Name: user-friendly, high-throughput, and fully automated data acquisition software for single-particle cryo-electron microscopy
Uploaded: 2021-07-29T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about User-friendly, High-throughput, and Fully Automated Data Acquisition Software for Single-particle Cryo-electron Microscopy at JoVE.com

Biyoteknoloji, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (DST) ve Bilim Bakanlığı ile İnsan Kaynakları Geliştirme Bakanlığı (MHRD), Hindistan'ı, IISc-Bangalore'daki kriyo-EM tesisini finanse etmek için kabul ediyoruz. IISc, Bangalore'daki National Cryo-EM tesisi için DBT-BUILDER Programı (BT/INF/22/SP22844/2017) ve DST-FIST (SR/FST/LSII-039/2015) onaylıyoruz. Bilim ve Mühendislik Araştırma Kurulu (SERB) (Grant No.-SB/S2/RJN-145/2015, SERB-EMR/2016/000608 ve SERB-IPA/2020/000094), DBT (Grant No. BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). Kriyo-EM ızgaraları, kriyo-EM veri toplama ve Malzeme Masası'nı hazırladığı için Bayan Ishika Pramanick'e teşekkür ederiz. Ayrıca Bay Suman Mishra'ya kriyo-EM görüntü işleme ve rakamları hazırlamamıza yardımcı olduğu için teşekkür ederiz. Bu çalışma için saflaştırılmış spike protein örneğini elde etmemize yardımcı olduğu için Prof. Raghavan Varadarajan'a teşekkür ederiz.

NOT: Kriyo-EM veri toplama için üç önemli adım gereklidir: 1. kriyo-EM ızgara hazırlama, 2. mikroskobun kalibrasyonu ve hizalanması, 3. otomatik veri toplama (Şekil 1). Ayrıca, otomatik veri toplama a. uygun alan seçimi, b. Latitude-S optimizasyonu, c. otomatik delik seçimine başla ve d. otomatik veri toplamayı başlat (Şekil 1) olarak ikiye ayrılır.
1. Otomatik veri toplama için Cryo-EM ızgara hazırlama ve örnek y?...

<ol>
	<li>Li, Y., Cash, J. N., Tesmer, J. J. G., Cianfrocco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+cryo-EM+enabled+by+user-free+preprocessing+routines.">High-throughput cryo-EM enabled by user-free preprocessing routines.</a> Structure. 28 (7), 858-869 (2020).</li><li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+An+automated+system+for+acquisition+of+images+from+vitreous+ice+specimens.">Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens.</a> Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).</li><li>Stagg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+cryoEM+data+acquisition+and+analysis+of+284+742+particles+of+GroEL.">Automated cryoEM data acquisition and analysis of 284 742 particles of GroEL.</a> Journal of Structural Biology. 155 (3), 470-481 (2006).</li><li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+in+electron+microscopy-30+years.">Single-particle reconstruction of biological macromolecules in electron microscopy-30 years.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 42 (3), 139-158 (2009).</li><li>Biyani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focus:+The+interface+between+data+collection+and+data+processing+in+cryo-EM.">Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM.</a> Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).</li><li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution.">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).</li><li>K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+resolution+revolution.">The resolution revolution.</a> Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).</li><li>McMullan, G., Chen, S., Henderson, R., Faruqi, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detective+quantum+efficiency+of+electron+area+detectors+in+electron+microscopy.">Detective quantum efficiency of electron area detectors in electron microscopy.</a> Ultramicroscopy. 109 (9), 1126-1143 (2009).</li><li>Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MotionCor2:+Anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy.">MotionCor2: Anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).</li><li>Grant, T., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+optimal+exposure+for+single+particle+cryo-EM+using+a+2.6+&#197;+reconstruction+of+rotavirus+VP6.">Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 &#197; reconstruction of rotavirus VP6.</a> eLife. 4, 06980 (2015).</li><li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+Implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FREALIGN:+High-resolution+refinement+of+single+particle+structures.">FREALIGN: High-resolution refinement of single particle structures.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CryoSPARC:+Algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CisTEM,+user-friendly+software+for+single-particle+image+processing.">CisTEM, user-friendly software for single-particle image processing.</a> eLife. 7, 35383 (2018).</li><li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>Zhang, P., Beatty, A., Milne, J. L. S., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+data+collection+with+a+Tecnai+12+electron+microscope:+Applications+for+molecular+imaging+by+cryomicroscopy.">Automated data collection with a Tecnai 12 electron microscope: Applications for molecular imaging by cryomicroscopy.</a> Journal of Structural Biology. 135 (3), 251-261 (2001).</li><li>Lei, J., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+acquisition+of+cryo-electron+micrographs+for+single+particle+reconstruction+on+an+FEI+Tecnai+electron+microscope.">Automated acquisition of cryo-electron micrographs for single particle reconstruction on an FEI Tecnai electron microscope.</a> Journal of Structural Biology. 150 (1), 69-80 (2005).</li><li>Potter, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+A+system+for+fully+automated+acquisition+of+1000+electron+micrographs+a+day.">Leginon: A system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day.</a> Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+molecular+microscopy:+The+new+Leginon+system.">Automated molecular microscopy: The new Leginon system.</a> Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).</li><li>Korinek, A., Beck, F., Baumeister, W., Nickell, S., Plitzko, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+controlled+cryo-electron+microscopy+-+TOM2+a+software+package+for+high-throughput+applications.">Computer controlled cryo-electron microscopy - TOM2 a software package for high-throughput applications.</a> Journal of Structural Biology. 175 (3), 394-405 (2011).</li><li>Shi, J., Williams, D. R., Stewart, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Script-Assisted+Microscopy+(SAM)+package+to+improve+data+acquisition+rates+on+FEI+Tecnai+electron+microscopes+equipped+with+Gatan+CCD+cameras.">A Script-Assisted Microscopy (SAM) package to improve data acquisition rates on FEI Tecnai electron microscopes equipped with Gatan CCD cameras.</a> Journal of Structural Biology. 164 (1), 166-169 (2008).</li><li>Marsh, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+software+platform+for+low-dose+electron+microscopy+and+tomography.">Modular software platform for low-dose electron microscopy and tomography.</a> Journal of Microscopy. 228, 384-389 (2007).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JADAS:+A+customizable+automated+data+acquisition+system+and+its+application+to+ice-embedded+single+particles.">JADAS: A customizable automated data acquisition system and its application to ice-embedded single particles.</a> Journal of Structural Biology. 165 (1), 1-9 (2009).</li><li>Pramanick, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+flexibility+and+structural+variability+of+SARS-CoV2+S+protein.">Conformational flexibility and structural variability of SARS-CoV2 S protein.</a> Structure. , (2021).</li><li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+neutralization+of+SARS-CoV-2+by+an+antibody+from+a+convalescent+patient.">Structural basis for the neutralization of SARS-CoV-2 by an antibody from a convalescent patient.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 27 (10), 950-958 (2020).</li><li>Hillen, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+replicating+SARS-CoV-2+polymerase.">Structure of replicating SARS-CoV-2 polymerase.</a> Nature. 584 (7819), 154-156 (2020).</li><li>Wrapp, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+2019-nCoV+spike+in+the+prefusion+conformation.">Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation.</a> Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).</li><li>Thoms, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+translational+shutdown+and+immune+evasion+by+the+Nsp1+protein+of+SARS-CoV-2.">Structural basis for translational shutdown and immune evasion by the Nsp1 protein of SARS-CoV-2.</a> Science. 369 (6508), 1249-1255 (2020).</li><li>Kumar, A., Sengupta, N., Dutta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+approach+for+preparing+graphene+oxide+tem+grids+for+stained+and+vitrified+biomolecules.">Simplified approach for preparing graphene oxide tem grids for stained and vitrified biomolecules.</a> Nanomaterials. 11 (3), 1-22 (2021).</li></ol>

Latitude-S, iki gün içinde binlerce yüksek çözünürlüklü mikrografiyi veya film dosyasını otomatik olarak kurmak ve toplamak için bir ortam sağlayan sezgisel bir kullanıcı arayüzüdür. Izgaralarda kolay gezinme sağlar ve düşük büyütmeden yüksek büyütmeye geçerken mikroskop aşamasının konumunu korur. Latitude-S ile veri toplamanın her adımı, basit bir kullanıcı arayüzü, 4,5 GB/s hıza kadar hızlı veri akışı ve edinme sırasında verilerin aynı anda görüntülenmesi gibi özellikl...

Tek parçacıklı kriyo-EM, biyolojik makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü yapı tespiti için ana akım bir yapısal biyoloji tekniği haline gelmiştir1. Tek parçacıklı rekonstrüksiyon, daha sonra biyolojik bir makromolekülün üç boyutlu (3D) yapısını yeniden oluşturmak için kullanılan iki boyutlu (2B) parçacık görüntülerini çıkarmak için çok sayıda vitrifiye örnek mikrobu elde edilmesine bağlıdır2,3. DED'lerin geliştirilmesinden önce, tek parçacıklı rekonstrüksiyondan elde edilen çözünürlük 4 ila 30 Å4,5 arasında değişmektedir. Son zamanlarda, tek parçacıklı cryo-EM'den elde edilebilir çözünürlük 1.8 Å6'nın ötesine ulaştı. DED ve otomatik veri toplama yazılımı, veri toplama için insan müdahalesinin en az olduğu bu çözüm devrimine büyük katkıda bulundu7. Genellikle kriyo-EM görüntüleme, biyolojik örneklerin elektron ışın kaynaklı radyasyon hasarını en aza indirmek için düşük elektron doz oranlarında (20-100 e/Å2) gerçekleştirilir ve bu da görüntüdeki düşük sinyal-gürültü oranına (SNR) katkıda bulunur. Bu düşük SNR, tek parçacık analizi kullanılarak biyolojik makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü yapılarının karakterizasyonuna engeldir.
Yeni nesil elektron dedektörleri, SNR ile ilgili bu düşük engelleri aşabilen CMOS (tamamlayıcı metal-oksit-yarı iletken) tabanlı dedektörlerdir. Bu doğrudan algılama CMOS kameralar, kameranın daha iyi nokta yayma işlevi, uygun SNR ve biyolojik makromoleküller için mükemmel dedektif kuantum verimliliği (DQE) katkıda bulunduğu için sinyalin hızlı okunmasına izin verir. Doğrudan algılama kameraları, kaydedilen görüntülerde yüksek SNR8 ve düşük gürültü sunar ve bu da dedektif kuantum verimliliğinde (DQE) nicel bir artışa neden olur ve bir dedektörün görüntüye ne kadar gürültü kattığının bir ölçüsü olur. Bu kameralar ayrıca saniyede yüzlerce kare hızında film kaydeder ve bu da hızlı veri alımını sağlar9,10. Tüm bu özellikler, hızlı doğrudan algılama kameralarını düşük doz uygulamaları için uygun hale getirir.
Hareket düzeltilmiş yığın görüntüleri, RELION11, FREALIGN12, cryoSPARC13, cisTEM14 ve EMAN215 gibi çeşitli yazılım paketlerini kullanarak makromoleküllerin 2B sınıflandırmasını hesaplamak ve 3B yoğunluk haritasını yeniden oluşturmak için veri işleme için kullanılır. Ancak, tek parçacık analizi için, yüksek çözünürlüklü bir yapı elde etmek için muazzam bir veri kümesi gereklidir. Bu nedenle, otomatik veri toplama geçiş ücretleri veri toplama için son derece önemlidir. Büyük kriyo-EM veri kümelerini kaydetmek için son on yılda birkaç yazılım paketi kullanılmıştır. Otomatik Veri Toplama için AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, SerialEM19, UCSF-Image420, TOM221, SAM22, JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS ve EPU gibi özel yazılım paketleri geliştirilmiştir.
Bu yazılım paketleri, düşük büyütme görüntülerini yüksek büyütme görüntüleriyle ilişkilendirerek delik konumlarını otomatik olarak bulmak için rutin görevleri kullanır, bu da düşük doz koşullarında görüntü alımı için uygun buz kalınlığının vitreus buz ile deliklerin tanımlanmasına yardımcı olan. Bu yazılım paketleri, tekrarlayan görevlerin sayısını azalttı ve herhangi bir kesintiye uğramadan ve operatörün fiziksel varlığı olmadan birkaç gün boyunca sürekli olarak çok miktarda kaliteli veri elde ederek kriyo-EM veri toplamanın verimini artırdı. Latitude-S, tek parçacık analizi için otomatik veri toplama için kullanılan benzer bir yazılım paketidir. Ancak, bu yazılım paketi yalnızca K2/K3 DED'ler için uygundur ve bu dedektörlerle sağlanır.
Bu protokol, SARS-CoV-2 spike proteininin 200 keV kriyo-EM ile donatılmış doğrudan elektron dedektörü ile otomatik görüntü alımında Latitude-S'in potansiyelini göstermektedir ( bkz. Malzeme Tablosu). Bu veri toplama aracı kullanılarak, SARS-CoV-2 spike proteininin 3.000 film dosyası otomatik olarak elde edilir ve 3.9-4.4 şçözünürlüklü başak protein yapısı elde etmek için daha fazla veri işleme gerçekleştirilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blotting paper</td>
			<td>Ted Pella, INC.</td>
			<td>47000-100</td>
			<td>EM specimen preparation item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capsule</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>9432 909 97591</td>
			<td>EM specimen preparation unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1020863</td>
			<td>EM specimen preparation unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Clip</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036171</td>
			<td>EM specimen preparation item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Clip Insertion Tool</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>9432 909 97571</td>
			<td>EM specimen preparation tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Clip Ring</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036173</td>
			<td>EM specimen preparation item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM grid (Quantifoil)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Q3100AR1.3</td>
			<td>R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow discharge Machine</td>
			<td>Quorum</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Quorum GlowQube glow discharge machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 DED</td>
			<td>Gatan Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Cryo-EM data collection device (Camera)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latitude S Software</td>
			<td>Gatan Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading station</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1130698</td>
			<td>EM specimen preparation unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos 200 kV Arctica</td>
			<td>Thermo Scientific&#8482;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Cryo-Electron Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>EM specimen preparation unit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

user-friendly, high-throughput, and fully automated data acquisition software for single-particle cryo-electron microscopy

Son birkaç yılda, tek parçacıklı kriyo-elektron mikroskopislerindeki (kriyo-EM) teknolojik ve metodolojik gelişmeler, biyolojik makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü yapı tespiti için yeni bir yol açmıştır. Cryo-EM'deki dikkat çekici gelişmelere rağmen, tek parçacık analizi iş akışının çeşitli yönlerinde iyileştirme için hala bir kapsam vardır. Tek parçacıklı analiz, yüksek verimli otomatik veri toplama için uygun bir yazılım paketi gerektirir. Son sekiz yılda tek parçacıklı kriyo-EM için otomatik görüntüleme için çeşitli otomatik veri toplama yazılım paketleri geliştirilmiştir. Bu makale, düşük doz koşullarında vitrifiye biyomoleküller için tam otomatik bir görüntü alma boru hattının bir uygulamasını sunun. 
Cryo-EM verilerini tam, otomatik ve tam olarak toplayabilen bir yazılım paketi gösterir. Ek olarak, çeşitli mikroskobik parametreler bu yazılım paketi tarafından kolayca kontrol edilir. Bu protokol, bu yazılım paketinin doğrudan elektron dedektörü (DED) ile donatılmış 200 keV kriyo-elektron mikroskobu ile şiddetli akut solunum sendromu-koronavirüs 2 (SARS-CoV-2) spike proteininin otomatik görüntülenmeslerindeki potansiyelini göstermektedir. Sars-CoV-2'nin spike proteininin atomik çözünürlüklü bir yapısını sağlayan tek bir oturumda (48 saat) yaklaşık 3.000 kriyo-EM film görüntüsü elde edildi. Ayrıca, bu yapısal çalışma, spike proteininin iki ana uygunluk benimsediğini göstermektedir, 1-RBD (reseptör bağlayıcı alan adı) açık ve tüm RBD kapalı konformasyonları.

Mevcut pandemi durumunda, cryo-EM, sars-CoV-226,27,28,29'dan çeşitli proteinlerin yapılarının karakterizesinde önemli bir rol oynar ve bu da virüse karşı aşı ve ilaç geliştirilmesine yardımcı olabilir. 2019'un koronavirüs hastalığıyla mücadele için sınırlı insan kaynağına sahip hızlı araştırma çalışmalarına acil ihtiyaç var. Tek parçacıklı kriyo-EM'de veri ...

Watch this Scientific Journal Video about User-friendly, High-throughput, and Fully Automated Data Acquisition Software for Single-particle Cryo-electron Microscopy at JoVE.com

User-friendly, High-throughput, and Fully Automated Data Acquisition Software for Single-particle Cryo-electron Microscopy

Tek parçacıklı kriyo-elektron mikroskopisi, yüksek verimli otomatik veri toplama için uygun bir yazılım paketi ve kullanıcı dostu bir işlem hattı gerektirir. Burada, düşük doz koşullarında vitrifiye biyomoleküllerin veri toplanması için tam otomatik görüntü alma yazılım paketi, Latitude-S ve pratik bir boru hattı uygulamasını sunuyoruz.

Tek parçacıklı Cryo-elektron Mikroskopisi için Kullanıcı Dostu, Yüksek Verimli ve Tam Otomatik Veri Toplama Yazılımı

In the past several years, technological and methodological advancements in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) have paved a new avenue for ...

Otomatik Veri Toplama Yazılımı, biyolojik makromoleculess'ın yapısal karakterizasyonu için büyük miktarda kriyo verisi toplamak için son derece gereklidir. Otomatik Veri Toplama Yazılımı paketi, patojen biyolojisi ile doğrudan ilişkili olan çeşitli biyolojik makromoleculess'in yapısını karakterize etmek için kullanılmıştır. Örneğin, mikobakteri, HIV ve SASCO 2.Başlangıç olarak, başlat menüsünden DigitalMicrograph'a tıklayarak Latitude-S Otomatik Veri Toplama Yazılımı'nı başlatın. Ardından, Teknik Yöneticisi'ni ve ardından Tek Parçacıklı Otomatik Veri Toplama için Latitude-S simgesini seçin. Önceki oturum ayarlarını temel alan bir oturum oluşturmak için, paletteki önceki oturuma göre onay kutusunu işaretleyin ve sonra yeni düğmeyi seçin veya varolan bir oturuma devam etmek için devam düğmesine basın.Tamamen yeni bir oturum başlatmak için paletteki yeni sekmeye tıklayın. Devam edilecek oturumu içeren klasörü seçin ve verileri kaydetmek için klasörü seçin. Ardından, ayar simgesine tıklayın ve görüntülenen yönetilen durum araştırma kutusunda, durum ekleyin, TEM koşulu, kamera koşulu ve görüntü veya stok seçeneğini ayarlayın.Ardından, kaydetme ayarlarını açmak için durumu adlandırın veya durum kurulum özetini açın. Ardından, Atlas durum paletine tıklayarak Atlas durumunu yapılandırın ve büyütme, aydınlatma koşulları ve kamera pozlama süresi parametrelerini ayarlayın ve bir sonraki duruma geçmek için yanındakine tıklayın. Ardından ızgara durumu paletini tıklatarak ızgara durumunu yapılandırın, mikroskop görüntüleme optikleri, aydınlatma koşulları ve kamera pozlama süresi parametrelerini ayarlayın ve sonrakine tıklayın.Delik paletini tıklayarak delik durumunu yapılandırın ve görüntüleme optiklerini, aydınlatma koşullarını, binning ve kamera pozlama süresi parametrelerini ayarlayın. İleri'ye tıklayıp odak paletini tıklayarak bir sonraki odak durumunu yapılandırın ve görüntüleme optikleri, aydınlatma koşulları, binning ve kamera pozlama süresi için mikroskop ayarlarını yapın. Ardından deliğin yakınındaki amorf karbon alanına odaklanın ve bir sonraki duruma geçmek için yanındakine tıklayın.Veri paletini tıklatarak veri durumunu yapılandırın ve mikroskop ayarları için parametreleri ayarlayın, sonra İleri'ye tıklayın. Verilen sekmede netleme değerlerinin aralığını ve adım boyutunu belirten odak yapılandırma paletine tıklayın ve sonraki adıma geçmek için sonraki düğmeye basın. Izgaradaki gerekli özelliklere odaklanın ve yakalama düğmesine tıklayın.Ardından kırmızı çapraz işareti farklı durumların her görüntüsünde aynı unsura yerleştirin. Odak, Veri ve Delik durumları ile başlayın, çünkü görüş alanı Atlas ve Grid durumlarından daha büyüktür. Ardından, kırmızı çapraz işareti aynı özelliğe konumlandırmak için Atlas ve Grid durumlarını yakınlaştırın.Beş farklı durum arasındaki konumları ve uzaklığı hesaplamak ve pozisyonları ve uzaklıkları çıktı penceresine yansıtmak için hesapla düğmesini tıklatın. Yakalama paletine tıklayın ve gereksinime göre ızgaranın tamamını veya bir kısmını kapsayacak şekilde Atlas'ın boyutunu seçin. Atlas'ı yakalamak için Atlas'ta gezinin ve buz kalınlığına göre ızgara karesini seçin.İstediğiniz ızgara kareleri seçildikten sonra, zamanlama düğmesine tıklayın ve her ızgara karesi yakalanırken ızgara karesindeki döşemelerin dolduğunu gözlemleyin. Zamanlama düğmesi tıklatıldıktan sonra, deliğin konumunu ekleyerek ızgara karesinde temsili bir delik seçin. Delik görüntüsü alındıktan sonra, veri ve odak konumlarını tanımlayın ve düzeni şablon olarak kaydedin.Otomatik bul'a tıklayın, delik boyutunu girin ve çapına göre delikleri otomatik olarak bulmak için programdaki bul düğmesine tıklayın. Izgara karesinden delikleri ve buz kirlenmesini gidermek için yoğunluğu ayarlayın. Otomatik bul aracılığıyla seçilen ve sarı işaret araçlarını ekledikten sonra enlem görevlerinde zamanlama düğmesine tıklayın.CISTEM yazılımı kullanılarak hareket düzeltilmiş mikrografların ilk manuel taramasına göre, verilerin çoğunun istenen sinyal aralığında olduğu bulunmuştur. Ayrıca, defocus aralıklarında toplanan görüntüler de cisTEM tarafından manuel olarak kontrol edildi. Başak parçacıkları, yapısal görselleştirme için 2D sınıf ortalamalarını hesaplamak için manuel olarak seçildi, bu da şiddetle önerildi, ancak ilgili veri kümesi kullanılarak yüksek çözünürlüklü yapısal karakterizasyon mümkün oldu.3D sınıflandırması, Spike Protein'in yukarı açık onayda 1RBD'ye ve aşağı yakın onayda diğer tüm RBD'ye sahip olduğunu gösterdi. Spike Proteininin 1RBD açık onayları C1 simetrisi kullanılarak yeniden inşa edildi. Spike Protein haritası yan üst ve alt görünümlerde temsil edilir.Ve EM haritası, yan zincirlerin daha iyi görselleştirilmesi için atomik yapı ile donatılmıştır. RBD aşağı yakın onayları C3 simetrisi ve gösterildiği gibi atomik yapı ile donatılmış çivi 3D rafine model ve EM haritası ile rafine edilmiştir. Ve S2 alt alanı olarak tanımlanan Spike Proteininin ara onayı, bireysel amino asit kalıntılarının yan zincirlerini gösteriyordu.Sonuçlar, Latitude-S'in biyolojik makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü cryo EM verilerini toplayabileceğini öne sürdü. Bu Otomatik Veri Toplama Yazılımı, verileri otomatik olarak toplamak için başka herhangi bir elektron mikroskopi sistemi için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Cryo-Elektron Tomografi ve Otomatik Sub-tomogram Ortalaması kullanarak HIV Zarf Glikoproteinler Moleküler Yapılarının Belirlenmesi

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

Cryo-Elektron Mikroskopi tarafından HIV-1 kapsid Meclisleri Yapısı ve iteratif Helisel Gerçek uzay İmar

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Canlı Hücre Görüntüleme Bacillus subtilis Ve Streptococcus pneumoniae Otomatik Zaman atlamalı Mikroskopi

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

T Hücreleri İçin Kantitatif Yüksek throughput Tek hücreli Sitotoksisite Testi

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA Virüslerinin geniş spektrumlu Kimyasal Önleyicileri için yüksek verimli tarama

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Yer Alan Ana Faktörler yüksek verimli tarama mikroskopisi bazlı deneyler<em&gt; Brucella</em&gt; Hela Hücrelerinin Enfeksiyon

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

Küçük moleküllerin yüksek verimli tarama için uygun bir floresan bazlı lenfositi analizi

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp. testi ile taranması için yüksek üretilen iş platformu /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Bir yüksek-den geçerek Shigella-belirli bakterisidal tahlil

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...