Name: isolation and in vitro culture of bone marrow-derived macrophages for the study of no-redox biology
Uploaded: 2022-05-31T12:30:00
Duration: 6 min 34 s
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这项工作得到了英国心脏基金会中级奖学金的支持，授予M.J.C.（FS/14/56/31049），英国心脏基金会计划赠款（RG/17/10/32859和RG/12/5/29576），惠康信托基金（090532/Z/09/Z）和NIH研究（NIHR）牛津生物医学研究中心。作者还想感谢牛津大学BHF卓越研究中心的支持（RE/13/1/30181和RE/18/3/34214）

所有动物程序均根据牛津大学伦理委员会和1986年英国内政部动物（科学程序）法案获得批准和执行。所有程序均符合欧洲议会指令2010/63/EU。
1. 骨髓细胞的分离
<ol><li>通过宫颈脱位处死野生型（C57BL / 6）或Gch1缺陷（R26-CreER T2Gchfl / fl）小鼠（10-16周龄）并收集后肢。 注意：不偏爱任何一种性别。年龄匹配的雌性将略小于雄性对应物，影响起始材料的初始产量。<ol>
<li>用70%乙醇喷洒小鼠以降低污染风险。</li>
		<li>用解剖剪刀在腹部做一个小切口，从身体上去除毛皮和皮肤。剥下皮肤，露出后肢肌肉。</li>
		<li>将鼠标放在腹部，并通过将其从膝关节抬起并对臀部施加压力来使后肢脱臼。脱位可以在髋关节处感觉到。</li>
		<li>通过小心地切开臀部的肌肉来移除后腿，确保股骨不会受到损害。</li>
		<li>切开踝关节上方，取下脚部并清除腿部残留的皮肤。</li>
		<li>将解剖后的支腿放入装有25 mL冰冷PBS（无需抗生素）的50 mL管中，并将其放在冰上。 注意：可以解剖多种动物，并将腿保持在冰上。</li>
	</ol>
</li>
	<li>在组织培养罩中的无菌条件下，从腿部取下肌肉并取出骨骼末端以暴露骨髓。<ol>
<li>将支腿放在70%乙醇中2分钟，以减少污染并洗掉任何毛皮或残留物。</li>
		<li>将腿部转移到干净，无菌，细菌培养皿中。使用镊子和手术刀用刀片的侧面牢固而小心地沿着骨骼刮擦以去除肌肉。切开肌腱以简化该过程。</li>
		<li>去除每块骨头末端的骨骺以暴露骨髓。股骨在两端被切开，刚好靠近各自的关节。</li>
		<li>胫骨在膝盖关节的顶部被切开，在膝盖关节的正下方与腓骨相交点上方。</li>
	</ol>
</li>
	<li>用PBS冲洗骨骼中的骨髓，并将其收集在50mL无菌管中。<ol>
<li>在 10 mL 注射器中填充 10 mL PBS，并连接到 25 G x 0.5 x 16 mm 针头上。这足以冲洗一只老鼠的所有骨头。</li>
		<li>将针头插入骨的髓腔，用1-2mL的PBS轻轻冲洗骨髓，使针头上下穿过骨骼，以确保所有骨髓被移出。</li>
		<li>对所有骨骼重复上述步骤，将冲洗的骨髓收集在干净的培养皿中。</li>
		<li>使用无菌的1mL注射器，通过将悬浮液吸入和拉出注射器5-10次直到任何肿块破碎来分解骨髓。</li>
		<li>将分解的骨髓收集在1 mL注射器中，并将其通过70μM细胞过滤器进入干净的50mL离心管中。将收集的骨髓放在冰上，同时收集进一步的样本。 注：请参阅 图 1 - 第 1 部分中的协议方案。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 溴化二苯并呋喃的筛选、分化和刺激
<ol><li>为了冷冻骨髓供以后使用，通过以1000× g 离心5分钟沉淀骨髓，并重悬于2mL含有5%二甲基亚砜（DMSO）的低内毒素FBS中。<ol>
<li>在室温（RT）下以1000× g 离心骨髓悬浮液5分钟。将形成血红色颗粒。</li>
		<li>弃去上清液。</li>
		<li>将沉淀轻轻重悬于2 mL含有5%DMSO的低内毒素FBS中，并在-80°C下冷冻过夜，然后转移到气相液氮中长期储存。</li>
	</ol></li>
	<li>要立即使用骨髓，请在铺设骨髓之前裂解红细胞。<ol>
<li>在室温下以1000× g 离心骨髓悬浮液5分钟。将形成血红色颗粒。</li>
		<li>将沉淀重悬于3mL的1x红细胞裂解缓冲液中，并在室温下孵育5分钟。</li>
		<li>加入10mLPBS，在室温下以1000× g 离心5分钟，弃去上清液。</li>
		<li>从步骤2.3.5继续接种细胞以立即使用。</li>
	</ol></li>
	<li>在造粒细胞之前，解冻巨噬细胞并重悬于3mL接种培养基中。<ol>
<li>准备DMEM：F12含有5%低内毒素FBS，1x青霉素/链霉素，L-谷氨酰胺和25ng / mL M-CSF。 注意：M-CSF和GM-CSF可以通过在含有0.1%无菌BSA的无菌水中重悬干燥的蛋白质来制备，等分试样可以在-80°C下冷冻供以后使用。</li>
		<li>在37°C下快速解冻冷冻的细胞悬浮液。</li>
		<li>将细胞悬浮液（0.5mL）转移到含有3mL制备的DMEM：F12培养基的干净无菌管中。</li>
		<li>通过在室温下以1000× g 离心5分钟来沉淀细胞，弃去上清液。</li>
		<li>将沉淀重悬于3mL制备的DMEM：F12培养基中。</li>
		<li>通过首选方法对细胞进行计数。</li>
	</ol></li>
	<li>第0天：接种细胞。<ol>
<li>在DMEM中将细胞接种在非TC包被的塑料器皿中：含有5%低内毒素FBS，1x青霉素/链霉素，L-谷氨酰胺和25ng / mL M-CSF的F12培养基。 注：代表性的播种密度如 表1所述。一只小鼠的一对完整的腿提供1500-2000万个前体细胞。</li>
		<li>将细胞在37°C下用5%CO2孵育。</li>
	</ol></li>
	<li>第5天：喂养细胞。<ol>
<li>通过添加50%原始体积的DMEM来喂养细胞：含有5%低内毒素FBS，1x青霉素/链霉素，L-谷氨酰胺和50ng / mL M-CSF的F12培养基。</li>
	</ol></li>
	<li>第6天：用GM-CSF刺激细胞。<ol>
<li>将制备的GM-CSF加入到最终浓度为50ng / mL的细胞培养基中，直接添加到细胞上的培养基中。</li>
	</ol></li>
	<li>将介质更换为准备好的DMEM：F12。<ol>
<li>从细胞中取出所有培养基。</li>
		<li>在预热的PBS中短暂洗涤细胞。</li>
		<li>添加 DMEM：含有 2% 低内毒素 FBS、1x 青霉素/链霉素、L-谷氨酰胺、25 ng/mL M-CSF 和 50 ng/mL GM-CSF 的 F12 培养基。</li>
		<li>通过步骤2.7.5-2.7.7中描述的刺激将巨噬细胞激活为M0，M1或M2表型。</li>
		<li>M0 - 无需刺激。将细胞在培养基中孵育过夜。</li>
		<li>M1 - 用100 ng / mL LPS和10 ng / mL IFNγ（最终浓度）刺激细胞过夜。</li>
		<li>M2 - 用100 ng / mL IL-4（终浓度）刺激细胞过夜。</li>
	</ol></li>
	<li>第8天：收获细胞。<ol>
<li>从细胞中取出培养基（收集培养基并在-80°C下冷冻以进行下游测定）。</li>
		<li>将细胞在冰冷的PBS（培养基体积的50%）中孵育5分钟。</li>
		<li>通过轻柔刮擦或重复移液将细胞从板上分离出来。</li>
		<li>通过在室温下以2500× g 离心5分钟来沉淀细胞，弃去上清液。</li>
		<li>将细胞沉淀在-80°C下冷冻以备后用。 注：请参阅协议方案 图1 - 第2部分。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Zajd, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+and+elicited+peritoneal+macrophages+are+not+created+equal:+The+questions+asked+dictate+the+cell+type+used.">Bone marrow-derived and elicited peritoneal macrophages are not created equal: The questions asked dictate the cell type used.</a> Frontiers in Immunology. 11, 269 (2020).</li><li>Murray, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization:+nomenclature+and+experimental+guidelines.">Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines.</a> Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).</li><li>Zhao, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+characteristics+of+macrophages+derived+from+murine+spleen,+peritoneal+cavity,+and+bone+marrow.">Comparison of the characteristics of macrophages derived from murine spleen, peritoneal cavity, and bone marrow.</a> Journal of Zheijang University Science B. 18 (12), 1055-1063 (2017).</li><li>Nasser, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+bone+marrow-derived+M-CSF+receptor-dependent+self-renewing+macrophages.">Establishment of bone marrow-derived M-CSF receptor-dependent self-renewing macrophages.</a> Cell Death Discovery. 6, 63 (2020).</li><li>Stanley, E. R., Heard, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+regulating+macrophage+production+and+growth.+Purification+and+some+properties+of+the+colony+stimulating+factor+from+medium+conditioned+by+mouse+L+cells.">Factors regulating macrophage production and growth. Purification and some properties of the colony stimulating factor from medium conditioned by mouse L cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 252 (12), 4305-4312 (1977).</li><li>Bailey, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+murine+bone+marrow-derived+macrophages+for+nitric+oxide+and+redox+biology.">Isolation and culture of murine bone marrow-derived macrophages for nitric oxide and redox biology.</a> Nitric Oxide. 100-101, 17-29 (2020).</li><li>Shiva, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrite:+A+physiological+store+of+nitric+oxide+and+modulator+of+mitochondrial+function.">Nitrite: A physiological store of nitric oxide and modulator of mitochondrial function.</a> Redox Biology. 1 (1), 40-44 (2013).</li><li>McNeill, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+iNOS+function+and+cellular+redox+state+by+macrophage+Gch1+reveals+specific+requirements+for+tetrahydrobiopterin+in+NRF2+activation.">Regulation of iNOS function and cellular redox state by macrophage Gch1 reveals specific requirements for tetrahydrobiopterin in NRF2 activation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 79, 206-216 (2015).</li><li>McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+macrophage+phenotype+by+cell+shape.">Modulation of macrophage phenotype by cell shape.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (43), 17253-17258 (2013).</li><li>Bailey, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+modulates+metabolic+remodeling+in+inflammatory+macrophages+through+TCA+cycle+regulation+and+itaconate+accumulation.">Nitric oxide modulates metabolic remodeling in inflammatory macrophages through TCA cycle regulation and itaconate accumulation.</a> Cell Reports. 28 (1), 218-230 (2019).</li><li>Hamilton, T. A., Zhao, C., Pavicic, P. G., Datta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+colony-stimulating+factors+as+regulators+of+macrophage+polarization.">Myeloid colony-stimulating factors as regulators of macrophage polarization.</a> Frontiers in Immunology. 5, 554 (2014).</li><li>Na, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF+induces+inflammatory+macrophages+by+regulating+glycolysis+and+lipid+metabolism.">GM-CSF induces inflammatory macrophages by regulating glycolysis and lipid metabolism.</a> Journal of Immunology. 197 (10), 4101-4109 (2016).</li><li>Sorgi, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF+priming+drives+bone+marrow-derived+macrophages+to+a+pro-inflammatory+pattern+and+downmodulates+PGE2+in+response+to+TLR2+ligands.">GM-CSF priming drives bone marrow-derived macrophages to a pro-inflammatory pattern and downmodulates PGE2 in response to TLR2 ligands.</a> PLoS One. 7 (7), 40523 (2012).</li></ol>

作者声明没有相互竞争的利益。

这种BH4和NO缺陷BMDM培养方案旨在通过减少四氢生物蝶呤（BH4）和其他干扰伪影来研究初级巨噬细胞中的NO氧化还原生物学，以提高从这些实验模型获得的结果的可靠性和可重复性。 
关键步骤包括使用正确的塑料器皿。巨噬细胞祖细胞是贴壁细胞，非常粘稠;因此，使用非组织培养（TC）处理的板对于选择和分离它们与其他祖细胞至关重要，否则这些祖细胞可能会附着并降低纯度。在收获当天，从平板中分离巨噬细胞需要冰冷的PBS，但根据下游应用（例如，裂解与活细胞实验），可以使用EDTA甚至非常温和地刮除细胞。还应特别注意污染。在冲洗骨髓时，可能会发生与残留的皮毛和皮肤中的细菌或病毒颗粒的潜在交叉污染。因此，必须尽可能小心和无菌;因此，鼓励将解剖的腿在70%乙醇中切开几分钟。同样，强烈建议在生长巨噬细胞时使用抗生素。
该方案的另一个限制源于第0天的细胞接种密度。冲洗的骨髓含有多种细胞，这些细胞可能被错误地计数并作为巨噬细胞祖细胞包括在内，从而导致错误的总细胞数。为了避免随后和潜在的变异性，可以在第7天使用温热的PBS轻轻冲洗分离的巨噬细胞，并在刺激前至少1小时以正确的密度在2%FBS DMEM：F12中重新接种，以允许依从性。 
最后，使用来自生长的巨噬细胞的培养基通过Griess测定来检查亚硝酸盐水平对于分析数据至关重要。从好的方面来说，这种测定是快速和廉价的。
如本文所示，该定制方案是用于使用L细胞条件培养基（LCM）分离和培养巨噬细胞的更常见方案的更明确和改进的替代方案。事实上，在研究NO-氧化还原生物学时，使用LCM的主要问题之一是其检测到的大量生物蝶呤，从而导致潜在的代谢变化10。例如，外源性BH4可以快速补充有缺陷的模型，并作为iNOS的辅助因子，导致不需要的一氧化氮产生。使用LCM的另一个缺点在于其生产 - LCM是L-929细胞直接分泌的集落刺激因子，细胞因子和其他副产物的混合物，这些副产物都可以影响巨噬细胞生理学6。尽管M-CSF的供应量很大，对巨噬细胞增殖和存活至关重要，但每种组分在批次之间的变化增加了实验之间变异性的风险。 
为了解决这两个问题，这个新方案使用定义明确的DMEM：含有低水平生物蝶呤的F12培养基，其中添加了控制量的纯化的M-CSF和GM-CSF。两种细胞因子都有助于巨噬细胞的分化和生长。M-CSF通过确保造血干细胞分化为巨噬细胞11，特别导致骨髓祖细胞产生BMDM。此外，GM-CSF已被证明在刺激之前添加时可以促进炎症细胞因子和NO的产生，这在研究NO-氧化还原生物学时具有真正的益处12，13。
这种新方法解决的另一个主要因素是FBS，通常用作细胞健康和生长所必需的营养素来源。与LCM类似，FBS含有显着水平的生物蝶呤。虽然最初考虑使用OptiMEM + 0.2%BSA在刺激前完全血清饥饿细胞，但巨噬细胞显示出脱离的迹象，表明Beliley等人所描述的细胞活力下降。然而，由于巨噬细胞表现出对血清的绝对需求，因此选择了BioWest的超低内毒素FBS。在批量购买之前，对批次进行生物蝶呤测试并预先选择，以确保可靠和明确的供应。为了进一步减少生物蝶呤的污染源，因此测试了FBS浓度的降低。FBS水平不是像细胞培养中常用的那样使用10%的血清，而是在骨髓分化为巨噬细胞的整个7天过程中保持为5%，并在最后一天的夜间刺激期间进一步降低至2%。这确保了检测到的生物蝶呤水平可以忽略不计，但有足够的营养物质来维持巨噬细胞的良好健康和依从性。尽管这种使用重组M-CSF的新优化方案为原代巨噬细胞的培养和活化提供了更可控的环境，但主要限制是该方法比使用LCM方法更昂贵。
考虑到所有这些因素，然后直接比较了这两种方法。重要的是，本文提出的使用重组M-CSF和GM-CSF的新修饰方案导致了一个更具可重复性的系统，其中培养基没有污染BH4。这样做的影响是双重的。BH4缺陷细胞确实缺乏BH4，这导致LPS刺激至M1状态后培养基中可检测到的亚硝酸盐积累最小。这与在LCM中培养的BMDM细胞形成鲜明对比，其中检测到显着的BH4和亚硝酸盐。 
总而言之，这种方法的优势在于通过彻底评估可能影响巨噬细胞中NO和氧化还原信号传导的每个参数来控制生物蝶呤水平。特别是，这确保了NO-氧化还原生物学领域的最大可重复性和标准化。

巨噬细胞已被确定为各种疾病和病症中一种有趣的细胞类型，其中许多似乎与它们对先天免疫的传统关注无关。由于巨噬细胞生理学严重依赖于它们所居住的组织或环境，因此已经出现了许多方法来和模型来研究它们的功能和所涉及的各种途径。从历史上看，巨噬细胞系，如RAW264.7，主导了该领域，但这些细胞系已经逐渐被各种原代细胞模型所取代。例如，在用巯基乙酸盐治疗后，可以从腹膜灌洗中分离出鼠巨噬细胞。在为组织驻留细胞的研究提供有用模型的同时，这些腹膜巨噬细胞已被证明对各种外部刺激表现出更温和的反应，从而限制了它们对许多下游应用的适用性1。
作为替代方案，源自骨髓中骨髓祖细胞的骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）已成为研究巨噬细胞生物学各个方面的宝贵模型，包括成熟以及与巨噬细胞相关的各种经典表型，M0（幼稚，非活化），M1（促炎，通常用LPS / IFN激活）和M2（前分辨率，通常用IL-4激活）2，3.然而，骨髓祖细胞分化为BMDM取决于培养基4，5中巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）的存在。这可以以添加到培养基中的纯化蛋白质的形式提供，也可以从L929条件培养基（LCM）中提供。必须权衡使用BMDM的优势（成本和效率）及其对各种刺激（细胞因子，代谢中间体和RNS / ROS）的敏感性所带来的局限性。
先前的数据表明，LCM的含量定义不明确且具有内在可变性，导致它们不可靠且不适合各种下游应用，特别是那些与NO或氧化还原生物学特别相关的应用，因为这些应用可能受到外源化合物6存在的严重影响。因此，这个详细的方案要求使用定义明确的DMEM：具有低批次间变异的F12培养基，并添加重组小鼠M-CSF和GM-CSF（粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子）。此外，通常用作组织培养基补充剂的胎牛血清提供了定义不明确的化合物和固有变异性的另一个来源。因此，有必要控制和优化此类添加剂的使用，以确保BMDM的可靠培养。通过使用定义的FBS低内毒素来源并确保批量购买单批次，可靠地定义培养条件并确保可重复性。本文描述的方案已被证明在通过流式细胞术6评估巨噬细胞表面标志物CD45和CD11b时产生纯度高于95%的巨噬细胞培养物。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS+01T1</td>
			<td>1mL 6% LUER syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL plastic syringe</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14955453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate sterile non-treated</td>
			<td>CytoOne</td>
			<td>CC7672-7506</td>
			<td>Flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 (1:1) (1x)</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>21331-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO sterile</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy flask 260 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine Solution 200 mM</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>G7513-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>L4391-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutlidish 12 sterile non-treated</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150200</td>
			<td>Flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 25G, 0.5 x 16 mm</td>
			<td>BD Microlance 3</td>
			<td>300600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH7.4, 1x)</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>10010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P0781-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dish 100 x15 mm sterile</td>
			<td>Falcon, Corning incorporated</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine GM-CSF</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>315-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine IFN-&#947;</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>315-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine M-CSF</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel n23</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low endotoxin FBS</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1860-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR cell strainers 70 &#181;m nylon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-2758</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and in vitro culture of bone marrow-derived macrophages for the study of no-redox biology

巨噬细胞来源于全身的造血祖细胞，是炎症过程的核心，并参与先天性和适应性免疫反应。巨噬细胞的 体外 研究可以通过从腹膜 离体 培养或通过骨髓祖细胞的分化形成骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）进行。巨噬细胞与前体分化的常见方法涉及使用来自L929细胞（LCM）的条件培养基。这种培养基易于自我生产，但存在批次变异性，其成分未定义。同样，胎儿牛血清（FBS）用于支持生长，但含有大量未定义分子的混合物，这些分子可能因批次而异。这些方法不足以研究一氧化氮生物学和氧化还原机制，因为它们都含有大量的小分子，这些小分子要么干扰氧化还原机制，要么补充辅因子水平，例如从诱导的一氧化氮合酶（iNOS）生产NO所需的四氢生物蝶呤（BH4）。在本报告中，我们提出了一种优化的方案，通过降低外源性生物蝶呤的水平来控制NO-氧化还原环境，同时保持适合细胞生长和分化的条件。严格控制培养基组成有助于确保实验可重复性，并有助于准确解释结果。在该协议中，BMDM是从GTP环水解酶（GCH）缺陷小鼠模型中获得的。BMDM的培养使用含有（i）条件LCM或（ii）重组M-CSF和GM-CSF的培养基进行，以产生最小的伪影，同时获得BH4和NO缺陷培养条件 - 从而允许在 体外对NO-氧化还原生物学和免疫代谢进行可重复的研究。

在证明该方案在巨噬细胞中的效率之前，在补充了10%的FBS的培养基中评估了该方案在巨噬细胞，亚硝酸盐和BH4水平，其中含有10%的LCM或仅重组M-CSF和GM-CSF。亚硝酸盐虽然长期以来被认为是一氧化氮代谢的最终产物，但现在被认为是一氧化氮的生理储存，在需要时可以回收利用，因此通常用作一氧化氮生物利用度的指标7。BH4是NOS在NO生产中必不可少的辅助因子。如图 2所示，无论M-CSF / GM-CSF或LCM如何，补充10%FBS的培养基都具有相似的亚硝酸盐水平。然而，观察到不同LCM批次之间的变异性更大。这一观察结果也适用于BH4测量。事实上，一批LCM（批次#3）的BH4水平明显高于其他两批（批次#1和#2）。此外，LCM批次含有比补充10%FBS和重组细胞因子的培养基更多的生物蝶呤。还测量了批次间总生物蝶呤的显着变异性。这些结果证明了使用比LCM变化较小的M-CSF来源的重要性。
此外，与含有2%或5%FBS的培养基相比，补充10%FBS的培养基含有显着更高的亚硝酸盐含量。BH4的10%和5%之间的差异非常显着（p<0.05）。然而，相似水平的生物蝶呤被量化。相比之下，OptiMEM + 0.2%BSA不含亚硝酸盐和BH4，使其成为一种非常干净和合适的介质。然而，正如Bailey等人所描述的那样，尽管OptiMEM在刺激巨噬细胞时只能在夜间使用一次，但观察到由于饥饿引起的细胞死亡。DMEM：选择补充2%FBS的F12来克服这个问题，允许最小的亚硝酸盐和BH4污染，同时含有足够的营养物质来获得健康的细胞。事实上，尽管检测到一些亚硝酸盐，但与LPS / IFN刺激的WT巨噬细胞（1 x 106 细胞为30-80μM;数据未显示）相比，水平可以忽略不计（〜0.2μM）。
为了用实验数据验证这种改进的方案，从新的BH4缺陷小鼠模型中分离和表征BMDM，这里介绍了R26-CreERT2Gchfl / fl 。BH4由GTP环水解酶I（Gch1）基因产生。如图 3A所示，Gch1的缺乏导致BH4的损失，从而导致NO和随后的亚硝酸盐的消失，以及超氧阴离子的增加导致氧化应激，如McNeill等人之前所证明的那样。虽然该方案已经得到了很好的定义，并用于培养来自不同Cre系统的其他BH4缺陷巨噬细胞，例如Gchfl / flT2C模型6，8，但R26-CreERT2Gchfl / fl 模型是独一无二的，因为它利用Cre-ERT2 系统的条件激活来去除他莫昔芬治疗后的Gch1基因（图3B，C）.这允许在不同的时间点进行敲除，并以车辆与他莫昔芬治疗的形式使用内部控制。在该示例中，在第1天和第3天用载体（95%乙醇）或0.1 / 1.0μM 4-OH他莫昔芬处理细胞（在将0.7 / 7.0μL加入到现有培养体积的1mL之前，载体和他莫昔芬储备在培养基中稀释1：100）。
如图3D所示，在R26-CreERT2Gchfl / fl细胞中他莫昔芬治疗后，GTPCH蛋白被废除，但在Gchfl / fl细胞中则没有。重要的是，R26-CreERT2Gchfl/fl和Gchfl/fl对照细胞在LPS/IFN刺激后仍然能够产生iNOS（图3B，C）。Gch1基因表达的这些变化以及由此产生的GTPCH蛋白的改变导致细胞内BH4水平显着扰动和亚硝酸盐的产生减弱。如图4所示，与在他莫昔芬存在下从对照GCHfl / fl细胞中分离和培养的BMDM相比，从R26-CreERT2Gchfl / fl小鼠中分离和培养的BMDM表现出显着减少BH4的产生和减少的亚硝酸盐积累。同样，在LCM培养基中培养的相同细胞也显示出废除的Gch1表达;尽管这些细胞在用4 OH他莫昔芬敲除Gch1表达后仍然产生大量的BH4和亚硝酸盐，可能是由于培养基和FBS与BH4的污染。这代表了新方法的明显改进，在含L细胞的培养基中培养细胞。
该模型的进一步表征表明，在不同浓度的他莫昔芬之后，非活化（M0）Gchfl / fl 和R26-CreERT2Gchfl / fl BMDM在第8天在形态上没有显着差异。如图 5所示，两种模型都显示出相似数量的贴壁细胞，这些细胞由圆形组成，四肢细长，通常是未受刺激的巨噬细胞所期望的特征9。
综上所述，这些结果表明，这种BMDM的分离和培养方法提供了适合小鼠巨噬细胞培养的纯细胞群。该方法允许培养小鼠巨噬细胞，而不会受到某些培养基制剂中存在的外源化合物的干扰。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62834/62834fig01.jpg"> 图1：说明骨髓细胞分离（第1部分）到BMDM的选择，分化和刺激的示意图（第2部分）.（A）在无菌条件下，解剖的腿在用70%乙醇洗涤后放置在干净的细菌培养皿中。（B）用镊子和手术刀沿着骨骼小心地切除肌肉。（C）然后将骨头的四肢切除以暴露骨髓。（D）通过将针头插入骨腔，使用装有10 mL PBS的10 mL注射器从骨骼中冲洗骨髓。（E）针头在骨头上下运行，以确保所有骨髓都移位。在那个阶段，骨头应该看起来白色和清晰，将移位的骨髓收集在培养皿中。（F-G）对所有骨骼重复上述步骤，将分解的骨髓收集在1 mL注射器中，并将其通过70μm细胞过滤器进入干净的50mL离心管中。旋转并重悬细胞在冷冻培养基中供以后使用。第2部分显示了BMDM的选择，区分和刺激<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62834/62834fig01large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62834/62834fig02.jpg"> 图2：DMEM中的亚硝酸盐和BH4水平：F12 + GM-CSF + M-CSF或DMEM：F12 + L细胞培养基。 （A）使用Griess测定法测定不同培养基中的亚硝酸盐水平。（B）使用BH4标准品通过HPLC定量在不同培养基中测量BH4和生物蝶呤水平。数据表示为平均值（n = 3）±SD.使用单因子方差分析数据，通过多次比较。符号表示组之间的 p < 0.05。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62834/62834fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62834/62834fig03.jpg"> 图3：介绍R26CreERT2模型。 （A）方案说明了BH4作为NOS辅助因子在氧化还原生物学中的作用。（B）在该小鼠模型中，由于侧翼loxP位点和Cre-ERT2与他莫昔芬的条件激活，详细描述了Gch1中关键外显子（2和3）的切除示意图。（C）PCR（n = 3个独立动物的代表）显示当BMDM用他莫昔芬治疗时切除关键外显子。WT小鼠产生1030 bp的PCR产物，而在Cre的存在下，产生1392 bp的产物，确认切除关键的外显子。（D）iNOS，GCH和B-微管蛋白的免疫印迹（代表n = 3个独立动物）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62834/62834fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62834/62834fig04.jpg"> 图4：巨噬细胞中BH4缺乏症的表征。（A，B）qRT-PCR 证实在用他莫昔芬治疗的 R26-CreERT2Gchfl/fl 模型中 Gch1 表达丢失。蓝色 = 新的 MCSF 方法，绿色 = 经典的 LCM 方法。（C，D）通过HPLC分析细胞内BH4表明，0.1μM和1.0μM足以显着降低BH4水平。（英、 英）使用Griess测定法测量培养基中的亚硝酸盐表明，未刺激的BMDM不会产生可检测水平的亚硝酸盐，而Gchfl / fl 和R26-CreERT2Gchfl / fl BMDM在LPS / IFNγ存在下产生亚硝酸盐。值得注意的是，他莫昔芬治疗R26-CreERT2Gchfl / fl 显着降低了受刺激BMDM中的亚硝酸盐水平。数据表示为（n = 3）±SD的平均值。符号表示组之间的 p < 0.05。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62834/62834fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62834/62834fig05.jpg"> 图5：BMDM形态的比较。 通过第8天BMDM的光学显微镜获得的照片，他莫昔芬的不同治疗。比例在图像中指示。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62834/62834fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>文化菜</td>
			<td>媒体音量</td>
			<td>播种密度</td>
		</tr>
<tr>
<td>12井菜</td>
			<td>1 毫升</td>
			<td>500，000 个细胞</td>
		</tr>
<tr>
<td>6井菜</td>
			<td>2 毫升</td>
			<td>1，000，000 个细胞</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 mm 培养皿</td>
			<td>10 毫升</td>
			<td>3，000，000 个细胞</td>
		</tr>
<tr>
<td>75 cm2 烧瓶</td>
			<td>15 毫升</td>
			<td>5，000，000 个细胞</td>
		</tr>
</tbody></table>表1：代表性的播种密度。

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Isolation and In vitro Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages for the Study of NO-Redox Biology

该方案已被建立用于培养四氢生物蝶呤（BH4）-和诱导的一氧化氮合酶（iNOS）缺陷原代鼠巨噬细胞，以研究NO-氧化还原生物学。该研究的重点是减少传统分离和培养方法中发现的BH4和其他伪影的潜在污染，这些伪影可能会混淆实验结果和对结果的解释。

骨髓来源巨噬细胞的分离和 体外 培养用于NO-氧化还原生物学研究

Macrophages are derived from hematopoietic progenitor cells throughout the body, are central to inflammatory processes, and participate in innate and ...

该方案有助于使用精心定义的培养基和血清培养来自iNOS或BH4缺陷小鼠的骨髓来源的巨噬细胞，这些培养基和血清具有低水平的BH4和硝酸盐，以避免干扰氧化还原机制。通过仔细控制培养过程中潜在污染物的水平，我们可以限制一氧化氮干扰，确保模型系统的准确性和可重复性。这种方法可以精确测量生物蝶呤，一氧化氮以及与这些必需化合物相关的任何下游因素。演示该程序的将是来自我们实验室的博士后研究员Thomas Nichol博士。首先，将腿放在70%乙醇中两分钟，以洗掉任何毛皮或残留物。然后，将腿部转移到干净，无菌的细菌培养皿中。用刀片小心地沿着骨骼的长度刮擦，切开肌腱并从骨骼上取下肌肉。一旦骨头被清除了肌肉，切开胫骨顶部，膝盖正下方的骨骺。胫骨可以在底端切开，就在与腓骨相交处的正上方。最后，切开股骨两端的骨骺，刚好靠近膝关节和髋关节。要冲洗骨髓，用10毫升PBS填充10毫升注射器并将其连接到针头上。然后将针头插入骨的髓质腔中。用一到两毫升PBS轻轻冲洗，上下运行针头。然后，将悬浮液吸入和拔出一毫升注射器五到十次以分解。将悬浮液收集在一毫升注射器中，并通过70微米细胞过滤器进入干净的50毫升离心管。最后，将样品放在冰上。为了冷冻骨髓供以后使用，在室温下以1000G离心细胞五分钟。弃去上清液并将红色沉淀重悬于两毫升防冻液中。然后，将其在80摄氏度下孵育过夜。如果冷冻，请在37摄氏度下快速解冻悬浮液。将细胞悬浮液转移到含有三毫升DMEM / F-12培养基的干净无菌管中。接下来，通过离心沉淀细胞。弃去上清液并将沉淀重悬于三毫升制备的DMEM / F-12培养基中。计数细胞并将其置入制备的DMEM / F-12培养基中的非TC涂层塑料器皿中。接下来，将细胞在37摄氏度下与5%二氧化碳一起孵育。在第五天，通过添加50%原始体积的DMEM / F-12培养基来喂养细胞。在第六天，通过将制备的GM-CSF以每微升50纳克的最终浓度直接添加到细胞培养基中来刺激细胞。在第七天，从细胞中取出所有培养基。然后，用预热的PBS短暂洗涤细胞，并加入含有2%低内毒素FBS，1X青霉素或链霉素，L-谷氨酰胺，每微升M-CSF25纳克和每微升GM-CSF50纳克的DMEM / F-12培养基。最后，将细胞在培养基中孵育过夜，以激活巨噬细胞至M0表型。对于M1表型，用每微升LPS100纳克和每微升IFN-γ10纳克刺激细胞。对于M2表型，用每微升IL-4100纳克刺激细胞。将细胞孵育过夜。在第八天，细胞根据研究人员的需求准备好收获或下游处理。补充10%FBS的培养基具有相似的亚硝酸盐和四氢生物蝶呤，无论M-CSF和GM-CSF或LCM如何。但在LCM补充培养基中，总生物蝶呤水平较高。然而，观察到不同LCM批次之间的变异性更大。PCR在野生型小鼠中显示出1030个碱基对产物，而GCH敲除小鼠产生了1392个碱基对产物，证实了关键外显子的切除。他莫昔芬治疗消除了敲除细胞中的GCH蛋白。在LPS和IFN刺激之后，敲除和控制细胞仍然产生iNOS。从条件GCH敲除小鼠培养的BMDM表现出显着减少的四氢生物蝶呤和减少的亚硝酸盐。在LCM培养基中培养的相同细胞没有GCH1表达。然而，细胞在敲除后产生大量的四氢生物蝶呤和亚硝酸盐。第8天，不同浓度他莫昔芬下，非激活对照组和GCH敲除BMDM在形态上无显著差异。BMDM显示了未受刺激的巨噬细胞所期望的特征，具有圆形贴壁细胞和细长的四肢。在处理这样的原代细胞时，必须彻底消毒所有组织和设备。此外，选择合适的培养基和补充剂对于保持低一氧化氮和BH4环境非常重要。细胞沉淀和培养基可用于各种下游应用，重点是一氧化氮，生物蝶呤或细胞氧化还原状态的作用。它可能包括HPLC，qPCR和蛋白质印迹等。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and In vitro Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages for the Study of NO-Redox Biology

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

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迁移人T淋巴细胞分离，培养和分析<em在体外</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

科研

免疫与感染

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

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建立一个<em&gt;在体外</em&gt;系统来研究细胞内的行为<em&gt;光滑念珠菌</em&gt;在人THP-1巨噬细胞

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使用<em&gt;福氏痢疾杆菌</em&gt;研究自噬，细胞骨架相互作用

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As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

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偏光M1和M2骨髓来源的巨噬细胞的使用实时外流量分析代谢表征

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or ...

骨髓来源巨噬细胞的分离和 体外 培养用于NO-氧化还原生物学研究

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