron+microscope:+Applications+for+molecular+imaging+by+cryomicroscopy.">Automated data collection with a Tecnai 12 electron microscope: Applications for molecular imaging by cryomicroscopy.</a> Journal of Structural Biology. 135 (3), 251-261 (2001).</li><li>Lei, J., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+acquisition+of+cryo-electron+micrographs+for+single+particle+reconstruction+on+an+FEI+Tecnai+electron+microscope.">Automated acquisition of cryo-electron micrographs for single particle reconstruction on an FEI Tecnai electron microscope.</a> Journal of Structural Biology. 150 (1), 69-80 (2005).</li><li>Potter, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+A+system+for+fully+automated+acquisition+of+1000+electron+micrographs+a+day.">Leginon: A system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day.</a> Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+molecular+microscopy:+The+new+Leginon+system.">Automated molecular microscopy: The new Leginon system.</a> Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).</li><li>Korinek, A., Beck, F., Baumeister, W., Nickell, S., Plitzko, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+controlled+cryo-electron+microscopy+-+TOM2+a+software+package+for+high-throughput+applications.">Computer controlled cryo-electron microscopy - TOM2 a software package for high-throughput applications.</a> Journal of Structural Biology. 175 (3), 394-405 (2011).</li><li>Shi, J., Williams, D. R., Stewart, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Script-Assisted+Microscopy+(SAM)+package+to+improve+data+acquisition+rates+on+FEI+Tecnai+electron+microscopes+equipped+with+Gatan+CCD+cameras.">A Script-Assisted Microscopy (SAM) package to improve data acquisition rates on FEI Tecnai electron microscopes equipped with Gatan CCD cameras.</a> Journal of Structural Biology. 164 (1), 166-169 (2008).</li><li>Marsh, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+software+platform+for+low-dose+electron+microscopy+and+tomography.">Modular software platform for low-dose electron microscopy and tomography.</a> Journal of Microscopy. 228, 384-389 (2007).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JADAS:+A+customizable+automated+data+acquisition+system+and+its+application+to+ice-embedded+single+particles.">JADAS: A customizable automated data acquisition system and its application to ice-embedded single particles.</a> Journal of Structural Biology. 165 (1), 1-9 (2009).</li><li>Pramanick, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+flexibility+and+structural+variability+of+SARS-CoV2+S+protein.">Conformational flexibility and structural variability of SARS-CoV2 S protein.</a> Structure. , (2021).</li><li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+neutralization+of+SARS-CoV-2+by+an+antibody+from+a+convalescent+patient.">Structural basis for the neutralization of SARS-CoV-2 by an antibody from a convalescent patient.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 27 (10), 950-958 (2020).</li><li>Hillen, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+replicating+SARS-CoV-2+polymerase.">Structure of replicating SARS-CoV-2 polymerase.</a> Nature. 584 (7819), 154-156 (2020).</li><li>Wrapp, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+2019-nCoV+spike+in+the+prefusion+conformation.">Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation.</a> Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).</li><li>Thoms, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+translational+shutdown+and+immune+evasion+by+the+Nsp1+protein+of+SARS-CoV-2.">Structural basis for translational shutdown and immune evasion by the Nsp1 protein of SARS-CoV-2.</a> Science. 369 (6508), 1249-1255 (2020).</li><li>Kumar, A., Sengupta, N., Dutta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+approach+for+preparing+graphene+oxide+tem+grids+for+stained+and+vitrified+biomolecules.">Simplified approach for preparing graphene oxide tem grids for stained and vitrified biomolecules.</a> Nanomaterials. 11 (3), 1-22 (2021).</li></ol>

Latitude-S er en intuitiv brugergrænseflade, som giver et miljø til automatisk at konfigurere og indsamle tusindvis af mikrografer eller filmfiler i høj opløsning på to dage. Det giver nem navigation på tværs af gitrene og bevarer placeringen af mikroskopstadiet, mens det bevæger sig fra lav forstørrelse til høj forstørrelse. Hvert trin i dataindsamlingen med Latitude-S er tidseffektivt med funktioner som en enkel brugergrænseflade, hurtig streaming af data med op til 4,5 GB /s hastighed og samtidig visning a...

Single-partikel cryo-EM er blevet en mainstream strukturel biologi teknik til høj opløsning struktur bestemmelse af biologiske makromolekyler1. Enkeltpartikelrekonstruktion afhænger af erhvervelse af et stort antal mikrografer af vitrified prøver til at udtrække todimensionelle (2D) partikelbilleder, som derefter bruges til at rekonstruere en tredimensionel (3D) struktur af en biologisk makromolekyle2,3. Før udviklingen af DED'er varierede opløsningen opnået fra enkeltpartikelrekonstruktion mellem 4 og 30 Å4,5. For nylig har den opnåelige opløsning fra enkelt-partikel cryo-EM nået ud over 1,8 Å6. DED og automatiseret dataindsamling software har været store bidragydere til denne opløsning revolution7, hvor menneskelig intervention for dataindsamling er minimal. Generelt udføres cryo-EM-billeddannelse ved lave elektrondosishastigheder (20-100 e/Å2) for at minimere elektronstråleinduceret strålingsskader af biologiske prøver, hvilket bidrager til det lave signal-til-støj-forhold (SNR) i billedet. Denne lave SNR hindrer karakteriseringen af de høje opløsningsstrukturer af biologiske makromolekyler ved hjælp af enkeltpartikelanalyse.
Den nye generation elektrondetektorer er CMOS (komplementære metal-oxid-halvleder)-baserede detektorer, som kan overvinde disse lave SNR-relaterede forhindringer. Disse CMOS-kameraer til direkte detektion giver mulighed for hurtig udlæsning af signalet, som kameraet bidrager med bedre punktspredningsfunktion, passende SNR og fremragende detektivkvanteeffektivitet (DQE) til biologiske makromolekyler. Direkte detektionskameraer tilbyder høj SNR8 og lav støj i de optagede billeder, hvilket resulterer i en kvantitativ stigning i detektiv kvanteeffektiviteten (DQE) - et mål for, hvor meget støj en detektor tilføjer til et billede. Disse kameraer optager også film med hundredvis af billeder i sekundet, hvilket muliggør hurtig dataindsamling9,10. Alle disse egenskaber gør hurtige direkte detektionskameraer velegnede til lavdosisapplikationer.
Bevægelseskorrigerede stakbilleder bruges til databehandling til at beregne 2D-klassificering og rekonstruere et 3D-tæthedskort over makromolekyler ved hjælp af forskellige softwarepakker som RELION11, FREALIGN12, cryoSPARC13, cisTEM14 og EMAN215. Men for enkelt-partikel analyse, et enormt datasæt er nødvendig for at opnå en høj opløsning struktur. Derfor er automatiske dataindsamlingsafgifter meget afgørende for dataindsamlingen. For at registrere store cryo-EM-datasæt er flere softwarepakker blevet brugt i løbet af det seneste årti. Dedikerede softwarepakker, såsom AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, SerialEM19, UCSF-Image420, TOM221, SAM22, JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS og EPU, er udviklet til automatiseret dataindsamling.
Disse softwarepakker bruger rutinemæssige opgaver til at finde hulpositioner automatisk ved at korrelere de lave forstørrelsesbilleder til billeder med høj forstørrelse, hvilket hjælper med at identificere huller med glasagtig is af passende istykkelse til billedopsamling under lavdosisforhold. Disse softwarepakker har reduceret antallet af gentagne opgaver og øget gennemløbet af cryo-EM dataindsamling ved at erhverve en stor mængde af god kvalitet data i flere dage kontinuerligt, uden afbrydelse og den fysiske tilstedeværelse af operatøren. Latitude-S er en lignende softwarepakke, som bruges til automatisk dataindsamling til enkeltpartikelanalyse. Denne softwarepakke er dog kun egnet til K2/K3 DED'er og leveres med disse detektorer.
Denne protokol demonstrerer Latitude-S's potentiale i den automatiserede billedopsamling af SARS-CoV-2 spikeprotein med en direkte elektrondetektor udstyret med en 200 keV cryo-EM (se materialetabellen). Ved hjælp af dette dataindsamlingsværktøj erhverves der automatisk 3.000 filmfiler med SARS-CoV-2 spikeprotein, og yderligere databehandling udføres for at opnå en 3.9-4.4 Å-opløsning spikeproteinstruktur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blotting paper</td>
			<td>Ted Pella, INC.</td>
			<td>47000-100</td>
			<td>EM specimen preparation item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capsule</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>9432 909 97591</td>
			<td>EM specimen preparation unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1020863</td>
			<td>EM specimen preparation unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Clip</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036171</td>
			<td>EM specimen preparation item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Clip Insertion Tool</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>9432 909 97571</td>
			<td>EM specimen preparation tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Clip Ring</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036173</td>
			<td>EM specimen preparation item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM grid (Quantifoil)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Q3100AR1.3</td>
			<td>R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow discharge Machine</td>
			<td>Quorum</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Quorum GlowQube glow discharge machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 DED</td>
			<td>Gatan Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Cryo-EM data collection device (Camera)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latitude S Software</td>
			<td>Gatan Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading station</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1130698</td>
			<td>EM specimen preparation unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos 200 kV Arctica</td>
			<td>Thermo Scientific&#8482;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Cryo-Electron Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>EM specimen preparation unit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

user-friendly, high-throughput, and fully automated data acquisition software for single-particle cryo-electron microscopy

I de sidste mange år har teknologiske og metodiske fremskridt inden for enkeltpartikel kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) banet en ny vej for høj opløsning struktur bestemmelse af biologiske makromolekyler. På trods af de bemærkelsesværdige fremskridt inden for kryo-EM er der stadig plads til forbedringer i forskellige aspekter af enkeltpartikelanalysearbejdsgangen. Enkeltpartikelanalyse kræver en passende softwarepakke til automatisk dataindsamling med høj kapacitet. Flere automatiske dataindsamling softwarepakker blev udviklet til automatisk billedbehandling for single-partikel cryo-EM i de sidste otte år. Dette papir præsenterer en anvendelse af en fuldautomatisk billedopsamlingspipeline til vitrified biomolekyler under lavdosisforhold. 
Det viser en softwarepakke, som kan indsamle cryo-EM-data fuldt, automatisk og præcist. Derudover styres forskellige mikroskopiske parametre let af denne softwarepakke. Denne protokol demonstrerer potentialet i denne softwarepakke i automatiseret billeddannelse af det alvorlige akutte luftvejssyndrom-coronavirus 2 (SARS-CoV-2) spikeprotein med et 200 keV kryo-elektronmikroskop udstyret med en direkte elektrondetektor (DED). Omkring 3.000 cryo-EM film billeder blev erhvervet i en enkelt session (48 timer) af dataindsamling, hvilket giver en atomare opløsning struktur af spike protein sars-CoV-2. Desuden indikerer denne strukturelle undersøgelse, at spikeproteinet vedtager to større konformationer, 1-RBD (receptorbindende domæne) åben og alle RBD ned lukkede konformationer.

I den nuværende pandemisituation spiller cryo-EM en central rolle i karakteriseringen af strukturerne af forskellige proteiner fra SARS-CoV-226,27,28,29, som kan hjælpe med at udvikle vacciner og lægemidler mod virussen. Der er et presserende behov for en hurtig forskningsindsats med begrænsede menneskelige ressourcer til at bekæmpe coronasmitten i 2019. Dataindsamling i enkelt-partikel cr...

Watch this Scientific Journal Video about User-friendly, High-throughput, and Fully Automated Data Acquisition Software for Single-particle Cryo-electron Microscopy at JoVE.com

User-friendly, High-throughput, and Fully Automated Data Acquisition Software for Single-particle Cryo-electron Microscopy

Enkelt-partikel cryo-elektronmikroskopi kræver en passende softwarepakke og brugervenlig rørledning til automatisk dataindsamling med høj kapacitet. Her præsenterer vi anvendelsen af en fuldautomatisk softwarepakke til billedopkøb, Latitude-S, og en praktisk pipeline til dataindsamling af vitrified biomolekyler under lavdosisforhold.

Brugervenlig, høj-throughput, og fuldautomatisk dataindsamling software til single-partikel Cryo-elektron Mikroskopi

In the past several years, technological and methodological advancements in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) have paved a new avenue for ...

Automatiseret dataindsamling Software er yderst nødvendig for at indsamle enorme mængder af cryo data til strukturel karakterisering af biologiske makromoleculess. Automatiseret dataindsamling Software pakke blev brugt her til at karakterisere strukturen af forskellige biologiske makromoleculess, som er direkte forbundet med patogen biologi. For eksempel mycobacterium, HIV og SASCO 2.Start Latitude-S Automated Data Acquisition Software til at begynde med ved at klikke på DigitalMicrograph fra startmenuen. Vælg derefter Technique Manager og derefter Latitude-S-ikonet for automatiseret dataindsamling med enkeltpartikel. Hvis du vil oprette en session baseret på de tidligere sessionsindstillinger, skal du markere afkrydsningsfeltet baseret på tidligere session i paletten og derefter vælge den nye knap eller fortsætte en eksisterende session, trykke på knappen Fortsæt.Hvis du vil starte en helt ny session, skal du klikke på den nye fane i paletten. Vælg den mappe, der indeholder den session, der skal fortsættes, og vælg den mappe, der skal gemmes dataene. Klik derefter på indstillingsikonet og i feltet Til udforskelse af administreret tilstand, der vises, tilføjer tilstand, indstiller TEM-tilstand, kameratilstand og billed- eller lagerindstilling.Og derefter navngive tilstanden eller åbne tilstandsopsætningsoversigten for at åbne lagringsindstillingerne. Konfigurer derefter Atlas-tilstanden ved at klikke på Atlas-tilstandspaletten og angive parametrene for forstørrelse, belysningsforhold og kameraeksponeringstid, og klik videre ved siden af for at flytte til den næste tilstand. Konfigurer derefter gittertilstanden ved at klikke på gittertilstandspaletten, angive parametrene for mikroskopbilledoptik, belysningsforhold og kameraeksponeringstid, og klik på næste.Konfigurer hultilstanden ved at klikke på hulpaletten og indstille billedoptik, belysningsforhold, binning og kameraeksponeringstidsparametre. Når du har klikket på næste, skal du konfigurere den næste fokustilstand ved at klikke på fokuspaletten og indstille indstillingerne for mikroskop for billedoptik, belysningsforhold, binning og kameraeksponeringstid. Fokuser derefter på det amorfe kulstofområde nær hullet, og klik ved siden af for at flytte til den næste tilstand.Konfigurer datatilstanden ved at klikke på datapaletten og angive parametrene for mikroskopindstillinger og derefter klikke på næste. Klik på fokuskonfigurationspaletten, der angiver defokuseringsværdier og trinstørrelsen under den angivne fane, og tryk på den næste knap for at gå til næste trin. Fokuser på de nødvendige funktioner på gitteret, og klik på capture-knappen.Placer derefter røde kryds-mærket på den samme funktion på hvert billede af forskellige tilstande. Start med Focus, Data og Hole stater, fordi synsfeltet er større end Atlas og Grid stater. Zoom derefter på Atlas- og gittertilstande for at placere røde krydsmærket på den samme funktion.Hvis du vil beregne placeringerne og forskydningen mellem hver af fem forskellige tilstande og afspejle placeringerne og forskydningerne i outputvinduet, skal du klikke på knappen Beregn. Klik på capture palet og vælg størrelsen af Atlas til at dække hele nettet eller en del af nettet baseret på kravet. Hvis du vil fange Atlas, skal du navigere på Atlas og vælge gitterpladsen baseret på istykkelsen.Når de ønskede gitter firkanter er valgt, skal du klikke på knappen Tidsplan og observere fliserne i gitteret pladsen fyldes op som hver gitter firkant er fanget. Når der klikkes på planlægningsknappen, skal du vælge et repræsentativt hul i gitterkluden ved at tilføje hullets position. Når hulbilledet er anskaffet, skal du definere data og fokusere positioner og gemme layoutet som en skabelon.Klik på auto finde, indtaste hullet størrelse, og klik på find knappen i programmet for automatisk at finde hullerne baseret på diameteren. Konfigurer intensiteten for at fjerne hullerne fra gitterpladsen og isforureningen. Og når du har tilføjet de markerede og gule mærkeværktøjer via automatisk søgning, skal du klikke på knappen Tidsplan i breddeopgaver.I henhold til den første manuelle screening af bevægelse korrigerede mikrografer ved hjælp af cisTEM-software, de fleste af dataene viste sig at være inden for det ønskede signalområde. Derudover blev billeder indsamlet på defocus ranges, også manuelt kontrolleret af cisTEM. Spike partiklerne blev manuelt plukket til at beregne 2D-klasse gennemsnit for strukturel visualisering, som stærkt foreslog, men høj opløsning strukturel karakterisering var muligt ved hjælp af de respektive datasæt.3D-klassificeringen indikerede, at Spike Protein har 1RBD i åben bekræftelse og alle andre RBD i down close bekræftelse. 1RBD op åbne bekræftelser af Spike Protein blev rekonstrueret ved hjælp af C1 symmetri. Spike Protein-kortet er repræsenteret i side- og bundvisningerne.Og EM-kortet er udstyret med atomstruktur for bedre visualisering af sidekæderne. RBD ned tætte bekræftelser blev raffineret med C3 symmetri og spike 3D raffineret model og EM kort, udstyret med atomare struktur som vist. Og mellemliggende bekræftelse af Spike Protein identificeret som S2 sub domæne angivet sidekæder af individuelle aminosyre rester.Resultaterne antydede, at Latitude-S kan indsamle høj opløsning cryo EM-data af biologiske makromolekyler. Denne automatiserede dataindsamlingssoftware kan bruges til ethvert andet elektronmikroskopisystem til automatisk at indsamle data.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Bestemmelse af molekylære strukturer af HIV Konvolut glycoproteiner med Cryo-Electron Tomography og Automatiseret Sub-tomogram Gennemsnitsberegnings

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detection Metode til Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Kvantitativ Højkapacitetsforskning encellede cytotoksicitetsassay for T-celler

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

High-throughput Screening for Bredspektret Chemical hæmmere af RNA virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

High Throughput Fluorometrisk Teknik for Vurdering af makrofag Fagocytose og actinpolymerisation

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Mikroskopi assays for high-throughput screening af Host faktorer involveret i<em&gt; Brucella</em&gt; Infektion af HeLa-celler

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging i<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

En høj overførselshastighed Platform for Screening af Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...