Name: user-friendly, high-throughput, and fully automated data acquisition software for single-particle cryo-electron microscopy
Uploaded: 2021-07-29T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about User-friendly, High-throughput, and Fully Automated Data Acquisition Software for Single-particle Cryo-electron Microscopy at JoVE.com

Мы выражаем признательность Департаменту биотехнологии, Департаменту науки и техники (DST) и науки, а также Министерству развития людских ресурсов (MHRD), Индия, за финансирование и крио-ЭМ-объект в IISc-Бангалоре. Мы принимаем участие в программе DBT-BUILDER (BT/INF/22/SP22844/2017) и DST-FIST (SR/FST/LSII-039/2015) для Национального крио-ЭМ-объекта в IISc, Бангалор. Мы выражаем финансовую поддержку со стороны Совета по научным и инженерным исследованиям (SERB) (грант No.-SB/S2/RJN-145/2015, SERB-EMR/2016/000608 и SERB-IPA/2020/000094), DBT (Грант No. BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). Мы благодарим г-жу Исику Праманик за подготовку крио-ЭМ-сетей, сбор крио-ЭМ данных и подготовку Таблицы материалов. Мы также благодарим г-на Сумана Мишру за крио-ЭМ обработку изображений и за помощь в подготовке рисунков. Мы благодарим профессора Рагхавана Варадараджана за помощь в получении очищенного образца спайкового белка для этого исследования.

ПРИМЕЧАНИЕ: Для сбора крио-ЭМ данных необходимы три важных этапа: 1. подготовка крио-ЭМ сетки, 2. калибровка и выравнивание микроскопа, 3. автоматический сбор данных (рисунок 1). Кроме того, автоматизированный сбор данных подразделяется на a. выбор подходящей области, b. оптим...

<ol>
	<li>Li, Y., Cash, J. N., Tesmer, J. J. G., Cianfrocco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+cryo-EM+enabled+by+user-free+preprocessing+routines.">High-throughput cryo-EM enabled by user-free preprocessing routines.</a> Structure. 28 (7), 858-869 (2020).</li><li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+An+automated+system+for+acquisition+of+images+from+vitreous+ice+specimens.">Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens.</a> Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).</li><li>Stagg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+cryoEM+data+acquisition+and+analysis+of+284+742+particles+of+GroEL.">Automated cryoEM data acquisition and analysis of 284 742 particles of GroEL.</a> Journal of Structural Biology. 155 (3), 470-481 (2006).</li><li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+in+electron+microscopy-30+years.">Single-particle reconstruction of biological macromolecules in electron microscopy-30 years.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 42 (3), 139-158 (2009).</li><li>Biyani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focus:+The+interface+between+data+collection+and+data+processing+in+cryo-EM.">Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM.</a> Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).</li><li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution.">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).</li><li>K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+resolution+revolution.">The resolution revolution.</a> Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).</li><li>McMullan, G., Chen, S., Henderson, R., Faruqi, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detective+quantum+efficiency+of+electron+area+detectors+in+electron+microscopy.">Detective quantum efficiency of electron area detectors in electron microscopy.</a> Ultramicroscopy. 109 (9), 1126-1143 (2009).</li><li>Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MotionCor2:+Anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy.">MotionCor2: Anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).</li><li>Grant, T., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+optimal+exposure+for+single+particle+cryo-EM+using+a+2.6+&#197;+reconstruction+of+rotavirus+VP6.">Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 &#197; reconstruction of rotavirus VP6.</a> eLife. 4, 06980 (2015).</li><li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+Implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FREALIGN:+High-resolution+refinement+of+single+particle+structures.">FREALIGN: High-resolution refinement of single particle structures.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CryoSPARC:+Algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CisTEM,+user-friendly+software+for+single-particle+image+processing.">CisTEM, user-friendly software for single-particle image processing.</a> eLife. 7, 35383 (2018).</li><li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>Zhang, P., Beatty, A., Milne, J. L. S., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+data+collection+with+a+Tecnai+12+electron+microscope:+Applications+for+molecular+imaging+by+cryomicroscopy.">Automated data collection with a Tecnai 12 electron microscope: Applications for molecular imaging by cryomicroscopy.</a> Journal of Structural Biology. 135 (3), 251-261 (2001).</li><li>Lei, J., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+acquisition+of+cryo-electron+micrographs+for+single+particle+reconstruction+on+an+FEI+Tecnai+electron+microscope.">Automated acquisition of cryo-electron micrographs for single particle reconstruction on an FEI Tecnai electron microscope.</a> Journal of Structural Biology. 150 (1), 69-80 (2005).</li><li>Potter, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+A+system+for+fully+automated+acquisition+of+1000+electron+micrographs+a+day.">Leginon: A system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day.</a> Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+molecular+microscopy:+The+new+Leginon+system.">Automated molecular microscopy: The new Leginon system.</a> Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).</li><li>Korinek, A., Beck, F., Baumeister, W., Nickell, S., Plitzko, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+controlled+cryo-electron+microscopy+-+TOM2+a+software+package+for+high-throughput+applications.">Computer controlled cryo-electron microscopy - TOM2 a software package for high-throughput applications.</a> Journal of Structural Biology. 175 (3), 394-405 (2011).</li><li>Shi, J., Williams, D. R., Stewart, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Script-Assisted+Microscopy+(SAM)+package+to+improve+data+acquisition+rates+on+FEI+Tecnai+electron+microscopes+equipped+with+Gatan+CCD+cameras.">A Script-Assisted Microscopy (SAM) package to improve data acquisition rates on FEI Tecnai electron microscopes equipped with Gatan CCD cameras.</a> Journal of Structural Biology. 164 (1), 166-169 (2008).</li><li>Marsh, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+software+platform+for+low-dose+electron+microscopy+and+tomography.">Modular software platform for low-dose electron microscopy and tomography.</a> Journal of Microscopy. 228, 384-389 (2007).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JADAS:+A+customizable+automated+data+acquisition+system+and+its+application+to+ice-embedded+single+particles.">JADAS: A customizable automated data acquisition system and its application to ice-embedded single particles.</a> Journal of Structural Biology. 165 (1), 1-9 (2009).</li><li>Pramanick, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+flexibility+and+structural+variability+of+SARS-CoV2+S+protein.">Conformational flexibility and structural variability of SARS-CoV2 S protein.</a> Structure. , (2021).</li><li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+neutralization+of+SARS-CoV-2+by+an+antibody+from+a+convalescent+patient.">Structural basis for the neutralization of SARS-CoV-2 by an antibody from a convalescent patient.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 27 (10), 950-958 (2020).</li><li>Hillen, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+replicating+SARS-CoV-2+polymerase.">Structure of replicating SARS-CoV-2 polymerase.</a> Nature. 584 (7819), 154-156 (2020).</li><li>Wrapp, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+2019-nCoV+spike+in+the+prefusion+conformation.">Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation.</a> Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).</li><li>Thoms, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+translational+shutdown+and+immune+evasion+by+the+Nsp1+protein+of+SARS-CoV-2.">Structural basis for translational shutdown and immune evasion by the Nsp1 protein of SARS-CoV-2.</a> Science. 369 (6508), 1249-1255 (2020).</li><li>Kumar, A., Sengupta, N., Dutta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+approach+for+preparing+graphene+oxide+tem+grids+for+stained+and+vitrified+biomolecules.">Simplified approach for preparing graphene oxide tem grids for stained and vitrified biomolecules.</a> Nanomaterials. 11 (3), 1-22 (2021).</li></ol>

Latitude-S — это интуитивно понятный пользовательский интерфейс, который обеспечивает среду для автоматической настройки и сбора тысяч микроснимков высокого разрешения или файлов фильмов за два дня. Он обеспечивает легкую навигацию по сеткам и поддерживает положение ступени микроскопа, ...

Крио-ЭМ с одной частицей стал основным методом структурной биологии для определения структуры биологических макромолекул с высоким разрешением1. Реконструкция одной частицы зависит от получения огромного количества микроснимков остеклованных образцов для извлечения двумерных (2D) изображений частиц, которые затем используются для реконструкции трехмерной (3D) структуры биологической макромолекулы2,3. До разработки DED разрешение, достигнутое при реконструкции одной частицы, варьировалось от 4 до 30 Å4,5. В последнее время достижимое разрешение от крио-ЭМ с одной частицей превысило 1,8 Å6. DED и автоматизированное программное обеспечение для сбора данных внесли основной вклад в эту революцию резолюции7, где вмешательство человека в сбор данных минимально. Как правило, крио-ЭМ-визуализация выполняется при низких мощностях дозы электронов (20-100 e/Å2) для минимизации электронно-лучевого радиационного повреждения биологических образцов, что способствует низкому соотношению сигнал/шум (SNR) на изображении. Этот низкий SNR препятствует характеристике структур с высоким разрешением биологических макромолекул с использованием анализа одиночных частиц.
Электронное детекторы нового поколения представляют собой кмОП-детекторы на основе КМОП (комплементарные металл-оксид-полупроводники), которые могут преодолевать эти препятствия, связанные с низким SNR. Эти КМОП-камеры с прямым обнаружением обеспечивают быстрое считывание сигнала, благодаря чему камера обеспечивает лучшую функцию точечного распространения, подходящую SNR и отличную детективную квантовую эффективность (DQE) для биологических макромолекул. Камеры прямого обнаружения обеспечивают высокий SNR8 и низкий уровень шума в записанных изображениях, что приводит к количественному увеличению квантовой эффективности детектива (DQE) - меры того, сколько шума детектор добавляет к изображению. Эти камеры также записывают фильмы со скоростью сотни кадров в секунду, что позволяет быстро собирать данные9,10. Все эти характеристики делают камеры быстрого прямого обнаружения пригодными для применения в низких дозах.
Стековые изображения с коррекцией движения используются для обработки данных для расчета 2D-классификации и реконструкции 3D-карты плотности макромолекул с помощью различных программных пакетов, таких как RELION11, FREALIGN12, cryoSPARC13, cisTEM14 и EMAN215. Однако для анализа одной частицы требуется огромный набор данных для достижения структуры с высоким разрешением. Поэтому плата за автоматический сбор данных имеет большое значение для сбора данных. Для записи больших наборов крио-ЭМ данных за последнее десятилетие было использовано несколько программных пакетов. Для автоматизированного сбора данных были разработаны специальные программные пакеты, такие как AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, SerialEM19, UCSF-Image420, TOM221, SAM22, JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS и EPU.
Эти программные пакеты используют рутинные задачи для автоматического поиска положений отверстий путем корреляции изображений с низким увеличением с изображениями с высоким увеличением, что помогает идентифицировать отверстия со стекловидным льдом соответствующей толщины льда для получения изображений в условиях низкой дозы. Эти программные пакеты сократили количество повторяющихся задач и увеличили пропускную способность сбора крио-ЭМ данных за счет получения огромного количества высококачественных данных в течение нескольких дней непрерывно, без каких-либо перерывов и физического присутствия оператора. Latitude-S - это аналогичный программный пакет, который используется для автоматического сбора данных для анализа одиночных частиц. Однако этот программный пакет подходит только для DED K2/K3 и поставляется с этими детекторами.
Этот протокол демонстрирует потенциал Latitude-S в автоматизированном получении изображений спайкового белка SARS-CoV-2 с помощью прямого электронного детектора, оснащенного крио-ЭМ 200 кэВ (см. Таблицу материалов). С помощью этого инструмента сбора данных автоматически получают 3000 файлов фильмов спайкового белка SARS-CoV-2, и проводится дальнейшая обработка данных для получения структуры спайкового белка с разрешением 3,9-4,4 Å.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blotting paper</td>
			<td>Ted Pella, INC.</td>
			<td>47000-100</td>
			<td>EM specimen preparation item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capsule</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>9432 909 97591</td>
			<td>EM specimen preparation unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1020863</td>
			<td>EM specimen preparation unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Clip</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036171</td>
			<td>EM specimen preparation item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Clip Insertion Tool</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>9432 909 97571</td>
			<td>EM specimen preparation tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Clip Ring</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036173</td>
			<td>EM specimen preparation item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM grid (Quantifoil)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Q3100AR1.3</td>
			<td>R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow discharge Machine</td>
			<td>Quorum</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Quorum GlowQube glow discharge machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 DED</td>
			<td>Gatan Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Cryo-EM data collection device (Camera)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latitude S Software</td>
			<td>Gatan Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading station</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1130698</td>
			<td>EM specimen preparation unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos 200 kV Arctica</td>
			<td>Thermo Scientific&#8482;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Cryo-Electron Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>EM specimen preparation unit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

user-friendly, high-throughput, and fully automated data acquisition software for single-particle cryo-electron microscopy

За последние несколько лет технологические и методологические достижения в области криоэлектронной микроскопии с одной частицей (крио-ЭМ) проложили новый путь для определения структуры биологических макромолекул с высоким разрешением. Несмотря на значительные достижения в области крио-ЭМ, все еще есть возможности для улучшения различных аспектов рабочего процесса анализа одной частицы. Для анализа одной частиц требуется подходящий программный пакет для автоматического сбора данных с высокой пропускной способностью. За последние восемь лет было разработано несколько пакетов программного обеспечения для автоматического сбора данных для автоматической визуализации крио-ЭМ с одной частицей. В данной статье представлено применение полностью автоматизированного конвейера сбора изображений для остеклованных биомолекул в условиях низких доз. 
Он демонстрирует программный пакет, который может собирать крио-EM данные полностью, автоматически и точно. Кроме того, различные микроскопические параметры легко контролируются этим программным пакетом. Этот протокол демонстрирует потенциал этого программного пакета в автоматизированной визуализации спайкового белка тяжелого острого респираторного синдрома-коронавируса 2 (SARS-CoV-2) с помощью криоэлектронного микроскопа 200 кэВ, оснащенного прямым электронным детектором (DED). За один сеанс (48 ч) сбора данных было получено около 3000 крио-ЭМ-изображений фильмов, что дало структуру с атомным разрешением спайкового белка SARS-CoV-2. Кроме того, это структурное исследование показывает, что спайковый белок принимает две основные конформации: 1-RBD (рецептор-связывающий домен) вверх открытым и все RBD вниз закрытые конформации.

В нынешней пандемической ситуации крио-ЭМ играет ключевую роль в характеристике структур различных белков из SARS-CoV-226,27,28,29, которые могут помочь в разработке вакцин и лекарств против вируса. Существует острая необход...

Watch this Scientific Journal Video about User-friendly, High-throughput, and Fully Automated Data Acquisition Software for Single-particle Cryo-electron Microscopy at JoVE.com

User-friendly, High-throughput, and Fully Automated Data Acquisition Software for Single-particle Cryo-electron Microscopy

Одночастичная криоэлектронная микроскопия требует подходящего программного пакета и удобного для пользователя конвейера для автоматического сбора данных с высокой пропускной способностью. Здесь мы представляем применение полностью автоматизированного программного пакета для сбора изображений Latitude-S и практического конвейера для сбора данных остекленных биомолекул в условиях низких доз.

Удобное, высокопроизводительное и полностью автоматизированное программное обеспечение для сбора данных для одночастичной криоэлектронной микроскопии

In the past several years, technological and methodological advancements in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) have paved a new avenue for ...

Автоматизированное программное обеспечение для сбора данных крайне необходимо для сбора огромного количества криозданных для структурной характеристики биологических макромолекулов. Пакет Automated Data Acquisition Software был использован здесь для характеристики структуры различных биологических макромолекулов, которые напрямую связаны с биологией патогенов. Например, микобактерии, ВИЧ и SASCO 2.Для начала запустите программное обеспечение Latitude-S Automated Data Acquisition Software, щелкнув DigitalMicrograph в меню «Пуск». Затем выберите диспетчер техники, а затем значок Latitude-S для автоматического сбора данных по одной частице. Чтобы создать сеанс на основе параметров предыдущего сеанса, установите флажок на основе предыдущего сеанса в палитре, а затем нажмите кнопку «Новый» или, чтобы продолжить существующий сеанс, нажмите кнопку «Продолжить».Чтобы начать совершенно новый сеанс, нажмите на новую вкладку в палитре. Выберите папку, содержащую сеанс, который необходимо продолжить, и выберите папку для сохранения данных. Затем щелкните значок настройки и в появившемся поле просмотра управляемого состояния добавьте состояние, установите условие TEM, условие камеры и параметр изображения или запаса.Затем присвойте государству имя или откройте сводку настроек состояния, чтобы открыть параметры сохранения. Затем настройте состояние Atlas, щелкнув палитру состояния Atlas, и задайте параметры увеличения, условий освещения и времени экспозиции камеры, а затем нажмите next, чтобы перейти к следующему состоянию. Затем настройте состояние сетки, щелкнув палитру состояния сетки, установите параметры для оптики визуализации микроскопа, условия освещения и время экспозиции камеры, и нажмите «Далее».Настройте состояние отверстия, щелкнув по палитре отверстий, и установите оптику изображения, условия освещения, биннинг и параметры времени экспозиции камеры. После нажатия кнопки «Далее» настройте следующее состояние фокусировки, щелкнув палитру фокусировки, и установите параметры микроскопа для оптики изображения, условий освещения, биннинга и времени экспозиции камеры. Затем сосредоточьтесь на аморфной углеродной области рядом с отверстием и нажмите далее, чтобы перейти к следующему состоянию.Настройте состояние данных, щелкнув по палитре данных и задав параметры для параметров микроскопа, затем нажмите «Далее». Нажмите на палитру конфигурации фокусировки, указав диапазон значений расфокусировки и размер шага в данной вкладке, и нажмите следующую кнопку, чтобы перейти к следующему шагу. Сосредоточьтесь на необходимых функциях на сетке и нажмите кнопку захвата.Затем поместите знак красного креста на один и тот же объект на каждом изображении разных состояний. Начните с состояний Фокус, Данные и Дыра, потому что поле зрения больше, чем состояния Атласа и Сетки. Затем увеличьте масштаб состояний Atlas и Grid, чтобы расположить красный крестик на том же объекте.Чтобы вычислить позиции и смещение между каждым из пяти различных состояний и отразить позиции и смещения в окне вывода, нажмите кнопку вычисления. Нажмите на палитру захвата и выберите размер атласа, чтобы охватить всю сетку или часть сетки в зависимости от требования. Чтобы захватить Атлас, перейдите по Атласу и выберите квадрат сетки в зависимости от толщины льда.После того, как нужные квадраты сетки выбраны, нажмите кнопку расписания и наблюдайте, как плитки в квадрате сетки заполняются по мере захвата каждого квадрата сетки. После нажатия кнопки расписания выберите репрезентативное отверстие в квадрате сетки, добавив положение отверстия. После получения изображения отверстия определите данные и позиции фокусировки и сохраните макет в качестве шаблона.Нажмите на автоматический поиск, введите размер отверстия и нажмите кнопку поиска в программе, чтобы автоматически найти отверстия на основе диаметра. Установите интенсивность для удаления отверстий из сетки квадрата и загрязнения льдом. А после добавления выбранных и желтых инструментов меток через автонайс, нажмите на кнопку расписания в локаторных задачах.В соответствии с первоначальным ручным скринингом микроснимков с коррекцией движения с использованием программного обеспечения cisTEM, большинство данных оказались в пределах желаемого диапазона сигнала. Кроме того, изображения, собранные в диапазонах расфокусировки, также были вручную проверены cisTEM. Частицы шипов были выбраны вручную для расчета средних значений 2D-класса для структурной визуализации, что настоятельно предполагалось, но структурная характеристика с высоким разрешением была возможна с использованием соответствующего набора данных.3D-классификация показала, что Spike Protein имеет 1RBD в открытом подтверждении и все другие RBD в подтверждении закрытия. Открытые подтверждения спайкового белка 1RBD были реконструированы с использованием симметрии C1. Карта Spike Protein представлена в боковых верхних и нижних видах.А эм-карта оснащена атомной структурой для лучшей визуализации боковых цепей. Близкие подтверждения RBD были уточнены с помощью симметрии C3 и улучшенной 3D-модели и ЭМ-карты, оснащенной атомной структурой, как показано на рисунке. А промежуточное подтверждение спайкового белка, идентифицированного как поддомен S2, указывало на боковые цепи отдельных аминокислотных остатков.Результаты показали, что Latitude-S может собирать криоэм-данные высокого разрешения биологических макромолекул. Это автоматизированное программное обеспечение для сбора данных может быть использовано в любой другой системе электронной микроскопии для автоматического сбора данных.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Определение молекулярной структуры гликопротеинов ВИЧ Конверт использованием крио-электронной томографии и автоматизированных Sub-томограмма усреднения

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

Структура ВИЧ-1 капсида Ассамблеи по крио-электронной микроскопии и итерационных Винтовая реальном пространстве реконструкции

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Живая изображений Ячейка Сенная Bacillus И Пневмококк С использованием средства аварийного Покадровый микроскопии

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Высокая пропускная способность Метод обнаружения для вируса гриппа

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Количественные высокой пропускной Single-клеточной цитотоксичности анализа для Т-клеток

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Высокопроизводительный скрининг для широкого спектра химических ингибиторов РНК-содержащих вирусов

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Микроскопия основе Анализы для высокопроизводительного скрининга на хост факторов, участвующих в<em&gt; Brucella</em&gt; Инфицирование клеток HeLa

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

Флуоресцентным на основе анализа Лимфоцит Подходит для высокопроизводительного скрининга малых молекул

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Высок объём платформы для проверки Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Высок объём шигеллезом-конкретные бактерицидной Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...