Name: user-friendly, high-throughput, and fully automated data acquisition software for single-particle cryo-electron microscopy
Uploaded: 2021-07-29T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about User-friendly, High-throughput, and Fully Automated Data Acquisition Software for Single-particle Cryo-electron Microscopy at JoVE.com

אנו מכירים במחלקה לביוטכנולוגיה, המחלקה למדע וטכנולוגיה (DST) ומדע, והמשרד לפיתוח משאבי אנוש (MHRD), הודו, למימון ומתקן ה- cryo-EM ב- IISc-Bangalore. אנו מכירים בתוכנית בונה DBT (BT/INF/22/SP22844/2017) ו-DST-FIST (SR/FST/LSII-039/2015) עבור מתקן הקריו-EM הלאומי ב- IISc, בנגלור. אנו מכירים בתמיכה כספית של המועצה לחקר המדע וההנדסה (SERB) (מענק מס'-SB/S2/RJN-145/2015, SERB-EMR/2016/000608 ו-SERB-IPA/2020/000094), DBT (מענק מס'. BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). אנו מודים לגברת אישיקה פרמניק על הכנת רשתות קריו-EM, איסוף נתונים של cryo-EM והכנת טבלת החומרים. אנו מודים גם למר סומאן מישרה על עיבוד התמונה cryo-EM ועל שעזר לנו להכין את הדמויות. אנו מודים לפרופ' רגהאבן ורדרג'אן על שעזר לנו להשיג את דגימת חלבון הספייק המטוהרת עבור מחקר זה.

הערה: שלושה שלבים חשובים נדרשים לאיסוף נתונים cryo-EM: 1. הכנת רשת cryo-EM, 2. כיול ויישור של המיקרוסקופ, 3. איסוף נתונים אוטומטי (איור 1). יתר על כן, איסוף נתונים אוטומטי מחולק ל- a. בחירת שטח מתאימה, ב. אופטימיזציה של Latitude-S, c. התחל בחירת חורים אוטומטית ו- d. התחל רכישת נתונים אוטומטית (<strong...

<ol>
	<li>Li, Y., Cash, J. N., Tesmer, J. J. G., Cianfrocco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+cryo-EM+enabled+by+user-free+preprocessing+routines.">High-throughput cryo-EM enabled by user-free preprocessing routines.</a> Structure. 28 (7), 858-869 (2020).</li><li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+An+automated+system+for+acquisition+of+images+from+vitreous+ice+specimens.">Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens.</a> Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).</li><li>Stagg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+cryoEM+data+acquisition+and+analysis+of+284+742+particles+of+GroEL.">Automated cryoEM data acquisition and analysis of 284 742 particles of GroEL.</a> Journal of Structural Biology. 155 (3), 470-481 (2006).</li><li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+in+electron+microscopy-30+years.">Single-particle reconstruction of biological macromolecules in electron microscopy-30 years.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 42 (3), 139-158 (2009).</li><li>Biyani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focus:+The+interface+between+data+collection+and+data+processing+in+cryo-EM.">Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM.</a> Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).</li><li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution.">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).</li><li>K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+resolution+revolution.">The resolution revolution.</a> Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).</li><li>McMullan, G., Chen, S., Henderson, R., Faruqi, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detective+quantum+efficiency+of+electron+area+detectors+in+electron+microscopy.">Detective quantum efficiency of electron area detectors in electron microscopy.</a> Ultramicroscopy. 109 (9), 1126-1143 (2009).</li><li>Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MotionCor2:+Anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy.">MotionCor2: Anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).</li><li>Grant, T., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+optimal+exposure+for+single+particle+cryo-EM+using+a+2.6+&#197;+reconstruction+of+rotavirus+VP6.">Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 &#197; reconstruction of rotavirus VP6.</a> eLife. 4, 06980 (2015).</li><li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+Implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FREALIGN:+High-resolution+refinement+of+single+particle+structures.">FREALIGN: High-resolution refinement of single particle structures.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CryoSPARC:+Algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CisTEM,+user-friendly+software+for+single-particle+image+processing.">CisTEM, user-friendly software for single-particle image processing.</a> eLife. 7, 35383 (2018).</li><li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>Zhang, P., Beatty, A., Milne, J. L. S., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+data+collection+with+a+Tecnai+12+electron+microscope:+Applications+for+molecular+imaging+by+cryomicroscopy.">Automated data collection with a Tecnai 12 electron microscope: Applications for molecular imaging by cryomicroscopy.</a> Journal of Structural Biology. 135 (3), 251-261 (2001).</li><li>Lei, J., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+acquisition+of+cryo-electron+micrographs+for+single+particle+reconstruction+on+an+FEI+Tecnai+electron+microscope.">Automated acquisition of cryo-electron micrographs for single particle reconstruction on an FEI Tecnai electron microscope.</a> Journal of Structural Biology. 150 (1), 69-80 (2005).</li><li>Potter, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+A+system+for+fully+automated+acquisition+of+1000+electron+micrographs+a+day.">Leginon: A system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day.</a> Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+molecular+microscopy:+The+new+Leginon+system.">Automated molecular microscopy: The new Leginon system.</a> Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).</li><li>Korinek, A., Beck, F., Baumeister, W., Nickell, S., Plitzko, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+controlled+cryo-electron+microscopy+-+TOM2+a+software+package+for+high-throughput+applications.">Computer controlled cryo-electron microscopy - TOM2 a software package for high-throughput applications.</a> Journal of Structural Biology. 175 (3), 394-405 (2011).</li><li>Shi, J., Williams, D. R., Stewart, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Script-Assisted+Microscopy+(SAM)+package+to+improve+data+acquisition+rates+on+FEI+Tecnai+electron+microscopes+equipped+with+Gatan+CCD+cameras.">A Script-Assisted Microscopy (SAM) package to improve data acquisition rates on FEI Tecnai electron microscopes equipped with Gatan CCD cameras.</a> Journal of Structural Biology. 164 (1), 166-169 (2008).</li><li>Marsh, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+software+platform+for+low-dose+electron+microscopy+and+tomography.">Modular software platform for low-dose electron microscopy and tomography.</a> Journal of Microscopy. 228, 384-389 (2007).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JADAS:+A+customizable+automated+data+acquisition+system+and+its+application+to+ice-embedded+single+particles.">JADAS: A customizable automated data acquisition system and its application to ice-embedded single particles.</a> Journal of Structural Biology. 165 (1), 1-9 (2009).</li><li>Pramanick, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+flexibility+and+structural+variability+of+SARS-CoV2+S+protein.">Conformational flexibility and structural variability of SARS-CoV2 S protein.</a> Structure. , (2021).</li><li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+neutralization+of+SARS-CoV-2+by+an+antibody+from+a+convalescent+patient.">Structural basis for the neutralization of SARS-CoV-2 by an antibody from a convalescent patient.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 27 (10), 950-958 (2020).</li><li>Hillen, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+replicating+SARS-CoV-2+polymerase.">Structure of replicating SARS-CoV-2 polymerase.</a> Nature. 584 (7819), 154-156 (2020).</li><li>Wrapp, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+2019-nCoV+spike+in+the+prefusion+conformation.">Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation.</a> Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).</li><li>Thoms, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+translational+shutdown+and+immune+evasion+by+the+Nsp1+protein+of+SARS-CoV-2.">Structural basis for translational shutdown and immune evasion by the Nsp1 protein of SARS-CoV-2.</a> Science. 369 (6508), 1249-1255 (2020).</li><li>Kumar, A., Sengupta, N., Dutta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+approach+for+preparing+graphene+oxide+tem+grids+for+stained+and+vitrified+biomolecules.">Simplified approach for preparing graphene oxide tem grids for stained and vitrified biomolecules.</a> Nanomaterials. 11 (3), 1-22 (2021).</li></ol>

Latitude-S הוא ממשק משתמש אינטואיטיבי, המספק סביבה להפעלה ואיסוף אוטומטי של אלפי מיקרוגרפים ברזולוציה גבוהה או קבצי סרטים ביומיים. הוא מספק ניווט קל על פני הרשתות ושומר על המיקום של שלב המיקרוסקופ בזמן שהוא עובר מהגדלה נמוכה להגדלה גבוהה. כל שלב של רכישת נתונים עם Latitude-S הוא חסכוני בזמן, עם תכונ...

קריו-EM חלקיק יחיד הפך טכניקה ביולוגית מבנית המיינסטרים לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה של macromolecules ביולוגי1. שחזור חלקיק יחיד תלוי ברכישת מספר עצום של מיקרוגרפים של דגימות מוויטוריות כדי לחלץ תמונות חלקיקים דו-ממדיות (2D), המשמשות לאחר מכן לשחזור מבנה תלת מימדי (תלת-ממדי) של מקרו-קולקול ביולוגי2,3. לפני הפיתוח של DEDs, ההחלטה שהושגה משחזור חלקיק יחיד נע בין 4 ל 30 Å4,5. לאחרונה, הרזולוציה ברת השגה של קריו-EM חלקיק יחיד הגיעה מעבר 1.8 Å6. DED ותוכנה אוטומטית לרכישת נתונים היו התורמים העיקריים למהפכת החלטה זו7, שבה ההתערבות האנושית באיסוף נתונים היא מינימלית. בדרך כלל, הדמיית cryo-EM מבוצעת בשיעורי מינון אלקטרונים נמוכים (20-100 e/Å2) כדי למזער נזקי קרינה הנגרמים על ידי קרן אלקטרונים של דגימות ביולוגיות, מה שתורם ליחס האות לרעש הנמוך (SNR) בתמונה. SNR נמוך זה מונע את האפיון של המבנים ברזולוציה גבוהה של מקרומולקולים ביולוגיים באמצעות ניתוח חלקיקים בודדים.
גלאי האלקטרונים מהדור החדש הם גלאים מבוססי CMOS (מוליכים למחצה משלימים של תחמוצת מתכת), שיכולים להתגבר על מכשולים נמוכים אלה הקשורים ל- SNR. מצלמות CMOS לזיהוי ישיר אלה מאפשרות קריאה מהירה של האות, שבגללו המצלמה תורמת פונקציית התפשטות נקודה טובה יותר, SNR מתאים ויעילות קוונטית בלשית מעולה (DQE) עבור מקרומולקולים ביולוגיים. מצלמות זיהוי ישיר מציעות SNR8 גבוה ורעש נמוך בתמונות המוקלטות, וכתוצאה מכך עלייה כמותית ביעילות הקוונטית הבלשית (DQE) - מדד של כמות הרעש שהגלאי מוסיף לתמונה. מצלמות אלה גם מקליטות סרטים במהירות של מאות פריימים לשנייה, מה שמאפשר רכישת נתונים מהירה9,10. כל המאפיינים האלה הופכים מצלמות זיהוי ישיר מהירות המתאימות ליישומים במינון נמוך.
תמונות מחסנית מתוקנות בתנועה משמשות לעיבוד נתונים כדי לחשב סיווג 2D ולשחזר מפת צפיפות תלת-ממדית של פקודות מאקרו באמצעות חבילות תוכנה שונות כגון RELION11, FREALIGN12, cryoSPARC13, cisTEM14 ו- EMAN215. עם זאת, עבור ניתוח חלקיקים בודדים, ערכת נתונים עצומה נדרשת כדי להשיג מבנה ברזולוציה גבוהה. לכן, אגרת רכישת נתונים אוטומטית חיונית מאוד לאיסוף נתונים. כדי להקליט ערכות נתונים גדולות של Cryo-EM, נעשה שימוש במספר חבילות תוכנה בעשור האחרון. חבילות תוכנה ייעודיות, כגון AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, SerialEM19, UCSF-Image420, TOM221, SAM22, JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS ו- EPU, פותחו לרכישת נתונים אוטומטית.
חבילות תוכנה אלה משתמשות במשימות שגרתיות כדי למצוא מיקומי חור באופן אוטומטי על-ידי מתאם התמונות בהגדלה נמוכה לתמונות בהגדלה גבוהה, המסייעת בזיהוי חורים עם קרח מרץ של עובי קרח ניכוס לרכישת תמונה בתנאים במינון נמוך. חבילות תוכנה אלה הפחיתו את מספר המשימות החוזרות ונשנות והגדילו את התפוקה של איסוף נתוני cryo-EM על ידי רכישת כמות עצומה של נתונים באיכות טובה במשך מספר ימים ברציפות, ללא כל הפרעה ונוכחות פיזית של המפעיל. Latitude-S היא חבילת תוכנה דומה, המשמשת לרכישת נתונים אוטומטית לניתוח חלקיקים בודדים. עם זאת, חבילת תוכנה זו מתאימה רק למטעני K2/K3 ומסופק לגלאים אלה.
פרוטוקול זה מדגים את הפוטנציאל של Latitude-S ברכישת תמונה אוטומטית של חלבון ספייק SARS-CoV-2 עם גלאי אלקטרונים ישיר המצויד בהקפאה-EM של 200 keV (ראה טבלת החומרים). באמצעות כלי איסוף נתונים זה, 3,000 קבצי סרט של חלבון ספייק SARS-CoV-2 נרכשים באופן אוטומטי, ועיבוד נתונים נוסף מתבצע כדי להשיג מבנה חלבון ספייק ברזולוציה של 3.9-4.4 Å.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blotting paper</td>
			<td>Ted Pella, INC.</td>
			<td>47000-100</td>
			<td>EM specimen preparation item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capsule</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>9432 909 97591</td>
			<td>EM specimen preparation unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1020863</td>
			<td>EM specimen preparation unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Clip</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036171</td>
			<td>EM specimen preparation item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Clip Insertion Tool</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>9432 909 97571</td>
			<td>EM specimen preparation tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Clip Ring</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036173</td>
			<td>EM specimen preparation item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM grid (Quantifoil)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Q3100AR1.3</td>
			<td>R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow discharge Machine</td>
			<td>Quorum</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Quorum GlowQube glow discharge machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 DED</td>
			<td>Gatan Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Cryo-EM data collection device (Camera)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latitude S Software</td>
			<td>Gatan Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading station</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1130698</td>
			<td>EM specimen preparation unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos 200 kV Arctica</td>
			<td>Thermo Scientific&#8482;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Cryo-Electron Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>EM specimen preparation unit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

user-friendly, high-throughput, and fully automated data acquisition software for single-particle cryo-electron microscopy

בשנים האחרונות, ההתקדמות הטכנולוגית והמתודולוגית במיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית של חלקיק יחיד (cryo-EM) סללה דרך חדשה לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה של מקרומולקולים ביולוגיים. למרות ההתקדמות המדהימה בהקפאה-EM, עדיין יש היקף לשיפור בהיבטים שונים של זרימת העבודה של ניתוח חלקיקים בודדים. ניתוח חלקיקים בודדים דורש חבילת תוכנה מתאימה לרכישת נתונים אוטומטית בתפוקה גבוהה. בשמונה השנים האחרונות פותחו מספר חבילות תוכנה אוטומטיות לרכישת נתונים להדמיה אוטומטית עבור קריו-EM של חלקיק יחיד. מאמר זה מציג יישום של צינור רכישת תמונה אוטומטי לחלוטין עבור biomolecules מנוצל בתנאים במינון נמוך. 
הוא מדגים חבילת תוכנה, שיכולה לאסוף נתוני cryo-EM באופן מלא, אוטומטי ומדויק. בנוסף, פרמטרים מיקרוסקופיים שונים נשלטים בקלות על ידי חבילת תוכנה זו. פרוטוקול זה מדגים את הפוטנציאל של חבילת תוכנה זו בהדמיה אוטומטית של תסמונת הנשימה החריפה החמורה-נגיף הקורונה 2 (SARS-CoV-2) חלבון ספייק עם מיקרוסקופ קריו-אלקטרונים 200 keV המצויד בגלאי אלקטרונים ישיר (DED). כ-3,000 תמונות של סרטי קריו-EM נרכשו במפגש אחד (48 שעות) של איסוף נתונים, שהניבו מבנה ברזולוציה אטומית של חלבון הספייק של SARS-CoV-2. יתר על כן, מחקר מבני זה מצביע על כך שחלבון הספייק מאמץ שני קונפורמציות עיקריות, 1-RBD (תחום מחייב קולטן) פתוח וכל RBD למטה קונפורמציות סגורות.

במצב המגיפה הנוכחי, cryo-EM ממלא תפקיד מרכזי באפיון המבנים של חלבונים שונים מ SARS-CoV-226,27,28,29, אשר עשויים לסייע בפיתוח חיסונים ותרופות נגד הנגיף. יש צורך דחוף במאמצי מחקר מהירים עם משאבי אנוש מוגבלים למאבק במחלת הקורונה של 2019. ...

Watch this Scientific Journal Video about User-friendly, High-throughput, and Fully Automated Data Acquisition Software for Single-particle Cryo-electron Microscopy at JoVE.com

User-friendly, High-throughput, and Fully Automated Data Acquisition Software for Single-particle Cryo-electron Microscopy

מיקרוסקופיה הקפאה-אלקטרונית של חלקיק יחיד דורשת חבילת תוכנה מתאימה וצנרת ידידותית למשתמש לרכישת נתונים אוטומטית בתפוקה גבוהה. כאן, אנו מציגים את היישום של חבילת תוכנה אוטומטית לחלוטין לרכישת תמונות, Latitude-S, וצינור מעשי לאיסוף נתונים של ביומולקולים משוקלים בתנאים במינון נמוך.

ידידותית למשתמש, תפוקה גבוהה ותוכנה אוטומטית לחלוטין לרכישת נתונים עבור מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית של חלקיק יחיד

In the past several years, technological and methodological advancements in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) have paved a new avenue for ...

תוכנה אוטומטית לרכישת נתונים נחוצה ביותר לאיסוף כמות עצומה של נתוני קריו לאפיון מבני של מקרומולכו ללא. חבילת תוכנה אוטומטית לרכישת נתונים שימשה כאן כדי לאפיין את המבנה של מקרומולקולות ביולוגיות שונות, הקשורות ישירות לביולוגיה של פתוגן. לדוגמה, מיקובקטריום, HIV ו- SASCO 2.ראשית, הפעל את תוכנת רכישת נתונים אוטומטית של Latitude-S על-ידי לחיצה על DigitalMicrograph מתפריט ההתחלה. לאחר מכן, בחר את מנהל הטכניקות ולאחר מכן את סמל Latitude-S עבור איסוף נתונים אוטומטי של חלקיק יחיד. כדי ליצור הפעלה המבוססת על הגדרות ההפעלה הקודמות, סמן את תיבת הסימון בהתבסס על הפעלה קודמת בלוח הצבעים ולאחר מכן בחר בלחצן החדש או כדי להמשיך בהפעלה קיימת, לחץ על לחצן המשך.כדי להתחיל הפעלה חדשה לחלוטין, לחץ על הכרטיסיה החדשה בלוח הצבעים. בחר את התיקיה המכילה את ההפעלה להמשך ובחר את התיקיה לשמירת הנתונים. לאחר מכן, לחץ על סמל ההגדרה ובתיבה סייר במצב מנוהל שמופיעה, הוסף מצב, הגדר את תנאי TEM, תנאי המצלמה ואפשרות תמונה או מלאי.לאחר מכן, תן שם למצב או פתח את סיכום הגדרת המצב כדי לפתוח את הגדרות השמירה. לאחר מכן, קבע את תצורת מצב האטלס על-ידי לחיצה על לוח המצב אטלס והגדר את הפרמטרים להגדלה, תנאי תאורה וזמן חשיפה למצלמה, ולחץ על הבא כדי לעבור למצב הבא. לאחר מכן קבע את תצורת מצב הרשת על-ידי לחיצה על לוח מצב הרשת, הגדר את הפרמטרים עבור אופטיקה הדמיית מיקרוסקופ, תנאי תאורה וזמן חשיפה למצלמה, ולחץ על הבא.קבע את תצורת מצב החור על ידי לחיצה על לוח החורים והגדר את אופטיקת ההדמיה, תנאי התאורה, הפרמטרים של binning וזמן החשיפה למצלמה. לאחר לחיצה על הבא, להגדיר את מצב המיקוד הבא על ידי לחיצה על לוח המוקד ולהגדיר את הגדרות המיקרוסקופ עבור אופטיקה הדמיה, תנאי תאורה, binning וזמן חשיפה למצלמה. לאחר מכן התמקדו באזור הפחמן האמורפי ליד החור ולחצו על הבא כדי לעבור למצב הבא.קבע את תצורת מצב הנתונים על-ידי לחיצה על לוח הנתונים והגדר את הפרמטרים עבור הגדרות מיקרוסקופ ולאחר מכן לחץ על הבא. לחץ על לוח התצורה של המוקד המציין את טווח ערכי ההשבתה ואת גודל השלב בכרטיסיה הנתונה ולחץ על הלחצן הבא כדי לעבור לשלב הבא. התמקד בתכונות הנדרשות ברשת ולחץ על לחצן הלכידה.לאחר מכן מקם את סימן הצלב האדום על אותה תכונה בכל תמונה של מצבים שונים. התחל עם מצבי מיקוד, נתונים וחורים, מכיוון שתחום הראייה גדול יותר מהמדינות אטלס ורשת. לאחר מכן, הגדל את מצבי אטלס ורשת כדי למקם את סימן הצלב האדום באותה תכונה.כדי לחשב את המיקומים וההיסט בין כל אחד מחמישה מצבים שונים ולשקף את המיקום וההיסט לחלון הפלט, לחץ על לחצן חשב. לחץ על לוח לכידה ובחר את גודל האטלס כדי לכסות את הרשת כולה או חלק מהרשת בהתבסס על הדרישה. כדי ללכוד את האטלס, נווט על האטלס ובחר את ריבוע הרשת בהתבסס על עובי הקרח.לאחר בחירת ריבועי הרשת הרצויים, לחץ על לחצן לוח הזמנים וצפה באריחים בריבוע הרשת מתמלאים כאשר כל ריבוע רשת נלכד. לאחר לחיצה על לחצן לוח הזמנים, בחר חור מייצג בריבוע הרשת על-ידי הוספת מיקום החור. לאחר רכישת תמונת החור, הגדר את הנתונים ואת מיקומי המוקד ושמור את הפריסה כתבנית.לחץ על חיפוש אוטומטי, הזן את גודל החור, ולחץ על כפתור למצוא בתוכנית כדי למצוא באופן אוטומטי את החורים המבוססים על הקוטר. הגדר את העוצמה כדי להסיר את החורים מכיכר הרשת וזיהום הקרח. ולאחר הוספת כלי הסימון הנבחרים והצהובים באמצעות חיפוש אוטומטי, לחץ על לחצן לוח הזמנים במשימות קו רוחב.לפי ההקרנה הידנית הראשונית של מיקרוגרפים מתוקנים בתנועה באמצעות תוכנת cisTEM, רוב הנתונים נמצאו בטווח האותות הרצוי. בנוסף, תמונות שנאספו בטווחי נטרול, נבדקו גם באופן ידני על ידי cisTEM. חלקיקי ספייק נבחרו באופן ידני כדי לחשב את ממוצעי המחלקה הדו-ממד להדמיה מבנית, מה שהציע בחום, אך אפיון מבני ברזולוציה גבוהה היה אפשרי באמצעות ערכת הנתונים המתאימה.הסיווג 3D ציין כי חלבון ספייק יש 1RBD באישור פתוח למעלה וכל RBD אחרים באישור סגירה למטה. האישורים הפתוחים של 1RBD של חלבון ספייק שוחזרו באמצעות סימטריה C1. מפת חלבון ספייק מיוצגת בתצוגה הצדדית העליונה והתחתון.ומפת ה-EM מצוידת במבנה אטומי להדמיה טובה יותר של שרשראות הצד. אישורי הסגירה של RBD היו מעודנים עם סימטריה C3 ודגם מזוקק תלת-ממדי ספייק ומפת EM, מצויד במבנה אטומי כפי שמוצג. ואישור ביניים של חלבון ספייק שזוהה כתחמת המשנה S2 הצביע על שרשראות הצד של שאריות חומצות אמינו בודדות.התוצאות הראו כי Latitude-S יכול לאסוף נתוני CRYO EM ברזולוציה גבוהה של מקרומולקולים ביולוגיים. תוכנה אוטומטית זו לאיסוף נתונים יכולה לשמש לכל מערכת מיקרוסקופ אלקטרונים אחרת לאיסוף נתונים באופן אוטומטי.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

קביעת מבנים מולקולריים של גליקופרוטאינים HIV מעטפה באמצעות אלקטרונים cryo-טומוגרפיה ו ממוצעים אוטומטי תת tomogram

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

מבנה של HIV-1 הרכבות capsid על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים cryo-ו איטרטיבי לשיקום שטח נדל סליל

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

תא הדמיה חיה של Bacillus subtilis ו Streptococcus pneumoniae באמצעות מיקרוסקופית אוטומטי זמן לשגות

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Assay כמותית תפוקה גבוהה מתא בודד Cytotoxicity לתאי T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

הקרנת תפוקה גבוהה לספקטרום רחב כימיים מעכבי RNA וירוסים

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

טכניקת התפוקה Fluorometric גבוהה להערכה של מקרופאג phagocytosis ויקטין פלמור

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

מיקרוסקופי מבוססת מבחנים עבור הקרנת תפוקה גבוהה של גורמי מארח המעורבים<em&gt; Brucella</em&gt; זיהום של תאים הלה

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

תפוקה גבוהה ג&#39;ין תיוג ב<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

פלטפורמה תפוקה גבוהה להקרנה של סלמונלה spp /שיגלה spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...