Name: isolation and in vitro culture of bone marrow-derived macrophages for the study of no-redox biology
Uploaded: 2022-05-31T12:30:00
Duration: 6 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and In vitro Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages for the Study of NO-Redox Biology at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela British Heart Foundation Intermediate Fellowship concedida a M.J.C. (FS/14/56/31049), Bolsa do British Heart Foundation (RG/17/10/32859 e RG/12/5/29576), Wellcome Trust (090532/Z/09/Z) e o NIH Research (NIHR) Oxford Biomedical Research Centre. Os autores também gostariam de reconhecer o apoio do Centro de Excelência em Pesquisa da BHF, Oxford (RE/13/1/30181 e RE/18/3/34214)

Todos os procedimentos animais foram aprovados e realizados de acordo com o comitê de ética da Universidade de Oxford e o Uk Home Office Animals (Scientific Procedures) Act 1986. Todos os procedimentos conformes da Diretiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu.
1. Isolamento das células da medula óssea
<ol><li>Sacrificar ratos do tipo selvagem (C57BL/6) ou Gch1-deficiente (R26-CreERT2Gchfl/fl) (10-16 semanas de idade) por luxação cervical e coletar os membros traseiros. NOTA: Nenhuma preferência para qualquer sexo é feita. As fêmeas combinadas com a idade serão ligeiramente menores do que seus homólogos masculinos, afetando o rendimento inicial do material inicial.<ol>
<li>Pulverizar os camundongos com 70% de etanol para reduzir o risco de contaminação.</li>
		<li>Faça um pequeno corte no abdômen com uma tesoura de dissecção para remover pele e pele do corpo. Retire a pele para expor o músculo nos membros traseiros.</li>
		<li>Coloque o rato em seu abdômen e desloque os membros traseiros levantando-o da articulação do joelho e colocando pressão sobre os quadris. A luxação pode ser sentida na articulação do quadril.</li>
		<li>Remova as pernas traseiras cortando cuidadosamente o músculo do quadril, garantindo que não ocorra danos ao fêmur.</li>
		<li>Corte acima da articulação do tornozelo, retire o pé e limpe qualquer pele restante da perna.</li>
		<li>Coloque as pernas dissecadas em um tubo de 50 mL com 25 mL de PBS gelado (sem necessidade de antibiótico) e coloque-a no gelo. NOTA: Vários animais podem ser dissecados, e as pernas mantidas no gelo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Em condições estéreis em uma capa de cultura tecidual, remova os músculos das pernas e remova as extremidades dos ossos para expor a medula óssea.<ol>
<li>Coloque as pernas em 70% de etanol por 2 minutos para reduzir a contaminação e lavar qualquer pele ou resíduo.</li>
		<li>Transfira as pernas para uma placa de Petri limpa, estéril e bacteriológica. Use fórceps e um bisturi para raspar com firmeza e cuidado ao longo dos ossos com o lado da lâmina para remover os músculos. Corte os tendões para facilitar o processo.</li>
		<li>Remova a epífise na extremidade de cada osso para expor a medula óssea. O fêmur é cortado em ambos os lados, apenas aquém das respectivas articulações.</li>
		<li>A tíbia é cortada na parte superior, apenas aquém da articulação do joelho, e na parte inferior logo acima do ponto de intersecção com a fíbula.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retire a medula óssea dos ossos com PBS e colete-a em um tubo estéril de 50 mL.<ol>
<li>Encha uma seringa de 10 mL com 10 mL de PBS e conecte-se a uma agulha de 25 G x 0,5 x 16 mm. Isso é suficiente para lavar todos os ossos de um rato.</li>
		<li>Insira a agulha na cavidade medular do osso e lave suavemente a medula óssea com 1-2 mL de PBS, passando a agulha para cima e para baixo através do osso para garantir que toda a medula óssea seja desalojada.</li>
		<li>Repita para todos os ossos, coletando a medula óssea lavada em uma placa de Petri limpa.</li>
		<li>Usando uma seringa estéril de 1 mL, desagrega a medula óssea puxando a suspensão para dentro e para fora da seringa 5-10 vezes até que quaisquer caroços sejam quebrados.</li>
		<li>Colete a medula óssea desagregada na seringa de 1 mL e passe-a através de um coador de células de 70 μM em um tubo de centrífuga de 50 mL limpo. Coloque a medula óssea coletada no gelo enquanto outras amostras são coletadas. NOTA: Veja o esquema de protocolo na Figura 1 - Parte 1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Seleção, diferenciação e estimulação de BMDMs
<ol><li>Para congelar a medula óssea para uso posterior, pelotar a medula óssea por centrifugação a 1000 x g por 5 min e resuspend em 2 mL de baixa endotoxina FBS contendo 5% De Sulfóxido de Dimetil (DMSO).<ol>
<li>Centrifugar a suspensão da medula óssea a 1000 x g por 5 min a temperatura ambiente (RT). Uma pelota vermelha de sangue se formará.</li>
		<li>Descarte o supernatante.</li>
		<li>Resuspenque suavemente a pelota em 2 mL de FBS de baixa endotoxina contendo 5% de DMSO e congele a -80 °C durante a noite antes de transferir para nitrogênio líquido em fase de vapor para armazenamento a longo prazo.</li>
	</ol></li>
	<li>Para usar a medula óssea imediatamente, lise os glóbulos vermelhos antes de emplacar a medula óssea.<ol>
<li>Centrifugar a suspensão da medula óssea a 1000 x g por 5 min no RT. Uma pelota vermelha de sangue se formará.</li>
		<li>Resuspense a pelota em 3 mL de 1x tampão de lise de glóbulos vermelhos e incubar na RT por 5 min.</li>
		<li>Adicione 10 mL de PBS e centrífuga a 1000 x g por 5 min na RT. Descarte o supernascente.</li>
		<li>Emplaque as células para uso imediato, continuando a partir da etapa 2.3.5.</li>
	</ol></li>
	<li>Descongele os macrófagos e resuspende em 3 mL de mídia de revestimento antes de pelleting as células.<ol>
<li>Prepare ODMEM: F12 contendo 5% de baixa endotoxina FBS, penicilina/estreptomicina 1x, L-glutamina e 25 ng/mL M-CSF. NOTA: M-CSF e GM-CSF podem ser preparados com ressus pendentes de proteína seca em água estéril contendo BSA 0,1% estéril, e as alíquotas podem ser congeladas a -80 °C para uso posterior.</li>
		<li>Descongele a suspensão da célula congelada rapidamente a 37 °C.</li>
		<li>Transfira a suspensão celular (0,5 mL) para um tubo limpo e estéril contendo 3 mL do DMEM preparado: mídia F12.</li>
		<li>Pelota as células por centrifugação a 1000 x g por 5 min na RT. Descarte o sobrenante.</li>
		<li>Resuspense a pelota em 3 mL do DMEM preparado: mídia F12.</li>
		<li>Conte as células por um método preferido.</li>
	</ol></li>
	<li>Dia 0: Emplacar as células.<ol>
<li>Placa das células em plástico não revestido de TC em DMEM: mídia F12 contendo 5% de baixa endotoxina FBS, penicilina/estreptomicina 1x, L-glutamina e 25 ng/mL M-CSF. NOTA: As densidades representativas de semeadura estão descritas na Tabela 1. Um par completo de pernas de um rato fornece 15-20 milhões de células precursoras.</li>
		<li>Incubar as células a 37 °C com 5% de CO2.</li>
	</ol></li>
	<li>Dia 5: Alimente as células.<ol>
<li>Alimente as células adicionando 50% do volume original de DMEM: mídia F12 contendo 5% de baixa endotoxina FBS, penicilina/estreptomicina 1x, L-glutamina e 50 ng/mL M-CSF.</li>
	</ol></li>
	<li>Dia 6: Estimule as células com GM-CSF.<ol>
<li>Adicione GM-CSF preparado a uma concentração final de 50 ng/mL diretamente à mídia de cultura celular nas células.</li>
	</ol></li>
	<li>Substitua a mídia por DMEM preparado: F12.<ol>
<li>Remova todas as mídias das células.</li>
		<li>Lave as células brevemente em PBS pré-aquecido.</li>
		<li>Adicionar DMEM: mídia F12 contendo 2% de baixa endotoxina FBS, penicilina 1x/estreptomicina, L-glutamina, 25 ng/mL M-CSF e 50 ng/mL GM-CSF.</li>
		<li>Ative os macrófagos nos fenótipos M0, M1 ou M2 com as estimulações descritas nas etapas 2.7.5-2.7.7.</li>
		<li>M0 - Não é necessária estimulação. Incubar as células durante a noite na mídia.</li>
		<li>M1 - Estimule as células com 100 ng/mL LPS e 10 ng/mL IFNγ (concentrações finais) durante a noite.</li>
		<li>M2 - Estimular células com 100 ng/mL IL-4 (concentração final) durante a noite.</li>
	</ol></li>
	<li>Dia 8: Colhe as células.<ol>
<li>Remova a mídia das células (colete mídia e congele a -80 °C para ensaios a jusante).</li>
		<li>Incubar as células em PBS gelado (50% do volume de mídia) por 5 min.</li>
		<li>Retire as células da placa com raspagem suave ou tubulação repetida.</li>
		<li>Pelota as células por centrifugação a 2500 x g por 5 min na RT. Descarte o sobrenante.</li>
		<li>Congele as pelotas de célula a -80 °C para uso posterior. NOTA: Veja o esquema de protocolo Figura 1 - Parte 2.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Zajd, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+and+elicited+peritoneal+macrophages+are+not+created+equal:+The+questions+asked+dictate+the+cell+type+used.">Bone marrow-derived and elicited peritoneal macrophages are not created equal: The questions asked dictate the cell type used.</a> Frontiers in Immunology. 11, 269 (2020).</li><li>Murray, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization:+nomenclature+and+experimental+guidelines.">Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines.</a> Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).</li><li>Zhao, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+characteristics+of+macrophages+derived+from+murine+spleen,+peritoneal+cavity,+and+bone+marrow.">Comparison of the characteristics of macrophages derived from murine spleen, peritoneal cavity, and bone marrow.</a> Journal of Zheijang University Science B. 18 (12), 1055-1063 (2017).</li><li>Nasser, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+bone+marrow-derived+M-CSF+receptor-dependent+self-renewing+macrophages.">Establishment of bone marrow-derived M-CSF receptor-dependent self-renewing macrophages.</a> Cell Death Discovery. 6, 63 (2020).</li><li>Stanley, E. R., Heard, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+regulating+macrophage+production+and+growth.+Purification+and+some+properties+of+the+colony+stimulating+factor+from+medium+conditioned+by+mouse+L+cells.">Factors regulating macrophage production and growth. Purification and some properties of the colony stimulating factor from medium conditioned by mouse L cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 252 (12), 4305-4312 (1977).</li><li>Bailey, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+murine+bone+marrow-derived+macrophages+for+nitric+oxide+and+redox+biology.">Isolation and culture of murine bone marrow-derived macrophages for nitric oxide and redox biology.</a> Nitric Oxide. 100-101, 17-29 (2020).</li><li>Shiva, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrite:+A+physiological+store+of+nitric+oxide+and+modulator+of+mitochondrial+function.">Nitrite: A physiological store of nitric oxide and modulator of mitochondrial function.</a> Redox Biology. 1 (1), 40-44 (2013).</li><li>McNeill, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+iNOS+function+and+cellular+redox+state+by+macrophage+Gch1+reveals+specific+requirements+for+tetrahydrobiopterin+in+NRF2+activation.">Regulation of iNOS function and cellular redox state by macrophage Gch1 reveals specific requirements for tetrahydrobiopterin in NRF2 activation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 79, 206-216 (2015).</li><li>McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+macrophage+phenotype+by+cell+shape.">Modulation of macrophage phenotype by cell shape.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (43), 17253-17258 (2013).</li><li>Bailey, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+modulates+metabolic+remodeling+in+inflammatory+macrophages+through+TCA+cycle+regulation+and+itaconate+accumulation.">Nitric oxide modulates metabolic remodeling in inflammatory macrophages through TCA cycle regulation and itaconate accumulation.</a> Cell Reports. 28 (1), 218-230 (2019).</li><li>Hamilton, T. A., Zhao, C., Pavicic, P. G., Datta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+colony-stimulating+factors+as+regulators+of+macrophage+polarization.">Myeloid colony-stimulating factors as regulators of macrophage polarization.</a> Frontiers in Immunology. 5, 554 (2014).</li><li>Na, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF+induces+inflammatory+macrophages+by+regulating+glycolysis+and+lipid+metabolism.">GM-CSF induces inflammatory macrophages by regulating glycolysis and lipid metabolism.</a> Journal of Immunology. 197 (10), 4101-4109 (2016).</li><li>Sorgi, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF+priming+drives+bone+marrow-derived+macrophages+to+a+pro-inflammatory+pattern+and+downmodulates+PGE2+in+response+to+TLR2+ligands.">GM-CSF priming drives bone marrow-derived macrophages to a pro-inflammatory pattern and downmodulates PGE2 in response to TLR2 ligands.</a> PLoS One. 7 (7), 40523 (2012).</li></ol>

Os autores não declaram interesses concorrentes.

Este protocolo de cultura BH4 e NO-deficiente de BMDMs foi projetado para investigar a biologia no-redox em macrófagos primários através da redução da tetrahidrobiopterina (BH4) e outros artefatos interferentes com o objetivo de aumentar a confiabilidade e a reprodutibilidade dos resultados obtidos a partir desses modelos experimentais. 
As etapas críticas incluem o uso do material plástico correto. Progenitores macrófagos são células aderentes e muito pegajosas; portanto, o uso de placas tratadas não-teciduais (TC) é crucial para selecioná-las e isolá-las de outras células progenitoras, que poderiam de outra forma anexar e reduzir a pureza. No dia da colheita, macrófagos descolados de placas requerem PBS gelado, mas o uso de EDTA ou mesmo células de raspagem muito suavemente pode ser realizado dependendo da aplicação a jusante (experimento de células vivas lysed versus live, por exemplo). Deve-se também tomar cuidado especial em relação à contaminação. Ao eliminar a medula óssea, pode ocorrer uma possível contaminação cruzada com bactérias ou partículas virais de restos de pele e pele. É, então, essencial ser o mais cuidadoso e estéril possível; por isso, a queda das pernas dissecadas em 70% de etanol por alguns minutos é incentivada. Da mesma forma, o uso de antibióticos durante o cultivo de macrófagos é altamente recomendado.
Outra limitação deste protocolo surge da densidade de revestimento celular no dia 0. A medula óssea corada contém uma variedade de células, que podem ser erroneamente contadas e incluídas como progenitoras de macrófago, levando assim a um falso número total de células. Para evitar a variabilidade subsequente e potencial, os macrófagos isolados podem ser suavemente lavados usando PBS quente no dia 7 e re-banhados na densidade correta em 2%FBS DMEM: F12 pelo menos 1 h antes da estimulação para permitir a adesão. 
Finalmente, verificar os níveis de nitrito por griess ensaio usando mídia de macrófagos cultivados é imperativo para analisar dados. No lado positivo, este ensaio é rápido e barato de executar.
Como demonstrado aqui, este protocolo personalizado é uma alternativa mais definida e melhorada ao protocolo mais comum usado para isolar e cultivar macrófagos usando mídia condicionada de células L (LCM). De fato, uma das principais preocupações que o uso do LCM ao estudar a biologia no-redox são suas quantidades significativas de biopterinas detectadas, levando a potenciais alterações metabólicas10. Por exemplo, o exógeno BH4 pode repor rapidamente modelos deficientes e atuar como um cofator para iNOS, levando à produção indesejada de óxido nítrico. Outra desvantagem do uso do LCM está em sua produção - LCM é uma mistura de fatores estimulantes de colônias, citocinas e outros subprodutos secretados diretamente pelas células L-929, que podem afetar a fisiologia do macrófago6. Apesar de sua grande oferta em M-CSF, essencial para a proliferação e sobrevivência do macrófago, a variação de cada componente de lote para lote aumenta o risco de variabilidade entre os experimentos. 
Para resolver ambas as questões, este novo protocolo utiliza o bem definido DMEM: mídia F12 contendo baixos níveis de biopterinas aos quais uma quantidade controlada de M-CSF purificado e GM-CSF é adicionada. Ambas as citocinas auxiliam na diferenciação e crescimento dos macrófagos. O M-CSF leva especialmente à geração de BMDMs a partir de células progenitoras de medula óssea, garantindo a diferenciação das células-tronco hematopoiéticas em macrófagos11. Além disso, o GM-CSF tem sido mostrado para aumentar a citocina inflamatória e a produção DE NO quando adicionado antes da estimulação, um benefício real ao estudar biologia no-redox 12,13.
O outro fator principal que este novo método aborda é o da FBS, geralmente utilizada como fonte de nutrientes essenciais para a boa saúde e crescimento das células. Semelhante ao LCM, o FBS contém níveis significativos de biopterna. Enquanto a fome completa de soro das células antes da estimulação foi inicialmente considerada usando OptiMEM + 0,2% BSA, os macrófagos apresentaram sinais de descolamento, indicativos de diminuição da viabilidade celular, como descrito por Bailey et al.6. No entanto, como os macrófagos demonstraram um requisito absoluto para o soro, a Endotoxina Ultra-Baixa FBS da BioWest foi selecionada. Os lotes foram testados para biopterinas e pré-selecionados antes da compra em massa para garantir uma oferta confiável e bem definida. Para avançar ainda mais no sentido de reduzir as fontes poluentes de biopterinas, foram, portanto, testadas concentrações reduzidas de FBS. Em vez de usar 10% de soro como comumente usado na cultura celular, o nível de FBS é mantido para 5% ao longo da diferenciação de 7 dias da medula óssea em macrófagos e ainda reduzido a 2% durante a estimulação durante a noite no último dia. Isso garante níveis insignificantes de biopterinas detectadas, mas nutrientes suficientes para a boa saúde e adesão de macrófagos. Embora este protocolo recém-otimizado usando M-CSF recombinante resulte em um ambiente mais controlado para a cultura e ativação de macrófagos primários, a principal limitação é que este método é mais caro do que usar o método LCM.
Levando em consideração todos esses fatores, os dois métodos foram então comparados diretamente. É importante ressaltar que o protocolo recém-modificado aqui apresentado usando m-CSF recombinante e GM-CSF resultou em um sistema mais reprodutível onde a mídia era desprovida de contaminar BH4. Os efeitos disso foram duas vezes; As células deficientes bh4 estavam realmente carentes de BH4, o que resultou em um mínimo de acúmulo de nitrito detectável na mídia após a estimulação ao status M1 com LPS. Isso contrastava com as mesmas células BMDM cultivadas em LCM, onde foram detectadas significativas BH4 e nitrito. 
Para concluir, a força deste método reside no esforço de controlar os níveis de biopterinas, avaliando minuciosamente cada parâmetro que poderia afetar a sinalização NO e redox em macrófagos. Em particular, isso garante a máxima reprodutibilidade e padronização no campo da biologia no-redox.

Macrófagos foram estabelecidos como um tipo celular interessante em uma grande variedade de doenças e condições, muitas aparentemente não relacionadas ao seu foco tradicional na imunidade inata. Como a fisiologia do macrófago é fortemente dependente do tecido ou ambiente em que residem, muitos métodos e modelos surgiram para estudar sua função e as diversas vias envolvidas. Historicamente, as linhas celulares do macrófago, como raw264.7, dominaram o campo, mas estas foram gradualmente substituídas em favor de vários modelos de células primárias. Por exemplo, macrófagos murinos podem ser isolados da lavagem peritoneal após o tratamento com tioglicolato. Embora fornecendo um modelo útil para o estudo de células residentes por tecidos, esses macrófagos peritoneais têm demonstrado uma resposta mais moderada a vários estímulos externos, limitando assim sua adequação para muitas aplicações a jusante1.
Como alternativa, macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs), derivados de células progenitoras mieloides na medula óssea, surgiram como um modelo valioso para estudar vários aspectos da biologia macfago, incluindo a maturação e os diversos fenótipos clássicos associados a macrófagos, M0 (ingênuo, não ativado), M1 (pró-inflamatório, geralmente ativado com LPS/IFN) e M2 (pró-resolução, geralmente ativado com IL-4)2, 3. No entanto, a diferenciação das células progenitoras mieloides em BMDMs depende da presença de fator estimulante de colônias de macrófagos (M-CSF) na mídia cultural 4,5. Isso pode ser fornecido na forma de proteína purificada adicionada à mídia ou a partir de mídia condicionada L929 (LCM). As vantagens do uso de BMDMs (custo e eficiência) devem ser ponderadas contra as limitações apresentadas por sua sensibilidade a diversos estímulos (citocinas, intermediários metabólicos e RNS/ROS).
Dados anteriores indicam que os conteúdos do LCM são pouco definidos e intrinsecamente variáveis, resultando em sua não-inadequação e inadequado para uma variedade de aplicações a jusante, especialmente aquelas especificamente relacionadas à biologia NO ou redox, pois estas podem ser fortemente influenciadas pela presença de compostos exógenos6. Como tal, este protocolo detalhado exige o uso de DMEM bem definido: mídia F12 com variação de lote baixo para lote e a adição de murine recombinante M-CSF e GM-CSF (fator estimulante da colônia granulocito-macrófago). Além disso, o soro bovino fetal normalmente usado como suplemento na mídia de cultura tecidual fornece mais uma fonte de compostos mal definidos e variabilidade inerente. É necessário, portanto, controlar e otimizar o uso desses aditivos para garantir a cultura confiável dos BMDMs. Usando uma fonte de baixa endotoxina definida de FBS e garantindo que os lotes únicos sejam adquiridos em massa, as condições de cultura são definidas de forma confiável e a reprodutibilidade é garantida. O protocolo descrito aqui foi demonstrado para produzir uma cultura de macrófago acima de 95% de pureza quando avaliado para os marcadores de superfície macfago CD45 e CD11b por citometriade fluxo 6.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS+01T1</td>
			<td>1mL 6% LUER syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL plastic syringe</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14955453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate sterile non-treated</td>
			<td>CytoOne</td>
			<td>CC7672-7506</td>
			<td>Flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 (1:1) (1x)</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>21331-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO sterile</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy flask 260 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine Solution 200 mM</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>G7513-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>L4391-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutlidish 12 sterile non-treated</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150200</td>
			<td>Flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 25G, 0.5 x 16 mm</td>
			<td>BD Microlance 3</td>
			<td>300600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH7.4, 1x)</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>10010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P0781-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dish 100 x15 mm sterile</td>
			<td>Falcon, Corning incorporated</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine GM-CSF</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>315-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine IFN-&#947;</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>315-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine M-CSF</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel n23</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low endotoxin FBS</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1860-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR cell strainers 70 &#181;m nylon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-2758</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and in vitro culture of bone marrow-derived macrophages for the study of no-redox biology

Macrófagos são derivados de células progenitoras hematopoiéticas em todo o corpo, são centrais para processos inflamatórios e participam de respostas imunes inatas e adaptativas. O estudo in vitro de macrófagos pode ser realizado pela cultura ex vivo do peritônio ou pela diferenciação de células progenitoras de medula óssea mieloides para formar macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs). Uma abordagem comum à diferenciação de macrófagos dos precursores envolve o uso de mídia condicionada a partir de células L929 (LCM). Esta mídia é fácil de produzir, mas sofre de variabilidade em lote, e seus constituintes são indefinidos. Da mesma forma, o Soro Bovino Fetal (FBS) é usado para suportar o crescimento, mas contém uma vasta mistura de moléculas indefinidas que podem variar entre os lotes. Esses métodos não são adequados para o estudo da biologia do óxido nítrico e dos mecanismos redox, pois ambos contêm quantidades substanciais de pequenas moléculas que interferem com mecanismos de redox ou níveis de suplemento de cofatores, como a tetrahidrobiopterina (BH4), necessária para a produção de NÃO a partir de sinthase de óxido nítrico indutível (iNOS). Neste relatório, apresentamos um protocolo otimizado que permite o controle do ambiente NO-redox, reduzindo os níveis de biopoterina exógena, mantendo condições adequadas para o crescimento celular e diferenciação. O controle rigoroso da composição da mídia cultural ajuda a garantir a reprodutibilidade experimental e facilita a interpretação precisa dos resultados. Neste protocolo, os BMDMs foram obtidos a partir de um modelo de mouse deficiente gtp cyclohydrolase (GCH). A cultura de BMDMs foi realizada com mídias contendo LCM (i) condicionado, ou (ii) M-CSF recombinante e GM-CSF para produzir artefatos mínimos enquanto obtenção de condições culturais BH4 e NO-deficientes - permitindo assim o estudo reprodutível de biologia no-redox e imunometabolismo in vitro.

Antes de demonstrar a eficiência deste protocolo nos níveis de macrófagos, nitrito e BH4 foram avaliados em mídia suplementada com 10% de FBS contendo 10% de LCM ou apenas M-CSF recombinante e GM-CSF. O nitrito, embora considerado por muito tempo como um produto final do metabolismo do óxido nítrico, é agora considerado como armazenamento fisiológico de óxido nítrico, que pode ser reciclado quando necessário e, portanto, é frequentemente usado como um indicador da biodissebilidade de óxido nítrico7. BH4 é um coator essencial do NOS para nenhuma produção. Como visto na Figura 2, a mídia suplementada com 10% de FBS apresentava níveis semelhantes de nitrito, independentemente do M-CSF/GM-CSF ou LCM. No entanto, observou-se maior variabilidade entre diferentes lotes de LCM. Essa observação também se aplica à medição bh4. Na verdade, um lote de LCM (lote nº 3) apresentou nível significativamente maior de BH4 do que os outros dois (lotes #1 e #2). Além disso, os lotes de LCM continham significativamente mais biopterina do que a mídia suplementada com 10% de FBS e citocinas recombinantes. Também foi medida uma variabilidade significativa do total de biopterinas entre os lotes. Esses resultados demonstram a importância do uso de uma fonte menos variável de M-CSF do que a LCM.
Além disso, a mídia suplementada com 10% de FBS continha níveis significativamente mais elevados de nitrito em comparação com os meios que contêm 2% ou 5% da FBS. A diferença entre 10% e 5% foi altamente significativa (p < 0,05) para BH4. No entanto, níveis semelhantes de biopterinas foram quantificados. Em comparação, o OptiMEM + 0,2% BSA foi desprovido de nitrito e BH4, tornando-o um meio de comunicação muito limpo e adequado. No entanto, como descrito por Bailey et al., embora o OptiMEM seja feito para ser usado apenas uma vez durante a noite ao estimular macrófagos, observou-se morte celular devido à fome. DMEM: O F12 complementado com 2% da FBS foi escolhido para superar essa questão, permitindo a mínima contaminação por nitrito e BH4, ao mesmo tempo em que contém nutrientes suficientes para a obtenção de células saudáveis. De fato, apesar de alguns nitrito serem detectados, os níveis são insignificantes (~0,2 μM) em comparação com macrófagos estimulados por LPS/IFN (30-80 μM para 1 x 106 células; dados não mostrados).
Para validar este protocolo aprimorado com dados experimentais, o isolamento e a caracterização de BMDMs de um novo modelo de mouse deficiente BH4, o R26-CreERT2Gchfl/fl é apresentado aqui. BH4 é produzido pelo gene GTP cyclohydrolase I (Gch1). Como mostrado na Figura 3A, a deficiência no Gch1 leva à perda de BH4 e ao desaparecimento resultante de NO e, posteriormente, nitrito, e um aumento no ânion superóxido causando estresse oxidativo, como demonstrado anteriormente por McNeill et al.8. Embora este protocolo já tenha sido bem definido e usado para cultivar outros macrófagos deficientes BH4 de diferentes sistemas Cre, como o modelo Gchfl/flT2C 6,8, o modelo R26-CreERT2Gchfl/fl é único, pois utiliza a ativação condicional do sistema Cre-ERT2 para remover o gene Gch1 após o tratamento de tamoxifen (Figura 3B, C). Isso permite nocaute em vários pontos de tempo e o uso de controle interno na forma de um veículo vs. tratamento tamoxifen. Neste exemplo, as células foram tratadas com um veículo (95% etanol) ou 0,1/1,0 μM 4-OH tamoxifen nos dias 1 e 3 (ambos os veículos e ações de tamoxifen diluídos 1:100 em mídia antes de 0,7/7.0 μL adicionado a 1 mL do volume de cultura existente).
Como visto na Figura 3D, a proteína GTPCH é abolida após o tratamento de Tamoxifen nas células R26-CreERT2Gchfl/fl, mas não no Gchfl/fl um. É importante ressaltar que as células de controle R26-CreERT2Gchfl/fl e Gchfl/fl ainda são capazes de produzir iNOS após a estimulação LPS/IFN (Figura 3B,C). Essas alterações na expressão genética Gch1 e a consequente alteração na proteína GTPCH levaram a níveis de BH4 intracelulares significativamente perturbados e à produção atenuada de nitrito. Como mostrado na Figura 4, os BMDMs isolados e cultivados a partir de ratos R26-CreERT2Gchfl/fl apresentaram significativamente diminuído a produção bh4 e diminuíram o acúmulo de nitrito na mídia, em comparação com aqueles de células GCHfl/fl de controle na presença de tamoxifen. Da mesma forma, as mesmas células cultivadas nos meios de LCM também mostraram expressão Gch1 abolida; embora essas células ainda produzissem quantidades significativas tanto de BH4 quanto de nitrito após o nocaute da expressão Gch1 com 4 OH tamoxifen, possivelmente devido à contaminação da mídia e FBS com BH4. Isso representa uma clara melhoria do novo método, sobre a cultura das células em mídia contendo células L.
A caracterização adicional deste modelo não demonstra diferenças significativas na morfologia entre os BMDMs não ativados (M0) Gchfl/fl eR26-CreER T2Gchfl/fl/fl no dia 8, seguindo diferentes concentrações de tamoxifen. Como mostrado na Figura 5, ambos os modelos exibem uma quantidade semelhante de células aderentes feitas de uma forma redonda com extremidades alongadas, tipicamente as características esperadas de macrófagos não estimulados9.
Juntos, esses resultados demonstram que esse método de isolamento e cultura de BMDMs proporciona uma população pura de células adequadas à cultura dos macrófagos murinos. Este método permite a cultura de macrófagos murinos sem a interferência de compostos exógenos presentes em algumas formulações midiáticas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62834/62834fig01.jpg"> Figura 1: Diagrama esquemático que ilustra o isolamento das células de medula óssea (Parte 1) para a seleção, diferenciação e estimulação de BMDMs (Parte 2) Em condições estéreis, as pernas dissecadas são colocadas em uma placa de petri bacteriológica limpa após serem lavadas em 70% de etanol. (B) Os músculos são cuidadosamente removidos usando fórceps e arranhões de bisturi ao longo dos ossos. (C) As extremidades dos ossos são então cortadas para expor a medula óssea. (D) A medula óssea é lavada dos ossos usando uma seringa de 10 mL preenchida com 10 mL de PBS inserindo a agulha no lúmen do osso. (E) A agulha é executada para cima e para baixo através do osso para garantir que toda a medula óssea seja desalojada. O osso deve parecer branco e claro nessa fase com a medula óssea desalojada coletada na placa de petri. (F-G) Repita para todos os ossos, coletando a medula óssea desagregada na seringa de 1 mL, e passe-a através de um coador de células de 70 μm em um tubo de centrífuga de 50 mL limpo. Gire para baixo e resuspend células em mídia de congelamento para uso posterior. Parte 2 mostra a seleção, diferenciação e estímulo de BMDMs <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62834/62834fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62834/62834fig02.jpg"> Figura 2: Nitrito e BH4 níveis em DMEM: F12 + GM-CSF + M-CSF ou DMEM: mídia de células L F12+. (A) Os níveis de nitrito em diferentes mídias foram medidos usando o método Griess Assay. (B) Os níveis bh4 e biopterinas foram medidos em diferentes mídias pela quantificação HPLC utilizando um padrão BH4. Os dados são expressos como a média (n = 3) ± os dados foram analisados utilizando-se a ANOVA unidirecional por várias comparações. Os símbolos representam p < 0,05 entre os grupos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62834/62834fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62834/62834fig03.jpg"> Figura 3: Introdução do modelo R26CreERT2. (A) Esquema que ilustra o papel do BH4 como cofator nos na biologia redox. (B) Esquema detalhando a excisão dos exons críticos (2 e 3) em Gch1 devido aos locais de loxP flanqueamento e à ativação condicional do Cre-ERT2 com tamoxifen neste modelo murino. (C) PCR (representante de n = 3 animais independentes) demonstrando excisão do exon crítico quando os BMDMs são tratados com tamoxifen. Os camundongos WT produzem um produto PCR de 1030 bp, enquanto na presença do Cre, é produzido um produto de 1392 bps, confirmando a excisão dos exons críticos. (D) Imunoblot de iNOS, GCH e B-tubulin (representante de n = 3 animais independentes). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62834/62834fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62834/62834fig04.jpg"> Figura 4: Caracterização da deficiência BH4 em macrófagos. (A,B) qRT-PCR confirma perda de expressão Gch1 no modelo R26-CreERT2Gchfl/fl tratado com tamoxifen. Azul = Novo método MCSF, método Verde = LCM clássico. (C,D) A análise do BH4 intracelular pelo HPLC revela que 0,1 μM e 1,0 μM são suficientes para diminuir significativamente os níveis de BH4. (E, F) A medição do nitrito na mídia usando o ensaio griess mostra que BMDMs não estimulados não produzem níveis detectáveis de nitrito, enquanto Gchfl/fl eR26-CreER T2Gchfl/fl/fl BMDMs produzem nitrito na presença de LPS/IFNγ. Significativamente, o tratamento de tamoxifen de R26-CreERT2Gchfl/fl reduz significativamente os níveis de nitrito em BMDMs estimulados. Os dados são expressos como a média de (n = 3) ± SD. Os dados foram analisados utilizando-se de uma ANOVA unidirecional por várias comparações. Os símbolos representam p < 0,05 entre os grupos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62834/62834fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62834/62834fig05.jpg"> Figura 5: Comparação da morfologia dos BMDMs. Fotos obtidas por microscopia óptica de BMDMs no dia 8 com o tratamento variado de tamoxifen. A escala é indicada na imagem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62834/62834fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Prato de Cultura</td>
			<td>Volume de mídia</td>
			<td>Densidade de semeadura</td>
		</tr>
<tr>
<td>12 pratos de bem</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>500.000 células</td>
		</tr>
<tr>
<td>6 prato bem</td>
			<td>2 mL</td>
			<td>1.000.000 células</td>
		</tr>
<tr>
<td>Prato de 100 mm</td>
			<td>10 mL</td>
			<td>3.000.000 células</td>
		</tr>
<tr>
<td>Frasco de 75 cm2</td>
			<td>15 mL</td>
			<td>5.000.000 células</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Densidades representativas de semeadura.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and In vitro Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages for the Study of NO-Redox Biology at JoVE.com

Isolation and In vitro Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages for the Study of NO-Redox Biology

Este protocolo foi estabelecido para cultivar tetrahidrobiopterina (BH4)- e sintetizador de óxido nítrico indutível (iNOS)-deficiente macrófagos murinos para estudar biologia no-redox. O estudo tem como foco a redução da contaminação potencial do BH4 e de outros artefatos encontrados em métodos tradicionais de isolamento e cultura que podem confundir desfechos experimentais e interpretação dos resultados.

Isolamento e Cultura In vitro de Macrófagos Derivados da Medula Óssea para o Estudo da Biologia NO-Redox

Macrophages are derived from hematopoietic progenitor cells throughout the body, are central to inflammatory processes, and participate in innate and ...

Este protocolo ajuda a criar macrófagos derivados da medula óssea de camundongos deficientes iNOS ou BH4 usando mídia e soro cuidadosamente definidos com baixos níveis de BH4 e nitrato para evitar interferências com mecanismos de redox. Controlando cuidadosamente os níveis de potenciais contaminantes no processo de cultura, podemos limitar a interferência de óxido nítrico, garantindo precisão e reprodutibilidade do sistema modelo. Este método permite medições precisas de biopterinas, óxido nítrico e quaisquer fatores a jusante relacionados a esses compostos essenciais.Demonstrando o procedimento estará o Dr. Thomas Nichol, um pesquisador de pós-doutorado do nosso laboratório. Para começar, coloque as pernas em 70% de etanol por dois minutos para lavar qualquer pele ou resíduo. Em seguida, transfira as pernas para uma placa de Petri bacteriológica limpa e estéril.Raspe cuidadosamente ao longo do comprimento dos ossos com a lâmina, cortando os tendões e removendo o músculo do osso. Uma vez que os ossos tenham sido limpos de músculo, corte a epífise no topo da tíbia, logo abaixo do joelho. A tíbia pode ser cortada na extremidade inferior, logo acima do cruzamento com a fíbula.Finalmente, corte a epífise em cada extremidade do fêmur, logo após as articulações do joelho e quadril. Para lavar a medula óssea, encha uma seringa de 10 mililitros com 10 mililitros de PBS e anexe-a a uma agulha. Em seguida, insira a agulha na cavidade medular do osso.Levemente alinhado com um a dois mililitros de PBS, executando a agulha para cima e para baixo. Em seguida, desenhe a suspensão cinco a dez vezes dentro e fora de uma seringa mililitro para desagregar. Colete a suspensão em uma seringa de um mililitro e passe-a através de um coador de células de 70 micrômetros em um tubo de centrífuga de 50 mililitros limpo.Finalmente, coloque as amostras no gelo. Para congelar a medula óssea para uso posterior, centrifugar as células a 1000 G durante cinco minutos à temperatura ambiente. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota vermelha em dois mililitros de anticongelante.Em seguida, incubar-lo a 80 graus Celsius durante a noite. Se congelado, descongele a suspensão rapidamente a 37 graus Celsius. Transfira a suspensão da célula para um tubo limpo estéril contendo três mililitros de mídia DMEM/F-12.Em seguida, pelota as células por centrifugação. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em três mililitros da mídia DMEM/F-12 preparada. Conte as células e as emplaque em plástico revestido não TC na mídia DMEM/F-12 preparada.Em seguida, incubar as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. No quinto dia, alimente as células adicionando 50% do volume original de mídia DMEM/F-12. No sexto dia, estimule as células adicionando GM-CSF preparado a uma concentração final de 50 nanogramas por microliter diretamente à mídia de cultura celular.No sétimo dia, remova toda a mídia das células. Em seguida, lave as células brevemente com PBS pré-aquecido e adicione mídia DMEM/F-12 contendo 2% de baixa endotoxina FBS, penicilina 1X ou estreptomicina, L-glutamina, 25 nanogramas por microliter M-CSF, e 50 nanogramas por microliter GM-CSF. Finalmente, incubar as células durante a noite na mídia para ativar os macrófagos ao fenótipo M0.Para o fenótipo M1, estimule as células com 100 nanogramas por LPS microliter, e 10 nanogramas por microliter IFN-gama. Para o fenótipo M2, estimule as células com 100 nanogramas por microliter IL-4. Incubar as células durante a noite.No oitavo dia, as células estão prontas para colheita ou processamento a jusante de acordo com as necessidades do pesquisador. A mídia suplementada com 10% de FBS tinha nitrito e tetrahidrobiopterina semelhantes, independentemente de M-CSF e GM-CSF, ou LCM. Mas os níveis totais de biopterina foram mais elevados na mídia suplementada de LCM.No entanto, observou-se maior variabilidade entre diferentes lotes de LCM. PcR mostrou um produto de par de base 1030 em ratos do tipo selvagem, enquanto os ratos de nocaute GCH produziram um produto de par base 1392, confirmando a excisão dos exons críticos. O tratamento de tamoxifen aboliu a proteína GCH nas células eliminatórias.As células de nocaute e controle ainda produziam iNOS, seguindo lps e estimulação IFN. BMDMs cultivados a partir de camundongos eliminatórios GCH condicional apresentaram tetrahidrobiopterina significativamente diminuída e diminuição do nitrito. As mesmas células cultivadas nos meios de LCM não tinham expressão GCH1.No entanto, as células produzem quantidades significativas de tetrahidrobiopterina e nitrito após nocaute. No oitavo dia, não houve diferenças significativas na morfologia entre o controle não ativado e os BMDMs de nocaute de GCH em diferentes concentrações de Tamoxifen. Os BMDMs exibem as características esperadas de macrófagos não estimulados, com células aderentes redondas e extremidades alongadas.Ao trabalhar com células primárias como esta, é imperativo esterilizar todos os tecidos e equipamentos completamente. Além disso, escolher a mídia e o suplemento certos é importante para manter um baixo óxido nítrico e ambiente BH4. Pelotas celulares e mídia podem ser usadas para várias aplicações a jusante, com foco no papel de óxido nítrico, biopterina ou estado de redox celular.Pode incluir HPLC, qPCR e mancha ocidental, entre outros.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and In vitro Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages for the Study of NO-Redox Biology

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Isolamento T de linfócitos humanos, Cultura e Análise da Migração In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Imunologia e Infecção

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii Formação parede do cisto no Activated derivadas da medula óssea macrófagos e Condições Bradyzoite

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Geração e Rotulagem de murino derivadas da medula óssea Células Dendríticas com Nanocristais Qdot de Estudos de rastreamento

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

Investigação de polarização de macrófagos Usando medula macrófagos derivados

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Estabelecimento de um<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema para estudar o comportamento intracelular de<em&gt; Candida glabrata</em&gt; Em humanos THP-1 macrófagos

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Medula Óssea derivadas de macrófagos Produção

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Estudo da fagolisossomo Biogenesis em macrófagos ao vivo

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Utilização de<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Para estudar interações Autophagy-Cytoskeleton

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Isolamento e injecção intravenosa de Murino de Medula Óssea Derivado monócitos

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Caracterização metabólica de Polarizada M1 e M2 macrófagos da medula óssea derivadas usando análises em tempo real do fluxo extracelular

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or ...