Name: isolation and in vitro culture of bone marrow-derived macrophages for the study of no-redox biology
Uploaded: 2022-05-31T12:30:00
Duration: 6 min 34 s
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Este trabajo fue apoyado por la Beca Intermedia de la Fundación Británica del Corazón otorgada a M.J.C. (FS/14/56/31049), subvenciones del Programa de la Fundación Británica del Corazón (RG/17/10/32859 y RG/12/5/29576), Wellcome Trust (090532/Z/09/Z) y el Centro de Investigación Biomédica de Oxford de los NIH Research (NIHR). Los autores también desean agradecer el apoyo del BHF Centre of Research Excellence, Oxford (RE/13/1/30181 y RE/18/3/34214)

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados y llevados a cabo de acuerdo con el comité ético de la Universidad de Oxford y la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) del Ministerio del Interior del Reino Unido de 1986. Todos los procedimientos se ajustaron a la Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo.
1. Aislamiento de células de la médula ósea
<ol><li>Sacrifice ratones de tipo salvaje (C57BL / 6) o deficientes en Gch1 (R26-CreERT2Gchfl / fl) (10-16 semanas de edad) por dislocación cervical y recoja las extremidades posteriores. NOTA: No se hace preferencia por ninguno de los sexos. Las hembras de edad igualada serán ligeramente más pequeñas que sus contrapartes masculinas, lo que afectará el rendimiento inicial del material de partida.<ol>
<li>Rocíe a los ratones con etanol al 70% para reducir el riesgo de contaminación.</li>
		<li>Haga un pequeño corte en el abdomen con tijeras de disección para eliminar el pelaje y la piel del cuerpo. Pelar la piel para exponer el músculo en las extremidades posteriores.</li>
		<li>Coloque el ratón sobre su abdomen y disloque las extremidades posteriores levantándolo de la articulación de la rodilla y ejerciendo presión sobre las caderas. La dislocación se puede sentir en la articulación de la cadera.</li>
		<li>Retire las patas traseras cortando cuidadosamente el músculo de la cadera, asegurándose de que no se produzca ningún daño en el fémur.</li>
		<li>Corte por encima de la articulación del tobillo, retire el pie y limpie la piel restante de la pierna.</li>
		<li>Coloque las patas disecadas en un tubo de 50 ml con 25 ml de PBS helado (no se requiere antibiótico) y colóquelo sobre hielo. NOTA: Se pueden diseccionar varios animales y mantener las patas en hielo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>En condiciones estériles en una capucha de cultivo de tejidos, retire los músculos de las piernas y retire los extremos de los huesos para exponer la médula ósea.<ol>
<li>Coloque las patas en etanol al 70% durante 2 minutos para reducir la contaminación y lavar cualquier piel o residuo.</li>
		<li>Transfiera las piernas a una placa de Petri limpia, estéril y bacteriológica. Use fórceps y un bisturí para raspar firme y cuidadosamente los huesos con el lado de la cuchilla para eliminar los músculos. Corte los tendones para facilitar el proceso.</li>
		<li>Extirpar la epífisis en la extremidad de cada hueso para exponer la médula ósea. El fémur se corta en cada extremo, justo por debajo de las articulaciones respectivas.</li>
		<li>La tibia se corta en la parte superior, justo por debajo de la articulación de la rodilla, y en la parte inferior, justo por encima del punto de intersección con el peroné.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enjuague la médula ósea de los huesos con PBS y recójala en un tubo estéril de 50 ml.<ol>
<li>Llene una jeringa de 10 ml con 10 ml de PBS y conéctela a una aguja de 25 G x 0,5 x 16 mm. Esto es suficiente para eliminar todos los huesos de un ratón.</li>
		<li>Inserte la aguja en la cavidad medular del hueso y enjuague suavemente la médula ósea con 1-2 ml de PBS, pasando la aguja hacia arriba y hacia abajo a través del hueso para asegurarse de que toda la médula ósea se desaloje.</li>
		<li>Repita para todos los huesos, recogiendo la médula ósea enrojecida en una placa de Petri limpia.</li>
		<li>Usando una jeringa estéril de 1 ml, desagregue la médula ósea extrayendo la suspensión dentro y fuera de la jeringa 5-10 veces hasta que se rompan los bultos.</li>
		<li>Recoja la médula ósea desagregada en la jeringa de 1 ml y pásela a través de un colador de células de 70 μM en un tubo de centrífuga limpio de 50 ml. Coloque la médula ósea recolectada en hielo mientras se recolectan más muestras. NOTA: Consulte el esquema de protocolo en la Figura 1 - Parte 1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Selección, diferenciación y estimulación de los BMDM
<ol><li>Para congelar la médula ósea para su uso posterior, ginetear la médula ósea por centrifugación a 1000 x g durante 5 min y resuspend en 2 mL de FBS de baja endotoxina que contenga 5% de dimetilsulfóxido (DMSO).<ol>
<li>Centrifugar la suspensión de médula ósea a 1000 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT). Se formará un gránulo rojo sangre.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante.</li>
		<li>Resusped suavemente el pellet en 2 ml de FBS de baja endotoxina que contiene 5% de DMSO y congelar a -80 °C durante la noche antes de transferirlo a nitrógeno líquido en fase de vapor para su almacenamiento a largo plazo.</li>
	</ol></li>
	<li>Para usar la médula ósea inmediatamente, lisar los glóbulos rojos antes de enchapar la médula ósea.<ol>
<li>Centrifugar la suspensión de médula ósea a 1000 x g durante 5 min a RT. Se formará un gránulo rojo sangre.</li>
		<li>Resuspend el pellet en 3 ml de 1x tampón de lisis de glóbulos rojos e incubar en RT durante 5 min.</li>
		<li>Agregue 10 ml de PBS y centrífuga a 1000 x g durante 5 minutos en RT. Deseche el sobrenadante.</li>
		<li>Coloque las celdas para su uso inmediato continuando con el paso 2.3.5.</li>
	</ol></li>
	<li>Descongelar los macrófagos y resuspendir en 3 ml de medios de recubrimiento antes de peletizar las células.<ol>
<li>Prepare DMEM: F12 que contiene 5% de FBS de endotoxina baja, 1x penicilina / estreptomicina, L-glutamina y 25 ng / ml M-CSF. NOTA: M-CSF y GM-CSF se pueden preparar resuspiendo proteína seca en agua estéril que contiene 0.1% de BSA estéril, y las alícuotas se pueden congelar a -80 ° C para su uso posterior.</li>
		<li>Descongelar la suspensión celular congelada rápidamente a 37 °C.</li>
		<li>Transfiera la suspensión celular (0,5 ml) a un tubo limpio y estéril que contenga 3 ml del medio PREPARADO DMEM: F12.</li>
		<li>Granular las células por centrifugación a 1000 x g durante 5 min en RT. Desechar el sobrenadante.</li>
		<li>Resuspend el pellet en 3 mL del medio preparado DMEM: F12.</li>
		<li>Cuente las celdas por un método preferido.</li>
	</ol></li>
	<li>Día 0: Placa las células.<ol>
<li>Placa las células en artículos de plástico no recubiertos de TC en DMEM: medios F12 que contienen 5% de FBS de endotoxina baja, 1x penicilina / estreptomicina, L-glutamina y 25 ng / ml M-CSF. NOTA: Las densidades de siembra representativas se describen en la Tabla 1. Un par completo de patas de un ratón proporciona 15-20 millones de células precursoras.</li>
		<li>Incubar las células a 37 °C con un 5% de CO2.</li>
	</ol></li>
	<li>Día 5: Alimentar las células.<ol>
<li>Alimente las células agregando el 50% del volumen original de DMEM: medios F12 que contienen 5% de FBS de endotoxina baja, 1x penicilina / estreptomicina, L-glutamina y 50 ng / ml M-CSF.</li>
	</ol></li>
	<li>Día 6: Estimular las células con GM-CSF.<ol>
<li>Añadir GM-CSF preparado a una concentración final de 50 ng/mL directamente al medio de cultivo celular de las células.</li>
	</ol></li>
	<li>Reemplace el medio con DMEM preparado: F12.<ol>
<li>Retire todos los medios de las celdas.</li>
		<li>Lave las células brevemente en PBS precalentado.</li>
		<li>Añadir DMEM: Medio F12 que contiene 2% de FBS de endotoxina baja, 1x penicilina/estreptomicina, L-glutamina, 25 ng/mL M-CSF y 50 ng/mL GM-CSF.</li>
		<li>Activar los macrófagos a los fenotipos M0, M1 o M2 con las estimulaciones descritas en los pasos 2.7.5-2.7.7.</li>
		<li>M0 - No se requiere estimulación. Incubar las células durante la noche en los medios.</li>
		<li>M1 - Estimular las células con 100 ng/mL LPS y 10 ng/mL IFNγ (concentraciones finales) durante la noche.</li>
		<li>M2 - Estimular las células con 100 ng/mL IL-4 (concentración final) durante la noche.</li>
	</ol></li>
	<li>Día 8: Cosecha las células.<ol>
<li>Retire los medios de las células (recoja los medios y congele a -80 °C para los ensayos posteriores).</li>
		<li>Incubar las células en PBS helado (50% del volumen de medios) durante 5 min.</li>
		<li>Separe las células de la placa con raspado suave o pipeteo repetido.</li>
		<li>Granular las células por centrifugación a 2500 x g durante 5 min en RT. Desechar el sobrenadante.</li>
		<li>Congele los gránulos celulares a -80 °C para su uso posterior. NOTA: Consulte el esquema de protocolo Figura 1 - Parte 2.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Zajd, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+and+elicited+peritoneal+macrophages+are+not+created+equal:+The+questions+asked+dictate+the+cell+type+used.">Bone marrow-derived and elicited peritoneal macrophages are not created equal: The questions asked dictate the cell type used.</a> Frontiers in Immunology. 11, 269 (2020).</li><li>Murray, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization:+nomenclature+and+experimental+guidelines.">Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines.</a> Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).</li><li>Zhao, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+characteristics+of+macrophages+derived+from+murine+spleen,+peritoneal+cavity,+and+bone+marrow.">Comparison of the characteristics of macrophages derived from murine spleen, peritoneal cavity, and bone marrow.</a> Journal of Zheijang University Science B. 18 (12), 1055-1063 (2017).</li><li>Nasser, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+bone+marrow-derived+M-CSF+receptor-dependent+self-renewing+macrophages.">Establishment of bone marrow-derived M-CSF receptor-dependent self-renewing macrophages.</a> Cell Death Discovery. 6, 63 (2020).</li><li>Stanley, E. R., Heard, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+regulating+macrophage+production+and+growth.+Purification+and+some+properties+of+the+colony+stimulating+factor+from+medium+conditioned+by+mouse+L+cells.">Factors regulating macrophage production and growth. Purification and some properties of the colony stimulating factor from medium conditioned by mouse L cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 252 (12), 4305-4312 (1977).</li><li>Bailey, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+murine+bone+marrow-derived+macrophages+for+nitric+oxide+and+redox+biology.">Isolation and culture of murine bone marrow-derived macrophages for nitric oxide and redox biology.</a> Nitric Oxide. 100-101, 17-29 (2020).</li><li>Shiva, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrite:+A+physiological+store+of+nitric+oxide+and+modulator+of+mitochondrial+function.">Nitrite: A physiological store of nitric oxide and modulator of mitochondrial function.</a> Redox Biology. 1 (1), 40-44 (2013).</li><li>McNeill, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+iNOS+function+and+cellular+redox+state+by+macrophage+Gch1+reveals+specific+requirements+for+tetrahydrobiopterin+in+NRF2+activation.">Regulation of iNOS function and cellular redox state by macrophage Gch1 reveals specific requirements for tetrahydrobiopterin in NRF2 activation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 79, 206-216 (2015).</li><li>McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+macrophage+phenotype+by+cell+shape.">Modulation of macrophage phenotype by cell shape.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (43), 17253-17258 (2013).</li><li>Bailey, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+modulates+metabolic+remodeling+in+inflammatory+macrophages+through+TCA+cycle+regulation+and+itaconate+accumulation.">Nitric oxide modulates metabolic remodeling in inflammatory macrophages through TCA cycle regulation and itaconate accumulation.</a> Cell Reports. 28 (1), 218-230 (2019).</li><li>Hamilton, T. A., Zhao, C., Pavicic, P. G., Datta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+colony-stimulating+factors+as+regulators+of+macrophage+polarization.">Myeloid colony-stimulating factors as regulators of macrophage polarization.</a> Frontiers in Immunology. 5, 554 (2014).</li><li>Na, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF+induces+inflammatory+macrophages+by+regulating+glycolysis+and+lipid+metabolism.">GM-CSF induces inflammatory macrophages by regulating glycolysis and lipid metabolism.</a> Journal of Immunology. 197 (10), 4101-4109 (2016).</li><li>Sorgi, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF+priming+drives+bone+marrow-derived+macrophages+to+a+pro-inflammatory+pattern+and+downmodulates+PGE2+in+response+to+TLR2+ligands.">GM-CSF priming drives bone marrow-derived macrophages to a pro-inflammatory pattern and downmodulates PGE2 in response to TLR2 ligands.</a> PLoS One. 7 (7), 40523 (2012).</li></ol>

Los autores no declaran intereses contrapuestos.

Este protocolo de cultivo de BMDM deficiente en BH4 y NO ha sido diseñado para investigar la biología de NO-redox en macrófagos primarios a través de la reducción de tetrahidrobiopterina (BH4) y otros artefactos interferentes con el objetivo de mejorar la fiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos de estos modelos experimentales. 
Los pasos críticos incluyen el uso de la vajilla de plástico correcta. Los progenitores de macrófagos son células adherentes y muy pegajosas; por lo tanto, el uso de placas tratadas sin cultivo de tejidos (CT) es crucial para seleccionarlas y aislarlas de otras células progenitoras, que de otro modo podrían adherirse y reducir la pureza. El día de la cosecha, separar los macrófagos de las placas requiere PBS helado, pero el uso de EDTA o incluso raspar las células muy suavemente se puede realizar dependiendo de la aplicación aguas abajo (experimento de células lisadas versus células vivas, por ejemplo). También se debe tener especial cuidado con respecto a la contaminación. Al eliminar la médula ósea, puede ocurrir una posible contaminación cruzada con bacterias o partículas virales de la piel y la piel sobrantes. Entonces es esencial ser lo más cuidadoso y estéril posible; por lo tanto, se recomienda sumergir las piernas disecadas en etanol al 70% durante unos minutos. Del mismo modo, el uso de antibióticos durante el cultivo de macrófagos es muy recomendable.
Otra limitación de este protocolo surge de la densidad de recubrimiento celular en el Día 0. La médula ósea enrojecida contiene una variedad de células, que pueden contarse erróneamente e incluirse como progenitores de macrófagos, lo que lleva a un número total de células falso. Para evitar la variabilidad posterior y potencial, los macrófagos aislados se pueden enjuagar suavemente usando PBS caliente en el Día 7 y volver a chapar a la densidad correcta en 2% FBS DMEM: F12 al menos 1 h antes de la estimulación para permitir la adherencia. 
Finalmente, la verificación de los niveles de nitrito mediante el ensayo de Griess utilizando medios de macrófagos cultivados es imperativo para analizar los datos. En el lado positivo, este ensayo es rápido y económico de realizar.
Como se demuestra en este documento, este protocolo personalizado es una alternativa más definida y mejorada al protocolo más común utilizado para aislar y cultivar macrófagos utilizando medios condicionados por células L (LCM). De hecho, una de las principales preocupaciones al usar LCM al estudiar la biología del NO-redox son sus cantidades significativas de biopterinas detectadas, lo que lleva a posibles cambios metabólicos10. Por ejemplo, el BH4 exógeno puede reponer rápidamente los modelos deficientes y actuar como un cofactor para iNOS, lo que lleva a la producción no deseada de óxido nítrico. Otra desventaja de usar LCM radica en su producción: LCM es una mezcla de factores estimulantes de colonias, citoquinas y otros subproductos secretados directamente por las células L-929, que pueden afectar la fisiología de los macrófagos6. A pesar de su gran suministro en M-CSF, esencial para la proliferación y supervivencia de macrófagos, la variación de cada componente de un lote a otro aumenta el riesgo de variabilidad entre experimentos. 
Para abordar ambos problemas, este nuevo protocolo utiliza el bien definido DMEM: medios F12 que contienen bajos niveles de biopterinas a los que se agrega una cantidad controlada de M-CSF y GM-CSF purificados. Ambas citoquinas ayudan en la diferenciación y el crecimiento de los macrófagos. El M-CSF conduce especialmente a la generación de DMO a partir de células progenitoras de la médula ósea al asegurar la diferenciación de las células madre hematopoyéticas en macrófagos11. Además, se ha demostrado que el GM-CSF aumenta la producción de citoquinas inflamatorias y NO cuando se agrega antes de la estimulación, un beneficio real cuando se estudia la biología no-redox12,13.
El otro factor principal que aborda este nuevo método es el de FBS, generalmente utilizado como fuente de nutrientes esenciales para la buena salud y el crecimiento de las células. Similar a LCM, FBS contiene niveles significativos de biopterina. Mientras que la inanición sérica completa de las células antes de la estimulación se consideró inicialmente utilizando OptiMEM + 0,2% BSA, los macrófagos mostraron signos de desprendimiento, indicativos de disminución de la viabilidad celular según lo descrito por Bailey et al.6. Sin embargo, como los macrófagos demostraron un requerimiento absoluto de suero, se seleccionó la Endotoxina Ultra Baja FBS de BioWest. Los lotes se probaron para detectar biopterinas y se preseleccionaron antes de la compra a granel para garantizar un suministro confiable y bien definido. Para ir más allá en el objetivo de reducir las fuentes contaminantes de biopterinas, se probó la disminución de las concentraciones de FBS. En lugar de usar suero al 10% como se usa comúnmente en el cultivo celular, el nivel de FBS se mantiene al 5% a lo largo de la diferenciación de 7 días de la médula ósea en macrófagos y se reduce aún más al 2% durante la estimulación nocturna en el último día. Esto asegura niveles insignificantes de biopterinas detectadas pero suficientes nutrientes para la buena salud y adherencia de los macrófagos. Aunque este protocolo recientemente optimizado utilizando M-CSF recombinante da como resultado un entorno más controlado para el cultivo y la activación de macrófagos primarios, la principal limitación es que este método es más costoso que el uso del método LCM.
Teniendo en cuenta todos estos factores, los dos métodos se compararon directamente. Es importante destacar que el protocolo recientemente modificado presentado aquí utilizando M-CSF recombinante y GM-CSF dio como resultado un sistema más reproducible donde el medio estaba desprovisto de BH4 contaminante. Los efectos de esto fueron dobles; Las células deficientes en BH4 realmente carecían de BH4, lo que resultó en una acumulación mínima detectable de nitrito en los medios después de la estimulación al estado M1 con LPS. Esto contrastó con las mismas células BMDM cultivadas en LCM, donde se detectaron BH4 y nitrito significativos. 
Para concluir, la fuerza de este método radica en el esfuerzo de controlar los niveles de biopterinas mediante la evaluación exhaustiva de cada parámetro que podría afectar la señalización de NO y redox en macrófagos. En particular, esto garantiza la máxima reproducibilidad y estandarización en el campo de la biología NO-redox.

Los macrófagos se han establecido como un tipo de célula interesante en una amplia variedad de enfermedades y afecciones, muchas aparentemente no relacionadas con su enfoque tradicional en la inmunidad innata. Como la fisiología de los macrófagos depende en gran medida del tejido o el entorno en el que residen, han surgido muchos métodos y modelos para estudiar su función y las diversas vías involucradas. Históricamente, las líneas celulares de macrófagos, como RAW264.7, dominaron el campo, pero estas han sido reemplazadas gradualmente en favor de varios modelos de células primarias. Por ejemplo, los macrófagos murinos pueden aislarse del lavado peritoneal después del tratamiento con tioglicolato. Si bien proporcionan un modelo útil para el estudio de las células residentes en el tejido, se ha demostrado que estos macrófagos peritoneales demuestran una respuesta más tenue a diversos estímulos externos, lo que limita su idoneidad para muchas aplicaciones posteriores1.
Como alternativa, los macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM), derivados de células progenitoras mieloides en la médula ósea, han surgido como un modelo valioso para estudiar diversos aspectos de la biología de los macrófagos, incluida la maduración y los diversos fenotipos clásicos asociados con los macrófagos, M0 (ingenuo, no activado), M1 (proinflamatorio, generalmente activado con LPS / IFN) y M2 (pro-resolución, generalmente activado con IL-4)2, 3. Sin embargo, la diferenciación de células progenitoras mieloides en DMO depende de la presencia de factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) en el medio de cultivo 4,5. Esto puede suministrarse en forma de proteína purificada añadida al medio o a partir de medios acondicionados L929 (LCM). Las ventajas del uso de BMDM (costo y eficiencia) deben sopesarse frente a las limitaciones que presenta su sensibilidad a diversos estímulos (citoquinas, intermedios metabólicos y RNS / ROS).
Los datos anteriores indican que los contenidos de LCM están mal definidos e intrínsecamente variables, lo que resulta en que no sean confiables e inadecuados para una variedad de aplicaciones posteriores, especialmente aquellas específicamente relacionadas con la biología no o redox, ya que pueden estar fuertemente influenciadas por la presencia de compuestos exógenos6. Como tal, este protocolo detallado requiere el uso de DMEM bien definido: medios F12 con baja variación de lote a lote y la adición de M-CSF murino recombinante y GM-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos). Además, el suero fetal bovino típicamente utilizado como suplemento en medios de cultivo de tejidos proporciona otra fuente de compuestos mal definidos y variabilidad inherente. Por lo tanto, es necesario controlar y optimizar el uso de dichos aditivos para garantizar el cultivo confiable de los BMDM. Mediante el uso de una fuente definida de FBS con bajo contenido de endotoxinas y asegurando que los lotes individuales se compren a granel, las condiciones de cultivo se definen de manera confiable y se garantiza la reproducibilidad. Se ha demostrado que el protocolo descrito en este documento produce un cultivo de macrófagos por encima del 95% de pureza cuando se evalúa para los marcadores de superficie de macrófagos CD45 y CD11b mediante citometría de flujo6.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS+01T1</td>
			<td>1mL 6% LUER syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL plastic syringe</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14955453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate sterile non-treated</td>
			<td>CytoOne</td>
			<td>CC7672-7506</td>
			<td>Flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 (1:1) (1x)</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>21331-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO sterile</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy flask 260 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine Solution 200 mM</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>G7513-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>L4391-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutlidish 12 sterile non-treated</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150200</td>
			<td>Flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 25G, 0.5 x 16 mm</td>
			<td>BD Microlance 3</td>
			<td>300600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH7.4, 1x)</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>10010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P0781-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dish 100 x15 mm sterile</td>
			<td>Falcon, Corning incorporated</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine GM-CSF</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>315-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine IFN-&#947;</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>315-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine M-CSF</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel n23</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low endotoxin FBS</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1860-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR cell strainers 70 &#181;m nylon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-2758</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and in vitro culture of bone marrow-derived macrophages for the study of no-redox biology

Los macrófagos se derivan de células progenitoras hematopoyéticas en todo el cuerpo, son fundamentales para los procesos inflamatorios y participan en respuestas inmunes innatas y adaptativas. El estudio in vitro de macrófagos se puede llevar a cabo mediante cultivo ex vivo desde el peritoneo o mediante la diferenciación de células progenitoras mieloides de la médula ósea para formar macrófagos derivados de la médula ósea (DMO). Un enfoque común para la diferenciación de macrófagos de precursores implica el uso de medios condicionados de células L929 (LCM). Este medio es fácil de autoproducir, pero sufre de variabilidad de lotes, y sus componentes son indefinidos. Del mismo modo, el suero bovino fetal (FBS) se utiliza para apoyar el crecimiento, pero contiene una gran mezcla de moléculas indefinidas que pueden variar entre lotes. Estos métodos no son adecuados para el estudio de la biología del óxido nítrico y los mecanismos redox, ya que ambos contienen cantidades sustanciales de moléculas pequeñas que interfieren con los mecanismos redox o complementan los niveles de cofactores, como la tetrahidrobiopterina (BH4), necesarios para la producción de NO a partir de óxido nítrico sintasa inducible (iNOS). En este informe, presentamos un protocolo optimizado que permite el control del entorno NO-redox mediante la reducción de los niveles de biopterina exógena al tiempo que mantiene las condiciones adecuadas para el crecimiento y la diferenciación celular. El control estricto de la composición de los medios de cultivo ayuda a garantizar la reproducibilidad experimental y facilita la interpretación precisa de los resultados. En este protocolo, los BMDM se obtuvieron a partir de un modelo de ratón deficiente en GTP ciclohidrolasa (GCH). El cultivo de BMDMs se realizó con medios que contenían (i) LCM condicionada, o (ii) M-CSF y GM-CSF recombinantes para producir artefactos mínimos mientras se obtenían condiciones de cultivo deficientes en BH4 y NO, lo que permite el estudio reproducible de la biología e inmunometabolismo de NO-redox in vitro.

Antes de demostrar la eficacia de este protocolo en macrófagos, se evaluaron los niveles de nitrito y BH4 en medios suplementados con un 10% de FBS que contenía un 10% de LCM o solo M-CSF y GM-CSF recombinantes. El nitrito, aunque considerado durante mucho tiempo como un producto final del metabolismo del óxido nítrico, ahora se considera como almacenamiento fisiológico del óxido nítrico, que puede reciclarse cuando sea necesario y, por lo tanto, a menudo se usa como un indicador de la biodisponibilidad del óxido nítrico7. BH4 es un cofactor esencial de NOS para la producción de NO. Como se ve en la Figura 2, los medios suplementados con 10% de FBS tenían niveles de nitritos similares independientemente de M-CSF / GM-CSF o LCM. Sin embargo, se observó más variabilidad entre los diferentes lotes de LCM. Esta observación también se aplicó a la medición BH4. De hecho, un lote de LCM (lote # 3) tenía un nivel significativamente más alto de BH4 que los otros dos (lotes # 1 y # 2). Además, los lotes de LCM contenían significativamente más biopterina que los medios suplementados con 10% de FBS y citoquinas recombinantes. También se midió una variabilidad significativa de las biopterinas totales entre lotes. Estos resultados demuestran la importancia de utilizar una fuente menos variable de M-CSF que LCM.
Además, los medios suplementados con un 10% de FBS contenían niveles significativamente más altos de nitrito en comparación con los medios que contenían un 2% o un 5% de FBS. La diferencia entre el 10% y el 5% fue altamente significativa (p < 0,05) para BH4. Sin embargo, se cuantificaron niveles similares de biopterinas. En comparación, OptiMEM + 0.2% BSA carecía de nitrito y BH4, lo que lo convertía en un medio muy limpio y adecuado. Sin embargo, como lo describen Bailey et al., aunque OptiMEM está destinado a usarse solo una vez durante la noche cuando se estimulan macrófagos, se observó muerte celular debido a la inanición. DMEM: F12 suplementado con 2% de FBS fue elegido para superar este problema, permitiendo una contaminación mínima de nitrito y BH4 mientras contiene suficientes nutrientes para obtener células sanas. De hecho, a pesar de que se detectan algunos nitritos, los niveles son insignificantes (~ 0.2 μM) en comparación con los macrófagos WT estimulados por LPS / IFN (30-80 μM para 1 x 106 células; datos no mostrados).
Para validar este protocolo mejorado con datos experimentales, se presenta aquí el aislamiento y caracterización de BMDM a partir de un nuevo modelo de ratón deficiente en BH4, el R26-CreERT2Gchfl/fl. BH4 es producido por el gen GTP ciclohidrolasa I (Gch1). Como se muestra en la Figura 3A, la deficiencia en Gch1 conduce a la pérdida de BH4 y la consiguiente desaparición de NO y posteriormente nitrito, y un aumento del anión superóxido que causa estrés oxidativo como lo demostraron previamente McNeill et al.8. Aunque este protocolo ya ha sido bien definido y utilizado para cultivar otros macrófagos deficientes en BH4 de diferentes sistemas Cre, como el modelo Gchfl/flT2C 6,8, el modelo R26-CreERT2Gchfl/fl es único, ya que utiliza la activación condicional del sistema Cre-ERT2 para eliminar el gen Gch1 después del tratamiento con tamoxifeno (Figura 3B, C). Esto permite el knockout en varios puntos de tiempo y el uso de control interno en forma de vehículo vs. tratamiento de tamoxifeno. En este ejemplo, las células se trataron con vehículo (95% de etanol) o 0.1/1.0 μM de tamoxifeno 4-OH en los días 1 y 3 (tanto el vehículo como el stock de tamoxifeno se diluyeron 1:100 en medios antes de 0.7/7.0 μL agregados a 1 ml del volumen de cultivo existente).
Como se ve en la Figura 3D, la proteína GTPCH se abole después del tratamiento con tamoxifeno en las célulasR26-CreER T2Gchfl/fl, pero no en la Gchfl/fl. Es importante destacar que tanto las células de control R26-CreERT2Gchfl/fl como Gchfl/fl siguen siendo capaces de producir iNOS después de la estimulación LPS/IFN (Figura 3B,C). Estos cambios en la expresión del gen Gch1 y la alteración resultante en la proteína GTPCH condujeron a niveles intracelulares de BH4 significativamente perturbados y a una producción atenuada de nitrito. Como se muestra en la Figura 4, los BMDM aislados y cultivados de ratones R26-CreERT2Gchfl/fl exhibieron una disminución significativa de la producción de BH4 y una disminución de la acumulación de nitritos en los medios, en comparación con los de las células GCHfl/fl de control en presencia de tamoxifeno. Del mismo modo, las mismas células cultivadas en medios LCM también mostraron una expresión abolida de Gch1; aunque estas células todavía producían cantidades significativas de BH4 y nitrito después de la eliminación de la expresión de Gch1 con tamoxifeno 4 OH, posiblemente debido a la contaminación de los medios y FBS con BH4. Esto representa una clara mejora del nuevo método, sobre el cultivo de las células en medios que contienen células L.
La caracterización adicional de este modelo no demuestra diferencias significativas en la morfología entre los Gchfl/fl no activados (M0) y los DDM R26-CreERT2Gchfl/fl en el día 8 después de diferentes concentraciones de tamoxifeno. Como se muestra en la Figura 5, ambos modelos muestran una cantidad similar de células adherentes hechas de una forma redonda con extremidades alargadas, típicamente las características esperadas de los macrófagos no estimulados9.
Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que este método de aislamiento y cultivo de BMDM proporciona una población pura de células adecuadas para el cultivo de macrófagos murinos. Este método permite el cultivo de macrófagos murinos sin la interferencia de compuestos exógenos presentes en algunas formulaciones de medios.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62834/62834fig01.jpg"> Figura 1: Diagrama esquemático que ilustra el aislamiento de las células de la médula ósea (Parte 1) para la selección, diferenciación y estimulación de los BMDM (Parte 2). (A) En condiciones estériles, las piernas disecadas se colocan en una placa de Petri bacteriológica limpia después de ser lavadas en etanol al 70%. (B) Los músculos se extraen cuidadosamente usando fórceps y raspado con bisturí a lo largo de los huesos. (C) Las extremidades de los huesos se cortan para exponer la médula ósea. (D) La médula ósea se elimina de los huesos utilizando una jeringa de 10 ml llena de 10 ml de PBS insertando la aguja en la luz del hueso. (E) La aguja se pasa hacia arriba y hacia abajo a través del hueso para garantizar que toda la médula ósea se desaloje. El hueso debe aparecer blanco y claro en esa etapa con la médula ósea desalojada recogida en la placa de Petri. (F-G) Repita para todos los huesos, recogiendo la médula ósea desagregada en la jeringa de 1 ml, y pásela a través de un colador de células de 70 μm en un tubo de centrífuga limpio de 50 ml. Girar hacia abajo y resuspendir las células en medios de congelación para su uso posterior. La Parte 2 muestra la selección, diferenciación y estimulación de los BMDM <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62834/62834fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62834/62834fig02.jpg"> Figura 2: Niveles de nitrito y BH4 en DMEM: F12 + GM-CSF + M-CSF o DMEM: F12+ medios de células L. (A) Los niveles de nitrito en diferentes medios se midieron utilizando el método de ensayo de Griess. (B) Los niveles de BH4 y biopterinas se midieron en diferentes medios mediante la cuantificación de HPLC utilizando un estándar BH4. Los datos se expresan como la media (n = 3) ± SD. Los datos se analizaron utilizando ANOVA unidireccional mediante comparaciones múltiples. Los símbolos representan p < 0,05 entre grupos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62834/62834fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62834/62834fig03.jpg"> Figura 3: Introducción del modelo R26CreERT2. (A) Esquema que ilustra el papel de BH4 como cofactor NOS en la biología redox. (B) Esquema que detalla la escisión de los exones críticos (2 y 3) en Gch1 debido a los sitios loxP flanqueantes y la activación condicional de Cre-ERT2 con tamoxifeno en este modelo murino. (C) PCR (representativa de n = 3 animales independientes) que demuestre la escisión del exón crítico cuando los BMDM se tratan con tamoxifeno. Los ratones WT producen un producto de PCR de 1030 pb, mientras que en presencia del Cre, se produce un producto de 1392 pb, lo que confirma la escisión de los exones críticos. (D) Immunoblot de iNOS, GCH y B-tubulina (representante de n = 3 animales independientes). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62834/62834fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62834/62834fig04.jpg"> Figura 4: Caracterización de la deficiencia de BH4 en macrófagos. (A,B) qRT-PCR confirma la pérdida de expresión de Gch1 en el modelo R26-CreERT2Gchfl/fl tratado con tamoxifeno. Azul = Nuevo método MCSF, Verde = método LCM clásico. (C,D) El análisis de BH4 intracelular por HPLC revela que 0,1 μM y 1,0 μM son suficientes para disminuir significativamente los niveles de BH4. (E, F) La medición del nitrito en medios utilizando el ensayo de Griess muestra que los BMDM no estimulados no producen niveles detectables de nitrito, mientras que los DDM Gchfl/fl yR26-CreER T2Gchfl/fl producen nitrito en presencia de LPS/IFNγ. Significativamente, el tratamiento con tamoxifeno de R26-CreERT2Gchfl/fl reduce significativamente los niveles de nitrito en los BMDM estimulados. Los datos se expresan como la media de (n = 3) ± SD. Los datos se analizaron utilizando ANOVA unidireccional mediante comparaciones múltiples. Los símbolos representan p < 0,05 entre grupos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62834/62834fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62834/62834fig05.jpg"> Figura 5: Comparación de la morfología de los BMDM. Fotos obtenidas por microscopía óptica de BMDM en el día 8 con el tratamiento variable de tamoxifeno. La escala se indica en la imagen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62834/62834fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Plato de cultura</td>
			<td>Volumen de medios</td>
			<td>Densidad de siembra</td>
		</tr>
<tr>
<td>Plato de 12 pozos</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>500.000 celdas</td>
		</tr>
<tr>
<td>Plato de 6 pozos</td>
			<td>2 ml</td>
			<td>1.000.000 de células</td>
		</tr>
<tr>
<td>Plato de 100 mm</td>
			<td>10 ml</td>
			<td>3.000.000 de células</td>
		</tr>
<tr>
<td>75 cm2 matraz</td>
			<td>15 ml</td>
			<td>5.000.000 de células</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Densidades de siembra representativas.

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Isolation and In vitro Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages for the Study of NO-Redox Biology

Este protocolo se ha establecido para cultivar macrófagos murinos primarios deficientes en tetrahidrobiopterina (BH4) y óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) para estudiar la biología del NO-redox. El estudio se centra en reducir la contaminación potencial de BH4 y otros artefactos encontrados en los métodos tradicionales de aislamiento y cultivo que pueden confundir los resultados experimentales y la interpretación de los resultados.

Aislamiento y cultivo in vitro de macrófagos derivados de la médula ósea para el estudio de la biología NO-redox

Macrophages are derived from hematopoietic progenitor cells throughout the body, are central to inflammatory processes, and participate in innate and ...

Este protocolo ayuda a cultivar macrófagos derivados de la médula ósea de ratones deficientes en iNOS o BH4 utilizando medios y sueros cuidadosamente definidos con bajos niveles de BH4 y nitrato para evitar interferencias con los mecanismos redox. Al controlar cuidadosamente los niveles de contaminantes potenciales en el proceso de cultivo, podemos limitar la interferencia de óxido nítrico, asegurando la precisión y reproducibilidad del sistema modelo. Este método permite mediciones precisas de biopterinas, óxido nítrico y cualquier factor posterior relacionado con estos compuestos esenciales.Demostrando el procedimiento estará el Dr. Thomas Nichol, un investigador postdoctoral de nuestro laboratorio. Para comenzar, coloque las patas en etanol al 70% durante dos minutos para lavar cualquier pelaje o residuo. Luego, transfiera las piernas a una placa de Petri bacteriológica limpia y estéril.Raspe cuidadosamente a lo largo de la longitud de los huesos con la cuchilla, cortando los tendones y eliminando el músculo del hueso. Una vez que los huesos han sido eliminados del músculo, corte a través de la epífisis en la parte superior de la tibia, justo debajo de la rodilla. La tibia se puede cortar en el extremo inferior, justo por encima de la intersección con el peroné.Finalmente, corte a través de la epífisis en cada extremo del fémur, justo antes de las articulaciones de la rodilla y la cadera. Para enjuagar la médula ósea, llene una jeringa de 10 mililitros con 10 mililitros de PBS y conéctela a una aguja. Luego inserte la aguja en la cavidad medular del hueso.Enjuague suavemente con uno o dos mililitros de PBS, pasando la aguja hacia arriba y hacia abajo. Luego, extraiga la suspensión de cinco a diez veces dentro y fuera de una jeringa de un mililitro para desagregar. Recoja la suspensión en una jeringa de un mililitro y pásela a través de un colador de células de 70 micrómetros en un tubo de centrífuga limpio de 50 mililitros.Finalmente, coloque las muestras sobre hielo. Para congelar la médula ósea para su uso posterior, centrífuga las células a 1000 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet rojo en dos mililitros de anticongelante.Luego, incubarlo a 80 grados centígrados durante la noche. Si se congela, descongele la suspensión rápidamente a 37 grados centígrados. Transfiera la suspensión celular a un tubo estéril limpio que contenga tres mililitros de medios DMEM/F-12.A continuación, peletizar las células por centrifugación. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en tres mililitros del medio DMEM/F-12 preparado. Cuente las células y enchapándolas en artículos de plástico no recubiertos de TC en el medio preparado DMEM / F-12.A continuación, incuba las células a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. En el quinto día, alimente las células agregando el 50% del volumen original de medios DMEM / F-12. En el sexto día, estimule las células agregando GM-CSF preparado a una concentración final de 50 nanogramos por microlitro directamente al medio de cultivo celular.En el séptimo día, retire todos los medios de las células. Luego, lave las células brevemente con PBS precalentado y agregue medios DMEM / F-12 que contengan 2% de endotoxina baja FBS, 1X penicilina o estreptomicina, L-glutamina, 25 nanogramos por microlitro M-CSF y 50 nanogramos por microlitro GM-CSF. Finalmente, incubar las células durante la noche en medios para activar los macrófagos al fenotipo M0.Para el fenotipo M1, estimular las células con 100 nanogramos por microlitro LPS, y 10 nanogramos por microlitro IFN-gamma. Para el fenotipo M2, estimular las células con 100 nanogramos por microlitro IL-4. Incubar las células durante la noche.En el octavo día, las células están listas para la cosecha o el procesamiento posterior de acuerdo con las necesidades del investigador. Los medios suplementados con 10% fbS tenían nitrito y tetrahidrobiopterina similares, independientemente de M-CSF y GM-CSF, o LCM. Pero los niveles totales de biopterina fueron más altos en los medios suplementados con LCM.Sin embargo, se observó más variabilidad entre los diferentes lotes de LCM. La PCR mostró un producto de par de bases 1030 en ratones de tipo salvaje, mientras que los ratones knockout GCH produjeron un producto de par base 1392, confirmando la escisión de los exones críticos. El tratamiento con tamoxifeno abolió la proteína GCH en las células knockout.Las células knockout y de control todavía producían iNOS, después de la estimulación de LPS e IFN. Los BMDM cultivados a partir de ratones knockout GCH condicionales exhibieron una disminución significativa de la tetrahidrobiopterina y una disminución del nitrito. Las mismas células cultivadas en medios LCM no tenían expresión de GCH1.Sin embargo, las células producen cantidades significativas de tetrahidrobiopterina y nitrito después de la eliminación. En el octavo día, no hubo diferencias significativas en la morfología entre el control no activado y los BMDM knockout de GCH a diferentes concentraciones de tamoxifeno. Los BMDM muestran las características esperadas de los macrófagos no estimulados, con células adherentes redondas y extremidades alargadas.Cuando se trabaja con células primarias como esta, es imperativo esterilizar todos los tejidos y equipos a fondo. Además, elegir el medio y el suplemento adecuados es importante para mantener un ambiente bajo en óxido nítrico y BH4. Los gránulos y medios celulares se pueden utilizar para diversas aplicaciones posteriores, con un enfoque en el papel del óxido nítrico, la biopterina o el estado redox celular.Puede incluir HPLC, qPCR y Western blot, entre otros.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and In vitro Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages for the Study of NO-Redox Biology

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Aislamiento de linfocitos T humanos, cultura y análisis de la migración In Vitro</em

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Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

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