Name: user-friendly, high-throughput, and fully automated data acquisition software for single-particle cryo-electron microscopy
Uploaded: 2021-07-29T14:45:00
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Wir danken dem Department of Biotechnology, dem Department of Science and Technology (DST) and Science und dem Ministry of Human Resource Development (MHRD), Indien, für die Finanzierung und die Kryo-EM-Einrichtung am IISc-Bangalore. Wir erkennen das DBT-BUILDER-Programm (BT/INF/22/SP22844/2017) und DST-FIST (SR/FST/LSII-039/2015) für die National Cryo-EM-Einrichtung am IISc, Bangalore, an. Wir danken der finanziellen Unterstützung durch das Science and Engineering Research Board (SERB) (Grant No.-SB/S2/RJN-145/2015, SERB-EMR/2016/000608 und SERB-IPA/2020/000094), DBT (Grant No. BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). Wir danken Frau Ishika Pramanick für die Vorbereitung von Kryo-EM-Gittern, die Kryo-EM-Datenerfassung und die Erstellung der Materialtabelle. Wir danken auch Herrn Suman Mishra für die Kryo-EM-Bildverarbeitung und die Unterstützung bei der Erstellung der Zahlen. Wir danken Prof. Raghavan Varadarajan dafür, dass er uns geholfen hat, die gereinigte Spike-Protein-Probe für diese Studie zu erhalten.

HINWEIS: Für die Kryo-EM-Datenerfassung sind drei wichtige Schritte erforderlich: 1. Kryo-EM-Rastervorbereitung, 2. Kalibrierung und Ausrichtung des Mikroskops, 3. automatische Datenerfassung (Abbildung 1). Des Weiteren gliedert sich die automatisierte Datenerfassung in a. geeignete Flächenauswahl, b. Optimierung von Latitude-S, c. Start der automatischen Lochauswahl und d. Start der automatischen Datenerfassung (Abbildung 1).
1. Cryo...

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	<li>Li, Y., Cash, J. N., Tesmer, J. J. G., Cianfrocco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+cryo-EM+enabled+by+user-free+preprocessing+routines.">High-throughput cryo-EM enabled by user-free preprocessing routines.</a> Structure. 28 (7), 858-869 (2020).</li><li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+An+automated+system+for+acquisition+of+images+from+vitreous+ice+specimens.">Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens.</a> Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).</li><li>Stagg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+cryoEM+data+acquisition+and+analysis+of+284+742+particles+of+GroEL.">Automated cryoEM data acquisition and analysis of 284 742 particles of GroEL.</a> Journal of Structural Biology. 155 (3), 470-481 (2006).</li><li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+in+electron+microscopy-30+years.">Single-particle reconstruction of biological macromolecules in electron microscopy-30 years.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 42 (3), 139-158 (2009).</li><li>Biyani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focus:+The+interface+between+data+collection+and+data+processing+in+cryo-EM.">Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM.</a> Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).</li><li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution.">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).</li><li>K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+resolution+revolution.">The resolution revolution.</a> Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).</li><li>McMullan, G., Chen, S., Henderson, R., Faruqi, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detective+quantum+efficiency+of+electron+area+detectors+in+electron+microscopy.">Detective quantum efficiency of electron area detectors in electron microscopy.</a> Ultramicroscopy. 109 (9), 1126-1143 (2009).</li><li>Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MotionCor2:+Anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy.">MotionCor2: Anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).</li><li>Grant, T., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+optimal+exposure+for+single+particle+cryo-EM+using+a+2.6+&#197;+reconstruction+of+rotavirus+VP6.">Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 &#197; reconstruction of rotavirus VP6.</a> eLife. 4, 06980 (2015).</li><li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+Implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FREALIGN:+High-resolution+refinement+of+single+particle+structures.">FREALIGN: High-resolution refinement of single particle structures.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CryoSPARC:+Algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CisTEM,+user-friendly+software+for+single-particle+image+processing.">CisTEM, user-friendly software for single-particle image processing.</a> eLife. 7, 35383 (2018).</li><li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>Zhang, P., Beatty, A., Milne, J. L. S., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+data+collection+with+a+Tecnai+12+electron+microscope:+Applications+for+molecular+imaging+by+cryomicroscopy.">Automated data collection with a Tecnai 12 electron microscope: Applications for molecular imaging by cryomicroscopy.</a> Journal of Structural Biology. 135 (3), 251-261 (2001).</li><li>Lei, J., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+acquisition+of+cryo-electron+micrographs+for+single+particle+reconstruction+on+an+FEI+Tecnai+electron+microscope.">Automated acquisition of cryo-electron micrographs for single particle reconstruction on an FEI Tecnai electron microscope.</a> Journal of Structural Biology. 150 (1), 69-80 (2005).</li><li>Potter, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+A+system+for+fully+automated+acquisition+of+1000+electron+micrographs+a+day.">Leginon: A system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day.</a> Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+molecular+microscopy:+The+new+Leginon+system.">Automated molecular microscopy: The new Leginon system.</a> Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).</li><li>Korinek, A., Beck, F., Baumeister, W., Nickell, S., Plitzko, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+controlled+cryo-electron+microscopy+-+TOM2+a+software+package+for+high-throughput+applications.">Computer controlled cryo-electron microscopy - TOM2 a software package for high-throughput applications.</a> Journal of Structural Biology. 175 (3), 394-405 (2011).</li><li>Shi, J., Williams, D. R., Stewart, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Script-Assisted+Microscopy+(SAM)+package+to+improve+data+acquisition+rates+on+FEI+Tecnai+electron+microscopes+equipped+with+Gatan+CCD+cameras.">A Script-Assisted Microscopy (SAM) package to improve data acquisition rates on FEI Tecnai electron microscopes equipped with Gatan CCD cameras.</a> Journal of Structural Biology. 164 (1), 166-169 (2008).</li><li>Marsh, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+software+platform+for+low-dose+electron+microscopy+and+tomography.">Modular software platform for low-dose electron microscopy and tomography.</a> Journal of Microscopy. 228, 384-389 (2007).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JADAS:+A+customizable+automated+data+acquisition+system+and+its+application+to+ice-embedded+single+particles.">JADAS: A customizable automated data acquisition system and its application to ice-embedded single particles.</a> Journal of Structural Biology. 165 (1), 1-9 (2009).</li><li>Pramanick, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+flexibility+and+structural+variability+of+SARS-CoV2+S+protein.">Conformational flexibility and structural variability of SARS-CoV2 S protein.</a> Structure. , (2021).</li><li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+neutralization+of+SARS-CoV-2+by+an+antibody+from+a+convalescent+patient.">Structural basis for the neutralization of SARS-CoV-2 by an antibody from a convalescent patient.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 27 (10), 950-958 (2020).</li><li>Hillen, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+replicating+SARS-CoV-2+polymerase.">Structure of replicating SARS-CoV-2 polymerase.</a> Nature. 584 (7819), 154-156 (2020).</li><li>Wrapp, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+2019-nCoV+spike+in+the+prefusion+conformation.">Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation.</a> Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).</li><li>Thoms, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+translational+shutdown+and+immune+evasion+by+the+Nsp1+protein+of+SARS-CoV-2.">Structural basis for translational shutdown and immune evasion by the Nsp1 protein of SARS-CoV-2.</a> Science. 369 (6508), 1249-1255 (2020).</li><li>Kumar, A., Sengupta, N., Dutta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+approach+for+preparing+graphene+oxide+tem+grids+for+stained+and+vitrified+biomolecules.">Simplified approach for preparing graphene oxide tem grids for stained and vitrified biomolecules.</a> Nanomaterials. 11 (3), 1-22 (2021).</li></ol>

Latitude-S ist eine intuitive Benutzeroberfläche, die eine Umgebung zum automatischen Einrichten und Sammeln von Tausenden von hochauflösenden Mikroaufnahmen oder Filmdateien in zwei Tagen bietet. Es bietet eine einfache Navigation durch die Gitter und behält die Position des Mikroskoptisches bei, während es sich von niedriger Vergrößerung zu hoher Vergrößerung bewegt. Jeder Schritt der Datenerfassung mit Latitude-S ist zeiteffizient, mit Funktionen wie einer einfachen Benutzeroberfläche, schnellem Streaming von...

Einzelpartikel-Kryo-EM hat sich zu einer gängigen strukturbiologischen Technik zur hochauflösenden Strukturbestimmung biologischer Makromoleküle entwickelt1. Die Einzelpartikelrekonstruktion hängt von der Aufnahme einer großen Anzahl von Mikroaufnahmen von verglasten Proben ab, um zweidimensionale (2D) Partikelbilder zu extrahieren, die dann verwendet werden, um eine dreidimensionale (3D) Struktur eines biologischen Makromoleküls zu rekonstruieren2,3. Vor der Entwicklung von DEDs lag die durch die Einzelpartikelrekonstruktion erreichte Auflösung zwischen 4 und 30 Å4,5. Vor kurzem hat die erreichbare Auflösung von Einzelpartikel-Kryo-EM mehr als 1,8 Å6 erreicht. DED und automatisierte Datenerfassungssoftware haben wesentlich zu dieser Auflösungsrevolution beigetragen7, bei der menschliche Eingriffe zur Datenerfassung minimal sind. Im Allgemeinen wird die Kryo-EM-Bildgebung bei niedrigen Elektronendosisraten (20-100 e/Å2) durchgeführt, um die durch Elektronenstrahle induzierte Strahlenschädigung biologischer Proben zu minimieren, was zu dem niedrigen Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) im Bild beiträgt. Diese niedrige SNR behindert die Charakterisierung der hochauflösenden Strukturen biologischer Makromoleküle mittels Einzelpartikelanalyse.
Die Elektronendetektoren der neuen Generation sind CMOS-basierte Detektoren (Complementary Metal-Oxide-Semiconductor), die diese niedrigen SNR-bezogenen Hindernisse überwinden können. Diese CMOS-Kameras mit direkter Detektion ermöglichen ein schnelles Auslesen des Signals, wodurch die Kamera eine bessere Punktspreizungsfunktion, ein geeignetes SNR und eine hervorragende Detektivquanteneffizienz (DQE) für biologische Makromoleküle beiträgt. Direktdetektionskameras bieten ein hohes SNR8 und ein geringes Rauschen in den aufgenommenen Bildern, was zu einer quantitativen Steigerung der Detektivquanteneffizienz (DQE) führt - ein Maß dafür, wie viel Rauschen ein Detektor zu einem Bild hinzufügt. Diese Kameras zeichnen auch Filme mit einer Geschwindigkeit von Hunderten von Bildern pro Sekunde auf, was eine schnelle Datenerfassung ermöglicht9,10. All diese Eigenschaften machen schnelle Direktdetektionskameras für anwendungen mit niedriger Dosis geeignet.
Bewegungskorrigierte Stapelbilder werden für die Datenverarbeitung verwendet, um die 2D-Klassifizierung zu berechnen und eine 3D-Dichtekarte von Makromolekülen mit verschiedenen Softwarepaketen wie RELION11, FREALIGN12, cryoSPARC13, cisTEM14 und EMAN215 zu rekonstruieren. Für die Einzelpartikelanalyse ist jedoch ein enormer Datensatz erforderlich, um eine hochauflösende Struktur zu erreichen. Daher sind automatische Datenerfassungsmauten für die Datenerfassung von großer Bedeutung. Um große Kryo-EM-Datensätze zu erfassen, wurden in den letzten zehn Jahren mehrere Softwarepakete verwendet. Dedizierte Softwarepakete wie AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, SerialEM19, UCSF-Image420, TOM221, SAM22, JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS und EPU wurden für die automatisierte Datenerfassung entwickelt.
Diese Softwarepakete verwenden Routineaufgaben, um Bohrungspositionen automatisch zu finden, indem sie die Bilder mit geringer Vergrößerung mit Bildern mit hoher Vergrößerung korrelieren, was bei der Identifizierung von Löchern mit glasigem Eis von geeigneter Eisdicke für die Bildaufnahme unter niedrig dosierten Bedingungen hilft. Diese Softwarepakete haben die Anzahl der sich wiederholenden Aufgaben reduziert und den Durchsatz der Kryo-EM-Datenerfassung erhöht, indem sie mehrere Tage lang kontinuierlich eine große Menge an qualitativ hochwertigen Daten ohne Unterbrechung und die physische Anwesenheit des Bedieners erfasst haben. Latitude-S ist ein ähnliches Softwarepaket, das zur automatischen Datenerfassung für die Einzelpartikelanalyse verwendet wird. Dieses Softwarepaket ist jedoch nur für K2/K3-DEDs geeignet und wird mit diesen Detektoren ausgeliefert.
Dieses Protokoll demonstriert das Potenzial von Latitude-S bei der automatisierten Bilderfassung des SARS-CoV-2-Spikeproteins mit einem direkten Elektronendetektor, der mit einem 200 keV Kryo-EM ausgestattet ist (siehe Materialtabelle). Mit diesem Datenerfassungstool werden automatisch 3.000 Filmdateien des SARS-CoV-2-Spike-Proteins erfasst und eine weitere Datenverarbeitung durchgeführt, um eine Spike-Proteinstruktur mit einer Auflösung von 3,9-4,4 Å zu erhalten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blotting paper</td>
			<td>Ted Pella, INC.</td>
			<td>47000-100</td>
			<td>EM specimen preparation item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capsule</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>9432 909 97591</td>
			<td>EM specimen preparation unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1020863</td>
			<td>EM specimen preparation unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Clip</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036171</td>
			<td>EM specimen preparation item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Clip Insertion Tool</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>9432 909 97571</td>
			<td>EM specimen preparation tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Clip Ring</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036173</td>
			<td>EM specimen preparation item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM grid (Quantifoil)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Q3100AR1.3</td>
			<td>R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow discharge Machine</td>
			<td>Quorum</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Quorum GlowQube glow discharge machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 DED</td>
			<td>Gatan Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Cryo-EM data collection device (Camera)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latitude S Software</td>
			<td>Gatan Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading station</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1130698</td>
			<td>EM specimen preparation unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos 200 kV Arctica</td>
			<td>Thermo Scientific&#8482;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Cryo-Electron Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>EM specimen preparation unit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

user-friendly, high-throughput, and fully automated data acquisition software for single-particle cryo-electron microscopy

Technologische und methodische Fortschritte in der Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) haben in den vergangenen Jahren einen neuen Weg für die hochauflösende Strukturbestimmung biologischer Makromoleküle eröffnet. Trotz der bemerkenswerten Fortschritte in der Kryo-EM gibt es noch Raum für Verbesserungen in verschiedenen Aspekten des Einzelpartikelanalyse-Workflows. Die Einzelpartikelanalyse erfordert ein geeignetes Softwarepaket für die automatische Datenerfassung mit hohem Durchsatz. In den letzten acht Jahren wurden mehrere Softwarepakete für die automatische Datenerfassung für die automatische Bildgebung von Einzelpartikel-Kryo-EM entwickelt. Dieser Beitrag stellt eine Anwendung einer vollautomatischen Bilderfassungspipeline für vitrifizierte Biomoleküle unter niedrig dosierten Bedingungen vor. 
Es demonstriert ein Softwarepaket, das Kryo-EM-Daten vollständig, automatisch und präzise sammeln kann. Darüber hinaus können verschiedene mikroskopische Parameter durch dieses Softwarepaket einfach gesteuert werden. Dieses Protokoll demonstriert das Potenzial dieses Softwarepakets bei der automatisierten Bildgebung des Spike-Proteins SARS-CoV-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome-Coronavirus 2) mit einem 200-keV-Kryo-Elektronenmikroskop, das mit einem direkten Elektronendetektor (DED) ausgestattet ist. Rund 3.000 Kryo-EM-Filmbilder wurden in einer einzigen Sitzung (48 h) der Datenerhebung aufgenommen, was zu einer atomaren Auflösungsstruktur des Spike-Proteins von SARS-CoV-2 führte. Darüber hinaus zeigt diese Strukturstudie, dass das Spike-Protein zwei Hauptkonformationen annimmt, 1-RBD (Rezeptor-bindende Domäne) offen und alle RBD nach unten geschlossenen Konformationen.

In der aktuellen Pandemiesituation spielt Kryo-EM eine Schlüsselrolle bei der Charakterisierung der Strukturen verschiedener Proteine aus SARS-CoV-226,27,28,29, die zur Entwicklung von Impfstoffen und Medikamenten gegen das Virus beitragen können. Es besteht ein dringender Bedarf an schnelllebigen Forschungsanstrengungen mit begrenzten personellen Ressourcen, um die Coronavirus-Krankheit von ...

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User-friendly, High-throughput, and Fully Automated Data Acquisition Software for Single-particle Cryo-electron Microscopy

Die Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie erfordert ein geeignetes Softwarepaket und eine benutzerfreundliche Pipeline für die automatische Datenerfassung mit hohem Durchsatz. Hier präsentieren wir die Anwendung eines vollautomatischen Bilderfassungssoftwarepakets, Latitude-S, und einer praktischen Pipeline zur Datenerfassung von vitrifizierten Biomolekülen unter niedrig dosierten Bedingungen.

Benutzerfreundliche Datenerfassungssoftware mit hohem Durchsatz und vollautomatischer Datenerfassung für die Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie

In the past several years, technological and methodological advancements in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) have paved a new avenue for ...

Automatisierte Datenerfassungssoftware ist äußerst notwendig, um große Mengen an Kryodaten für die strukturelle Charakterisierung biologischer Makromoleküle zu sammeln. Automatisierte DatenerfassungSsoftware wurde hier verwendet, um die Struktur verschiedener biologischer Makromoleküle zu charakterisieren, die direkt mit der Pathogenbiologie in Verbindung stehen. Zum Beispiel Mykobakterien, HIV und SASCO 2.Starten Sie zunächst die Latitude-S Automated Data Acquisition Software, indem Sie im Startmenü auf DigitalMicrograph klicken. Wählen Sie als Nächstes den Technique Manager und dann das Latitude-S-Symbol für Single-Particle Automated Data Collection aus. Um eine Sitzung basierend auf den vorherigen Sitzungseinstellungen zu erstellen, aktivieren Sie das Kontrollkästchen Basierend auf vorheriger Sitzung in der Palette und wählen Sie dann die neue Schaltfläche aus, oder um eine vorhandene Sitzung fortzusetzen, drücken Sie die Schaltfläche Weiter.Um eine völlig neue Sitzung zu starten, klicken Sie auf die neue Registerkarte in der Palette. Wählen Sie den Ordner aus, der die Fortsetzung der Sitzung enthält, und wählen Sie den Ordner aus, in dem die Daten gespeichert werden sollen. Klicken Sie anschließend auf das Einstellungssymbol und fügen Sie im angezeigten Feld zum Erkunden des verwalteten Status den Status hinzu, legen Sie die TEM-Bedingung, die Kamerabedingung und die Bild- oder Stock-Option fest.Benennen Sie dann den Status, oder öffnen Sie die Status-Setup-Zusammenfassung, um die Speichereinstellungen zu öffnen. Konfigurieren Sie als Nächstes den Atlas-Status, indem Sie auf die Atlas-Statuspalette klicken und die Parameter für Vergrößerung, Beleuchtungsbedingungen und Kamerabelichtungszeit einstellen und auf weiter klicken, um zum nächsten Status zu wechseln. Konfigurieren Sie dann den Rasterzustand, indem Sie auf die Rasterzustandspalette klicken, die Parameter für die Optik der Mikroskopbildgebung, die Beleuchtungsbedingungen und die Belichtungszeit der Kamera festlegen und auf Weiter klicken.Konfigurieren Sie den Bohrungszustand, indem Sie auf die Bohrungspalette klicken und die Parameter bildgebende Optik, Beleuchtungsbedingungen, Binning und Kamerabelichtungszeit einstellen. Nachdem Sie auf Weiter geklickt haben, konfigurieren Sie den nächsten Fokuszustand, indem Sie auf die Fokuspalette klicken und die Mikroskopeinstellungen für bildgebende Optik, Beleuchtungsbedingungen, Binning und Kamerabelichtungszeit einstellen. Konzentriere dich dann auf den amorphen Kohlenstoffbereich in der Nähe des Lochs und klicke auf weiter, um zum nächsten Zustand zu gelangen.Konfigurieren Sie den Datenzustand, indem Sie auf die Datenpalette klicken und die Parameter für die Mikroskopeinstellungen festlegen und dann auf Weiter klicken. Klicken Sie auf die Fokuskonfigurationspalette, die den Bereich der Defokuswerte und die Schrittgröße in der angegebenen Registerkarte angibt, und drücken Sie die Schaltfläche Weiter, um zum nächsten Schritt überzugehen. Konzentrieren Sie sich auf die erforderlichen Funktionen im Raster und klicken Sie auf die Aufnahmeschaltfläche.Positionieren Sie dann die rote Kreuzmarkierung auf demselben Merkmal auf jedem Bild verschiedener Zustände. Beginnen Sie mit den Zuständen "Fokus", "Daten" und "Loch", da das Sichtfeld größer ist als die Zustände "Atlas" und "Raster". Zoomen Sie als Nächstes auf atlas- und grid-Status, um die rote Kreuzmarkierung auf demselben Feature zu positionieren.Um die Positionen und den Offset zwischen jedem der fünf verschiedenen Zustände zu berechnen und die Positionen und Offsets im Ausgabefenster widerzuspiegeln, klicken Sie auf die Schaltfläche Berechnen. Klicken Sie auf Erfassungspalette und wählen Sie die Größe des Atlas aus, um das gesamte Raster oder einen Teil des Rasters basierend auf der Anforderung abzudecken. Um den Atlas zu erfassen, navigieren Sie auf dem Atlas und wählen Sie das Gitterquadrat basierend auf der Eisdicke aus.Sobald die gewünschten Rasterquadrate ausgewählt sind, klicken Sie auf die Schaltfläche Zeitplan und beobachten Sie, wie sich die Kacheln im Rasterquadrat füllen, während jedes Rasterquadrat erfasst wird. Nachdem Sie auf die Schaltfläche Zeitplan geklickt haben, wählen Sie eine repräsentative Bohrung im Rasterquadrat aus, indem Sie die Position der Bohrung hinzufügen. Sobald das Lochbild erfasst ist, definieren Sie die Daten und Fokuspositionen und speichern Sie das Layout als Vorlage.Klicken Sie auf Automatische Suche, geben Sie die Lochgröße ein und klicken Sie im Programm auf die Schaltfläche "Suchen", um die Löcher basierend auf dem Durchmesser automatisch zu finden. Richten Sie die Intensität ein, um die Löcher aus dem Gitterquadrat und die Eiskontamination zu entfernen. Und nachdem Sie die ausgewählten und gelben Markierungswerkzeuge über die automatische Suche hinzugefügt haben, klicken Sie auf die Schaltfläche Zeitplan in Latitude-Aufgaben.Gemäß dem anfänglichen manuellen Screening von bewegungskorrigierten Mikroaufnahmen mit der cisTEM-Software wurde festgestellt, dass die meisten Daten innerhalb des gewünschten Signalbereichs lagen. Darüber hinaus wurden Bilder, die in Defokusbereichen gesammelt wurden, auch manuell von cisTEM überprüft. Die Spike-Partikel wurden manuell ausgewählt, um die 2D-Klassendurchschnitte für die Strukturvisualisierung zu berechnen, was stark darauf hindeutete, aber eine hochauflösende Strukturcharakterisierung war mit dem entsprechenden Datensatz möglich.Die 3D-Klassifizierung zeigte, dass Spike Protein 1RBD in der offenen Bestätigung und alle anderen RBD in der Down-Close-Bestätigung hat. Die offenen 1RBD-Bestätigungen des Spike-Proteins wurden unter Verwendung der C1-Symmetrie rekonstruiert. Die Spike Protein-Karte wird in der seitlichen oberen und unteren Ansicht dargestellt.Und die EM-Karte ist mit einer atomaren Struktur ausgestattet, um die Seitenketten besser zu visualisieren. Die RBD-Down-Close-Bestätigungen wurden mit C3-Symmetrie verfeinert und das Spike-3D-Verfeinerungsmodell und die EM-Karte, die wie gezeigt mit atomarer Struktur ausgestattet waren. Und die Zwischenbestätigung des Spike-Proteins, das als S2-Subdomäne identifiziert wurde, zeigte die Seitenketten einzelner Aminosäurereste an.Die Ergebnisse deuteten darauf hin, dass Latitude-S hochauflösende Kryo-EM-Daten von biologischen Makromolekülen sammeln kann. Diese automatisierte Datenerfassungssoftware kann mit jedem anderen Elektronenmikroskopiesystem verwendet werden, um Daten automatisch zu sammeln.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Bestimmung von Molekülstrukturen von HIV Hüllglycoproteine ​​mit Cryo-Elektronen-Tomographie und automatisierte Sub-Tomogramm Averaging

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

Aufbau des HIV-1 Capsid Assemblies durch Kryo-Elektronenmikroskopie und Iterative Helical Real-Raum Wiederaufbau

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Live Cell Imaging von Bacillus subtilis Und Streptococcus pneumoniae Verwendung von Automated Zeitraffer-Mikroskopie

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-Throughput Nachweisverfahren für Influenza-Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Quantitative High-throughput Single-cell Zytotoxizitätstest für T-Zellen

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Hochdurchsatz-Screening für Breitspektrum-Chemische Inhibitoren der RNA-Viren

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Mikroskopie-basierte Assays für die Hochdurchsatz-Screening von Host beteiligten Faktoren in<em&gt; Brucella</em&gt; Die Infektion von HeLa-Zellen

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

Ein Fluoreszenz-basierte Lymphocyte Assay geeignet für Hochdurchsatz-Screening von kleinen Molekülen

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Eine High-Throughput-Plattform für das Screening von Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Ein High-Throughput- Shigella-spezifischen bakterizide Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...