Name: user-friendly, high-throughput, and fully automated data acquisition software for single-particle cryo-electron microscopy
Uploaded: 2021-07-29T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about User-friendly, High-throughput, and Fully Automated Data Acquisition Software for Single-particle Cryo-electron Microscopy at JoVE.com

Reconhecemos o Departamento de Biotecnologia, Departamento de Ciência e Tecnologia (DST) e Ciência, e o Ministério do Desenvolvimento de Recursos Humanos (MHRD), Índia, para financiamento e a instalação crio-EM no IISc-Bangalore. Reconhecemos o Programa DBT-BUILDER (BT/INF/22/SP22844/2017) e o DST-FIST (SR/FST/LSII-039/2015) para a instalação Nacional Cryo-EM no IISc, Bangalore. Reconhecemos o apoio financeiro do Conselho de Pesquisa em Ciência e Engenharia (SERB) (Grant No.-SB/S2/RJN-145/2015, SERB-EMR/2016/000608 e SERB-IPA/2020/000094), DBT (Grant No. BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). Agradecemos à Sra. Ishika Pramanick por preparar grades crio-EM, coleta de dados crio-EM e preparar a Tabela de Materiais. Agradecemos também ao Sr. Suman Mishra pelo processamento de imagens crio-EM e por nos ajudar a preparar os números. Agradecemos ao Prof. Raghavan Varadarajan por nos ajudar a obter a amostra purificada de proteína de pico para este estudo.

NOTA: Três passos importantes são necessários para a coleta de dados crio-EM: 1. preparação da grade crio-EM, 2. calibração e alinhamento do microscópio, 3. coleta automática de dados (Figura 1). Além disso, a coleta automatizada de dados é subdividida em uma. seleção de área adequada, b. otimização do Latitude-S, c. iniciar a seleção automática de furos e d. iniciar a aquisição automática de dados (Figura 1).
1. P...

<ol>
	<li>Li, Y., Cash, J. N., Tesmer, J. J. G., Cianfrocco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+cryo-EM+enabled+by+user-free+preprocessing+routines.">High-throughput cryo-EM enabled by user-free preprocessing routines.</a> Structure. 28 (7), 858-869 (2020).</li><li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+An+automated+system+for+acquisition+of+images+from+vitreous+ice+specimens.">Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens.</a> Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).</li><li>Stagg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+cryoEM+data+acquisition+and+analysis+of+284+742+particles+of+GroEL.">Automated cryoEM data acquisition and analysis of 284 742 particles of GroEL.</a> Journal of Structural Biology. 155 (3), 470-481 (2006).</li><li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+in+electron+microscopy-30+years.">Single-particle reconstruction of biological macromolecules in electron microscopy-30 years.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 42 (3), 139-158 (2009).</li><li>Biyani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focus:+The+interface+between+data+collection+and+data+processing+in+cryo-EM.">Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM.</a> Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).</li><li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution.">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).</li><li>K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+resolution+revolution.">The resolution revolution.</a> Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).</li><li>McMullan, G., Chen, S., Henderson, R., Faruqi, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detective+quantum+efficiency+of+electron+area+detectors+in+electron+microscopy.">Detective quantum efficiency of electron area detectors in electron microscopy.</a> Ultramicroscopy. 109 (9), 1126-1143 (2009).</li><li>Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MotionCor2:+Anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy.">MotionCor2: Anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).</li><li>Grant, T., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+optimal+exposure+for+single+particle+cryo-EM+using+a+2.6+&#197;+reconstruction+of+rotavirus+VP6.">Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 &#197; reconstruction of rotavirus VP6.</a> eLife. 4, 06980 (2015).</li><li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+Implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FREALIGN:+High-resolution+refinement+of+single+particle+structures.">FREALIGN: High-resolution refinement of single particle structures.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CryoSPARC:+Algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CisTEM,+user-friendly+software+for+single-particle+image+processing.">CisTEM, user-friendly software for single-particle image processing.</a> eLife. 7, 35383 (2018).</li><li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>Zhang, P., Beatty, A., Milne, J. L. S., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+data+collection+with+a+Tecnai+12+electron+microscope:+Applications+for+molecular+imaging+by+cryomicroscopy.">Automated data collection with a Tecnai 12 electron microscope: Applications for molecular imaging by cryomicroscopy.</a> Journal of Structural Biology. 135 (3), 251-261 (2001).</li><li>Lei, J., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+acquisition+of+cryo-electron+micrographs+for+single+particle+reconstruction+on+an+FEI+Tecnai+electron+microscope.">Automated acquisition of cryo-electron micrographs for single particle reconstruction on an FEI Tecnai electron microscope.</a> Journal of Structural Biology. 150 (1), 69-80 (2005).</li><li>Potter, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+A+system+for+fully+automated+acquisition+of+1000+electron+micrographs+a+day.">Leginon: A system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day.</a> Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+molecular+microscopy:+The+new+Leginon+system.">Automated molecular microscopy: The new Leginon system.</a> Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).</li><li>Korinek, A., Beck, F., Baumeister, W., Nickell, S., Plitzko, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+controlled+cryo-electron+microscopy+-+TOM2+a+software+package+for+high-throughput+applications.">Computer controlled cryo-electron microscopy - TOM2 a software package for high-throughput applications.</a> Journal of Structural Biology. 175 (3), 394-405 (2011).</li><li>Shi, J., Williams, D. R., Stewart, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Script-Assisted+Microscopy+(SAM)+package+to+improve+data+acquisition+rates+on+FEI+Tecnai+electron+microscopes+equipped+with+Gatan+CCD+cameras.">A Script-Assisted Microscopy (SAM) package to improve data acquisition rates on FEI Tecnai electron microscopes equipped with Gatan CCD cameras.</a> Journal of Structural Biology. 164 (1), 166-169 (2008).</li><li>Marsh, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+software+platform+for+low-dose+electron+microscopy+and+tomography.">Modular software platform for low-dose electron microscopy and tomography.</a> Journal of Microscopy. 228, 384-389 (2007).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JADAS:+A+customizable+automated+data+acquisition+system+and+its+application+to+ice-embedded+single+particles.">JADAS: A customizable automated data acquisition system and its application to ice-embedded single particles.</a> Journal of Structural Biology. 165 (1), 1-9 (2009).</li><li>Pramanick, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+flexibility+and+structural+variability+of+SARS-CoV2+S+protein.">Conformational flexibility and structural variability of SARS-CoV2 S protein.</a> Structure. , (2021).</li><li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+neutralization+of+SARS-CoV-2+by+an+antibody+from+a+convalescent+patient.">Structural basis for the neutralization of SARS-CoV-2 by an antibody from a convalescent patient.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 27 (10), 950-958 (2020).</li><li>Hillen, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+replicating+SARS-CoV-2+polymerase.">Structure of replicating SARS-CoV-2 polymerase.</a> Nature. 584 (7819), 154-156 (2020).</li><li>Wrapp, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+2019-nCoV+spike+in+the+prefusion+conformation.">Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation.</a> Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).</li><li>Thoms, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+translational+shutdown+and+immune+evasion+by+the+Nsp1+protein+of+SARS-CoV-2.">Structural basis for translational shutdown and immune evasion by the Nsp1 protein of SARS-CoV-2.</a> Science. 369 (6508), 1249-1255 (2020).</li><li>Kumar, A., Sengupta, N., Dutta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+approach+for+preparing+graphene+oxide+tem+grids+for+stained+and+vitrified+biomolecules.">Simplified approach for preparing graphene oxide tem grids for stained and vitrified biomolecules.</a> Nanomaterials. 11 (3), 1-22 (2021).</li></ol>

Latitude-S é uma interface de usuário intuitiva, que fornece um ambiente para configurar e coletar automaticamente milhares de micrografias de alta resolução ou arquivos de filme em dois dias. Fornece fácil navegação através das grades e mantém a posição do estágio do microscópio enquanto se move de baixa ampliação para alta ampliação. Cada etapa de aquisição de dados com o Latitude-S é eficiente em termos de tempo, com recursos como uma interface de usuário simples, streaming rápido de dados a até...

Crio-EM de partículas únicas tornou-se uma técnica de biologia estrutural convencional para determinação de estrutura de alta resolução de macromoléculas biológicas1. A reconstrução de partículas únicas depende da aquisição de um grande número de micrografos de amostras vitrificadas para extrair imagens de partículas bidimensionais (2D), que são então usadas para reconstruir uma estrutura tridimensional (3D) de uma macromolécula biológica2,3. Antes do desenvolvimento dos DEDs, a resolução obtida a partir da reconstrução de partículas únicas variou entre 4 e 30 Å4,5. Recentemente, a resolução alcançável do crio-EM de partículas únicas ultrapassou 1,8 Å6. O DED e o software automatizado de aquisição de dados têm sido os principais contribuintes para esta revolução de resolução7, onde a intervenção humana para a coleta de dados é mínima. Geralmente, a imagem crio-EM é realizada a baixas taxas de dose de elétrons (20-100 e/Å2) para minimizar os danos causados pela radiação induzida pelo feixe de elétrons de amostras biológicas, o que contribui para a baixa relação sinal-ruído (SNR) na imagem. Este baixo SNR impede a caracterização das estruturas de alta resolução das macromoléculas biológicas utilizando análise de partículas únicas.
Os detectores de elétrons de nova geração são detectores baseados em CMOS (complementar metal-óxido-semicondutor), que podem superar esses obstáculos relacionados ao SNR baixos. Essas câmeras CMOS de detecção direta permitem leitura rápida do sinal, devido à qual a câmera contribui com melhor função de spread de ponto, SNR adequado e excelente eficiência quântica de detetive (DQE) para macromoléculas biológicas. As câmeras de detecção direta oferecem alto SNR8 e baixo ruído nas imagens gravadas, resultando em um aumento quantitativo na eficiência quântica detetive (DQE)-uma medida de quanto ruído um detector adiciona a uma imagem. Essas câmeras também gravam filmes à velocidade de centenas de quadros por segundo, o que permite a aquisição rápida de dados9,10. Todas essas características tornam as câmeras de detecção direta rápida adequadas para aplicações de baixa dose.
As imagens de pilha corrigidas por movimento são usadas para o processamento de dados para calcular a classificação 2D e reconstruir um mapa de densidade 3D de macromoléculas usando vários pacotes de software como RELION11, FREALIGN12, cryoSPARC13, cisTEM14 e EMAN215. No entanto, para análise de partículas únicas, é necessário um enorme conjunto de dados para alcançar uma estrutura de alta resolução. Portanto, pedágios automáticos de aquisição de dados são altamente essenciais para a coleta de dados. Para registrar grandes conjuntos de dados crio-EM, vários pacotes de software foram usados na última década. Pacotes de software dedicados, como AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, SerialEM19, UCSF-Image420, TOM221, SAM22, JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS e EPU, foram desenvolvidos para aquisição automatizada de dados.
Esses pacotes de software usam tarefas rotineiras para encontrar posições de furos automaticamente, correlacionando as imagens de baixa ampliação a imagens de alta ampliação, que auxilia na identificação de buracos com gelo vítreo de espessura de gelo apropriado para aquisição de imagens em condições de baixa dose. Esses pacotes de software reduziram o número de tarefas repetitivas e aumentaram o throughput da coleta de dados crio-EM, adquirindo uma vasta quantidade de dados de boa qualidade por vários dias continuamente, sem qualquer interrupção e a presença física do operador. Latitude-S é um pacote de software similar, que é usado para aquisição automática de dados para análise de partículas únicas. No entanto, este pacote de software só é adequado para DEDs K2/K3 e é fornecido com estes detectores.
Este protocolo demonstra o potencial do Latitude-S na aquisição automatizada de imagem da proteína de pico SARS-CoV-2 com um detector de elétrons direto equipado com um crio-EM de 200 keV (ver a Tabela de Materiais). Usando esta ferramenta de coleta de dados, 3.000 arquivos de filme de proteína de pico SARS-CoV-2 são automaticamente adquiridos, e mais processamento de dados é realizado para obter uma estrutura de proteína de pico de resolução 3.9-4.4 Å.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blotting paper</td>
			<td>Ted Pella, INC.</td>
			<td>47000-100</td>
			<td>EM specimen preparation item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capsule</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>9432 909 97591</td>
			<td>EM specimen preparation unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1020863</td>
			<td>EM specimen preparation unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Clip</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036171</td>
			<td>EM specimen preparation item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Clip Insertion Tool</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>9432 909 97571</td>
			<td>EM specimen preparation tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Clip Ring</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036173</td>
			<td>EM specimen preparation item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM grid (Quantifoil)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Q3100AR1.3</td>
			<td>R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow discharge Machine</td>
			<td>Quorum</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Quorum GlowQube glow discharge machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 DED</td>
			<td>Gatan Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Cryo-EM data collection device (Camera)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latitude S Software</td>
			<td>Gatan Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading station</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1130698</td>
			<td>EM specimen preparation unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos 200 kV Arctica</td>
			<td>Thermo Scientific&#8482;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Cryo-Electron Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>EM specimen preparation unit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

user-friendly, high-throughput, and fully automated data acquisition software for single-particle cryo-electron microscopy

Nos últimos anos, avanços tecnológicos e metodológicos na microscopia crio-elétron de partículas únicas (crio-EM) abriram um novo caminho para a determinação da estrutura de alta resolução de macromoléculas biológicas. Apesar dos avanços notáveis no crio-EM, ainda há espaço para melhorias em vários aspectos do fluxo de trabalho de análise de partículas únicas. A análise de partículas únicas exige um pacote de software adequado para aquisição automática de dados de alto rendimento. Vários pacotes automáticos de software de aquisição de dados foram desenvolvidos para imagens automáticas para crio-EM de uma única partícula nos últimos oito anos. Este artigo apresenta a aplicação de um pipeline de aquisição de imagens totalmente automatizado para biomoléculas vitrificadas em condições de baixa dose. 
Ele demonstra um pacote de software, que pode coletar dados crio-EM de forma completa, automática e precisa. Além disso, vários parâmetros microscópicos são facilmente controlados por este pacote de software. Este protocolo demonstra o potencial deste pacote de software em imagens automatizadas da proteína de pico da síndrome respiratória aguda grave-coronavírus 2 (SARS-CoV-2) com um microscópio crio-elétron de 200 keV equipado com um detector de elétrons direto (DED). Cerca de 3.000 imagens de filmes crio-EM foram adquiridas em uma única sessão (48 h) de coleta de dados, produzindo uma estrutura de resolução atômica da proteína de pico do SARS-CoV-2. Além disso, este estudo estrutural indica que a proteína do pico adota duas principais conformações, 1-RBD (domínio de ligação receptora) abertas e todas as conformidades fechadas de RBD.

Na atual situação pandêmica, o crio-EM desempenha um papel fundamental na caracterização das estruturas de várias proteínas do SARS-CoV-226,27,28,29, que podem ajudar a desenvolver vacinas e medicamentos contra o vírus. Há uma necessidade urgente de esforços de pesquisa acelerados com recursos humanos limitados para combater a doença coronavírus de 2019. A aquisição de dados em cr...

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User-friendly, High-throughput, and Fully Automated Data Acquisition Software for Single-particle Cryo-electron Microscopy

A microscopia crio-elétron de partículas únicas exige um pacote de software adequado e um pipeline fácil de usar para aquisição automática de dados de alto rendimento. Aqui, apresentamos a aplicação de um pacote de software de aquisição de imagens totalmente automatizado, o Latitude-S, e um pipeline prático para coleta de dados de biomoléculas vitrificadas em condições de baixa dose.

Software de aquisição de dados totalmente automatizado para microscopia crio-elétron de partículas únicas

In the past several years, technological and methodological advancements in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) have paved a new avenue for ...

O Automated Data Acquisition Software é extremamente necessário para coletar enorme quantidade de dados criogênicos para caracterização estrutural de macromoleculess biológico. O pacote de software automatizado de aquisição de dados foi utilizado aqui para caracterizar a estrutura de vários macromoleculess biológicos, que estão diretamente associados à biologia do patógeno. Por exemplo, micobacterium, HIV e SASCO 2.Para começar, inicie o Software de Aquisição automatizada de dados Latitude-S clicando no DigitalMicrograph a partir do menu inicial. Em seguida, selecione o Gerenciador de técnicas e, em seguida, o ícone Latitude-S para coleta automatizada de dados de partículas únicas. Para criar uma sessão com base nas configurações da sessão anterior, verifique a caixa de seleção de sessão anterior na paleta e, em seguida, selecione o novo botão ou para continuar uma sessão existente, pressione o botão continuar.Para iniciar uma sessão totalmente nova, clique na nova guia na paleta. Escolha a pasta que contém a sessão a ser continuada e selecione a pasta para salvar os dados. Em seguida, clique no ícone de configuração e na caixa de exploração de estado gerenciado que aparece, adicione estado, defina a condição TEM, condição da câmera e opção de imagem ou estoque.E, em seguida, nomeie o estado ou abra o resumo da configuração do estado para abrir as configurações de salvamento. Em seguida, configure o estado atlas clicando na paleta de estado Atlas e defina os parâmetros para ampliação, condições de iluminação e tempo de exposição da câmera, e clique ao lado para mover-se para o próximo estado. Em seguida, configure o estado da grade clicando na paleta de estado da grade, defina os parâmetros para óptica de imagem de microscópio, condições de iluminação e tempo de exposição da câmera e clique em seguir.Configure o estado do orifício clicando na paleta de furos e defina a óptica de imagem, as condições de iluminação, o binning e os parâmetros de tempo de exposição da câmera. Depois de clicar em seguir, configure o próximo estado de foco clicando na paleta de foco e defina as configurações do microscópio para óptica de imagem, condições de iluminação, binning e tempo de exposição da câmera. Em seguida, concentre-se na área de carbono amorfo perto do buraco e clique ao lado para mover-se para o próximo estado.Configure o estado de dados clicando na paleta de dados e defina os parâmetros para configurações de microscópio e clique em seguir. Clique na paleta de configuração de foco especificando a faixa de valores de desfoque e o tamanho da etapa na guia dada e pressione o próximo botão para passar para a próxima etapa. Concentre-se nos recursos necessários na grade e clique no botão de captura.Em seguida, posicione a marca da cruz vermelha na mesma característica em cada imagem de estados diferentes. Comece pelos estados Focus, Data e Hole, pois o campo de visão é maior do que os estados Atlas e Grade. Em seguida, zoom nos estados Atlas e Grid para posicionar a marca da cruz vermelha no mesmo recurso.Para calcular as posições e deslocamentos entre cada um dos cinco estados diferentes e refletir as posições e deslocamentos para a janela de saída, clique no botão de cálculo. Clique na paleta de captura e escolha o tamanho do Atlas para cobrir toda a grade ou parte da grade com base no requisito. Para capturar o Atlas, navegue no Atlas e selecione o quadrado da grade com base na espessura do gelo.Uma vez selecionados os quadrados de grade desejados, clique no botão de programação e observe as telhas no quadrado da grade preenchida à medida que cada quadrado de grade for capturado. Uma vez clicado o botão de programação, selecione um orifício representativo no quadrado da grade adicionando a posição do orifício. Uma vez adquirida a imagem do furo, defina os dados e as posições de foco e salve o layout como um modelo.Clique em encontrar automaticamente, digite o tamanho do furo e clique no botão encontrar no programa para encontrar automaticamente os orifícios com base no diâmetro. Configure a intensidade para remover os orifícios do quadrado da rede e contaminação do gelo. E depois de adicionar as ferramentas selecionadas e amarelas de marca através de auto-find, clique no botão de programação em tarefas de latitude.De acordo com a triagem manual inicial de micrografos corrigidos por movimento usando o software cisTEM, a maioria dos dados foi encontrada dentro do intervalo de sinal desejado. Além disso, as imagens coletadas nas faixas de desfocus também foram verificadas manualmente pelo cisTEM. As partículas de espigão foram escolhidas manualmente para calcular as médias da classe 2D para visualização estrutural, o que fortemente sugeriu, mas a caracterização estrutural de alta resolução foi possível usando o respectivo conjunto de dados.A classificação 3D indicou que a Spike Protein tem 1RBD em confirmação aberta e todos os outros RBD em confirmação de fechamento. As confirmações abertas do 1RBD até a Proteína Spike foram reconstruídas usando simetria C1. O mapa spike protein é representado nas vistas laterais de cima e de baixo.E o mapa EM é equipado com estrutura atômica para melhor visualização das cadeias laterais. As confirmações de fechamento rbd foram refinadas com simetria C3 e o modelo refinado spike 3D e mapa EM, equipado com estrutura atômica como mostrado. E a confirmação intermediária da Proteína Spike identificada como sub domínio S2 indicou as cadeias laterais de resíduos individuais de aminoácidos.Os resultados sugeriram que o Latitude-S pode coletar dados crio EM de alta resolução de macromoléculas biológicas. Este Software automatizado de coleta de dados poderia ser usado em qualquer outro sistema de microscopia eletrônica para coletar dados automaticamente.

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