Name: extracellular vesicle uptake assay via confocal microscope imaging analysis
Uploaded: 2022-02-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل من قبل NCI منحة لا. U54CA143803، CA163124، CA093900، وCA143055 إلى K. J. P. وقد تم دعم هذا البحث بمنحة من مشروع البحث والتطوير في مجال التكنولوجيا الصحية الكورية من خلال المعهد الكوري لتنمية الصناعة الصحية (KHIDI)، بتمويل من وزارة الصحة والرعاية الاجتماعية، جمهورية كوريا (رقم المنحة: HI19C1122). عمل ج. كيم وY.-K. وتحظى تشو بدعم معهد العلوم الأساسية (IBS-R020-D1)، الذي تموله الحكومة الكورية. يشكر المؤلفون الأعضاء الحاليين والماضيين في معهد برادي للمسالك البولية، ولا سيما أعضاء مختبر بينتا-Amend، على القراءة النقدية للمخطوطة.

1. EV العزلة وعلى رقاقة المناعة الفلورسنت EV وضع العلامات
<ol><li>مجموعة من وسائط ثقافة الخلية (CCM) والمعالجة المسبقة ل CCM لعزل EV<ol>
<li>خلايا البذور PC3 في التقاء 30٪ في قارورة ثقافة الخلية 75 سم2 . السماح للخلايا التحكم في النمو إلى التقاء 90٪ (~ 48 ساعة) في وسائل الإعلام القياسية والمكملات الخاصة ب?...

<ol>
	<li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+Ectosomes+in+Intercellular+Communication.">Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication.</a> Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).</li><li>Sunkara, V., Woo, H. -. K., Cho, Y. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+techniques+in+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles+and+their+roles+in+cancer+diagnostics+and+prognostics.">Emerging techniques in the isolation and characterization of extracellular vesicles and their roles in cancer diagnostics and prognostics.</a> The Analyst. 141 (2), 371-381 (2016).</li><li>Kalluri, R., Lebleu, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology,+function,+and+biomedical+applications+of+exosomes.">The biology, function, and biomedical applications of exosomes.</a> Science. 367 (6478), (2020).</li><li>Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificities+of+secretion+and+uptake+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+cell-to-cell+communication.">Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).</li><li>Bonsergent, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+characterization+of+extracellular+vesicle+uptake+and+content+delivery+within+mammalian+cells.">Quantitative characterization of extracellular vesicle uptake and content delivery within mammalian cells.</a> Nature Communications. 12, 1864 (2021).</li><li>Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routes+and+mechanisms+of+extracellular+vesicle+uptake.">Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).</li><li>Dehghani, M., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+extracellular+vesicles.">Fluorescent labeling of extracellular vesicles.</a> Methods Enzymology. 645, 15-42 (2020).</li><li>Ragni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovative+Visualization+and+Quantification+of+Extracellular+Vesicles+Interaction+with+and+Incorporation+in+Target+Cells+in+3D+Microenvironments.">Innovative Visualization and Quantification of Extracellular Vesicles Interaction with and Incorporation in Target Cells in 3D Microenvironments.</a> Cells. 9 (5), 1180 (2020).</li><li>Saari, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLIM+reveals+alternative+EV-mediated+cellular+up-take+pathways+of+paclitaxel.">FLIM reveals alternative EV-mediated cellular up-take pathways of paclitaxel.</a> Journal of Controlled Release. 284, 133-143 (2018).</li><li>Franzen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Uptake+and+Internalization+of+Exosomes+by+Bladder+Cancer+Cells.">Characterization of Uptake and Internalization of Exosomes by Bladder Cancer Cells.</a> BioMed Research International. 2014, 619829 (2014).</li><li>Feng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Internalization+of+Exosomes+Occurs+Through+Phagocytosis.">Cellular Internalization of Exosomes Occurs Through Phagocytosis.</a> Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).</li><li>Hoen, E. N. M. N. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+qualitative+flow+cytometric+analysis+of+nanosized+cell-derived+membrane+vesicles.">Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).</li><li>Van Der Vlist, E. J., Nolte-'T Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry.">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).</li><li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+Exosome+Isolation+Techniques.">Progress in Exosome Isolation Techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+perspective+on+exosome+isolation+-+efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics.">and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li><li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+distinct+exosome+subpopulations:+isolation+and+characterization+approaches+and+their+associated+challenges.">Separation of distinct exosome subpopulations: isolation and characterization approaches and their associated challenges.</a> The Analyst. 146 (12), 3731-3749 (2021).</li><li>Woo, H. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exodisc+for+Rapid,+Size-Selective,+and+Efficient+Isolation+and+Analysis+of+Nanoscale+Extracellular+Vesicles+from+Biological+Samples.">Exodisc for Rapid, Size-Selective, and Efficient Isolation and Analysis of Nanoscale Extracellular Vesicles from Biological Samples.</a> ACS Nano. 11 (2), 1360-1370 (2017).</li><li>Kim, T. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAST:+Size-Selective,+Clog-Free+Isolation+of+Rare+Cancer+Cells+from+Whole+Blood+at+a+Liquid-Liquid+Interface.">FAST: Size-Selective, Clog-Free Isolation of Rare Cancer Cells from Whole Blood at a Liquid-Liquid Interface.</a> Analytical Chemistry. 89 (2), 1155-1162 (2017).</li><li>Joshi, B. S., De Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+of+Extracellular+Vesicles+and+Release+of+Their+Cargo+from+Endosomes.">Endocytosis of Extracellular Vesicles and Release of Their Cargo from Endosomes.</a> ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).</li><li>Sung, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+live+cell+reporter+of+exosome+secretion+and+uptake+reveals+pathfinding+behavior+of+migrating+cells.">A live cell reporter of exosome secretion and uptake reveals pathfinding behavior of migrating cells.</a> Nature Communications. 11, 2092 (2020).</li><li>Heusermann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+surf+on+filopodia+to+enter+cells+at+endocytic+hot+spots,+traffic+within+endosomes,+and+are+targeted+to+the+ER.">Exosomes surf on filopodia to enter cells at endocytic hot spots, traffic within endosomes, and are targeted to the ER.</a> Journal of Cell Biology. 213 (2), 173-184 (2016).</li><li>Reclusa, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+extracellular+vesicles+visualization:+From+static+to+motion.">Improving extracellular vesicles visualization: From static to motion.</a> Scientific Reports. 10, 6494 (2020).</li><li>Verweij, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Tracking+of+Inter-organ+Communication+by+Endogenous+Exosomes+In+Vivo.">Live Tracking of Inter-organ Communication by Endogenous Exosomes In Vivo.</a> Developmental Cell. 48 (4), 573-589 (2019).</li><li>Lai, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+tracking+of+tumour+extracellular+vesicle+delivery+and+RNA+translation+using+multiplexed+reporters.">Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters.</a> Nature Communications. 6, 7029 (2015).</li><li>Durak-Kozica, M., Baster, Z., Kubat, K., St&#281;pie&#324;, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+visualization+of+extracellular+vesicle+uptake+by+endothelial+cells.">3D visualization of extracellular vesicle uptake by endothelial cells.</a> Cellular &amp; Molecular Biology Letters. 23, 57 (2018).</li><li>Sunkara, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+Automated,+Label-Free+Isolation+of+Extracellular+Vesicles+from+Whole+Blood+for+Cancer+Diagnosis+and+Monitoring.">Fully Automated, Label-Free Isolation of Extracellular Vesicles from Whole Blood for Cancer Diagnosis and Monitoring.</a> Theranostics. 9 (7), 1851-1863 (2019).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+trophoblastic+small+extracellular+vesicles+and+detection+of+their+miRNA+cargo+in+P-bodies.">Internalization of trophoblastic small extracellular vesicles and detection of their miRNA cargo in P-bodies.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1812261 (2020).</li><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+evaluation+of+methods+for+small+extracellular+vesicles+separation+from+human+plasma,+urine+and+cell+culture+medium.">Comprehensive evaluation of methods for small extracellular vesicles separation from human plasma, urine and cell culture medium.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10, 12044 (2020).</li></ol>

يوفر فحص امتصاص EV استنادا إلى التصوير الفلوري ثلاثي الأبعاد عبر المجهر البؤري منهجية فعالة وتحليلا حساسا. يسهل وضع العلامات الفلورية EV هذا تصور المركبات الكهربائية ويؤدي بنجاح فحص امتصاص EV دقيق. تم الإبلاغ عن الطرق السابقة لتسمية المركبات الكهربائية وإزالة الصبغة المتبقية عن طريق إ...

الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي جزيئات ذات حجم نانوي، ومرتبطة بالغشاء الدهني يتم تصنيفها حسب أحجامها: ectosomes (100-500 نانومتر) والإكسوسومات (50-150 نانومتر)1. تحتوي المركبات الكهربائية على الجزيئات الحيوية المختلفة، مثل البروتينات والأحماض النووية والدهون. هذه الجزيئات الحيوية تنشأ من الخلايا قبل أن يتم تغليفها كشحنة والإفراج عنها في الفضاء خارج الخلية عن طريق EVs1,2,3.
نظرا لمجموعة متنوعة من حمولتها، ويعتقد أن المركبات الكهربائية تلعب دورا نشطا في الاتصالات بين الخلايا. إطلاق المركبات الكهربائية واستيعابها من قبل الخلايا تسمح بنقل الجزيئات الحيوية بين الخلايا4،5. إدخال البضائع EV إلى خلية قد يغير وظائف الخلية المتلقية وحالة الهوروستاتيكي4,5,6. يتم استيعاب المركبات الكهربائية من خلال مسارات متعددة؛ ومع ذلك، لم يتم إثبات الآليات الدقيقة بدقة.
غالبية المقايسات امتصاص EV، مثل وضع العلامات الوراثية، تسمية فلورية EVs7 الفردية. ويمكن قياس الإشارة الناتجة عن ذلك بواسطة مقياس ضوئي للصفائح الدقيقة، أو قياس التدفق الخلوي، أو المجهر، مع وجود قيود كبيرة على كل تقنية. لا يمكن أن تميز مقاييس فوتومترات الصفائح الدقيقة أو قياس التدفق الخلوي أو المجهر ثنائي الأبعاد القياسي بين EVs8,9 الداخلية والمرفقة ظاهريا. بالإضافة إلى ذلك، قد إعداد عينة اللازمة لكل من هذه التقنيات إدخال قضايا إضافية لتقييم امتصاص EV. على سبيل المثال، رفع الخلايا الملتزم بها مع تريبسين قبل تحليل امتصاص EV قد يشق بعض المركبات الكهربائية المرفقة سطحيا على سطح الخلية10،11. قد يتفاعل التريبسين أيضا مع سطح الخلية ، مما يؤثر على الخلية والنمط الظاهري EV. بالإضافة إلى ذلك، قد لا يفصل التريبسين المركبات الكهربائية السطحية تماما، مما يؤدي إلى انحراف السكان المعزولين.
لتسمية المركبات الكهربائية بدقة مع الأصباغ الفلورية، هناك حاجة إلى خطوات غسل إضافية لإزالة الصبغة المتبقية7. يمكن أن تسهم تقنيات العزل المقبولة أيضا في إشارات إيجابية خاطئة بسبب التخثر الذي يحدث أثناء عزل EV. على سبيل المثال، يستخدم الطرد الفائق المتسلسل (UC) على نطاق واسع لعزل المركبات الكهربائية وإزالة الصبغة المشلودة. ومع ذلك، قد تشارك UC في تسريع المركبات الكهربائية، وقد تؤدي الصبغة المتبقية إلى إشارة إيجابية خاطئة12,13. كما تستخدم طرق الترشيح النانوي الأخرى، مثل الترشيح القائم على العمود، على نطاق واسع لإزالة الصبغة غير المشلودة. قد تؤدي الطبيعة المعقدة للمركبات الكهربائية والصبغة التي تتفاعل داخل مصفوفة العمود إلى إزالة غير كاملة للصبغة المتبقية بسبب القطع الجزيئي للعمود الذي يتم تغييره بواسطة الإدخال المعقد14,15,16.
ويقترح البروتوكول الحالي جهازا ميكروفلويديا قائما على الترشيح النانوي لعزل وغسل المركبات الكهربائية المعزولة المسماة بالفلورسنت. يمكن لجهاز microfluidic القائم على الترشيح النانوي توفير ترشيح فعال عبر تقنية الفصل بمساعدة السوائل (FAST)17,18. يقلل FAST من انخفاض الضغط عبر الفلتر، مما يقلل من التجميع المحتمل بين المركبات الكهربائية والأصباغ. من خلال إزالة الصبغة المتبقية بكفاءة ، من الممكن تعزيز جودة المركبات الكهربائية ذات العلامات الفلورية وخصوصية المقايسة.
يمكن أن يميز المجهر البؤري بين المركبات الكهربائية الداخلية والمرفقة سطحيا على سطح الخلية والتحقيق الشامل في الآليات الخلوية لامتصاص EV في قرار ندواتي 19,20,21,22,23,24,25. على سبيل المثال، وصف سونغ وآخرون تصور دورة حياة إكسوسوم باستخدام مراسلهم المتطور للخلايا الحية. تم الكشف عن موقع المركبات الكهربائية الداخلية وتحليلها باستخدام المجهر confocal في ثلاثة أبعاد (3D) وأدوات معالجة ما بعد الصورة20. على الرغم من أن حجم المركبات الكهربائية الصغيرة (40-200 نانومتر) هو أقل من الحد الأقصى دقة المجهر البصري، يمكن الكشف عن المركبات الكهربائية المسمى الفلورسنت عن طريق المجهر البؤري منذ يمكن الكشف عن الالتقاف الضوئي انبعاثات الفلورية المحسنة. لذلك ، يمكن تحديد توطين الخلايا الفرعية للمركبات الكهربائية المسماة بالفلورسنت داخل الخلية بدقة من خلال الحصول على صور متعددة مكدسة ب z للمركبات الكهربائية والأعضاء الخلوية المحيطة بها.
بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن توفر إعادة البناء ثلاثية الأبعاد ومعالجة ما بعد البيانات المزيد من التبصر في وضع المركبات الكهربائية الداخلية والسطحية والحرة العائمة. من خلال الاستفادة من هذه العمليات بالتزامن مع التصوير بالخلايا الحية الفاصل الزمني الذي يقدمه المجهر الكونفوجال ، يمكن تقييم مستوى امتصاص EV بدقة ، ويمكن أيضا تتبع امتصاص EV في الوقت الفعلي. وعلاوة على ذلك، يمكن إجراء تحليل الاتجار بالمركبات الكهربائية باستخدام المجهر البؤري عن طريق تقييم التوطين المشترك للمركبات الكهربائية مع العضيات، وهي خطوة أولى لتحديد كيفية مشاركة المركبات الكهربائية الداخلية في الوظيفة داخل الخلايا. يصف هذا البروتوكول منهجية إجراء فحص امتصاص EV باستخدام جهاز microfluidic القائم على الترشيح النانوي17,26 ، والتنظير المجهري البؤري ، وتحليل ما بعد الصورة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>353038</td>
			<td>Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Orange CMTMR Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C2927</td>
			<td>Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Apo Lambda S 40XC WI</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77400</td>
			<td>Objective for confocal imaging, NA=1.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo VC 20X</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD70200</td>
			<td>Objective for confocal imaging, NA=0.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exodisc</td>
			<td>Labspinner Inc.</td>
			<td>EX-D1001</td>
			<td>A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoDiscovery</td>
			<td>Labspinner Inc.</td>
			<td>EX-R1001</td>
			<td>Operation device for Exodisc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-depleted FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2720801</td>
			<td>Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1500-500</td>
			<td>Nutrient for cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L preadsorbed</td>
			<td>abcam</td>
			<td>&#160;ab7063</td>
			<td>Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi USA&#160;U DISH &#956;-Dish 35 mm</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td>Culture dish for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 9.7.1</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>9.7.1</td>
			<td>Post-image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer</td>
			<td>Live Cell Instrument</td>
			<td>TU-O-20</td>
			<td>Incubator system for live cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Camera for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Inverted microscope for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 4.50.00</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>4.50.00</td>
			<td>Image processing software for Nikon microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA, NanoSight NS500</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>NS500</td>
			<td>Measurement device for EV concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 2020</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td>9.7.0.185</td>
			<td>Graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Antibiotics for cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21875034</td>
			<td>Cell culture media for PC3 cell line cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solution in DMSO</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S32703</td>
			<td>RNA staining fluorescent dye for the EV labeling</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extracellular vesicle uptake assay via confocal microscope imaging analysis

هناك حاجة إلى إجراء فحوصات عملية لتصور وقياس امتصاص الحويكل خارج الخلية (EV) للخلايا. يلعب امتصاص EV دورا في التواصل بين الخلايا في مختلف مجالات البحث؛ علم الأحياء السرطان، وعلم الأعصاب، وتسليم المخدرات. وقد تم الإبلاغ عن العديد من المقايسات EV امتصاص في الأدب; ومع ذلك، هناك نقص في المنهجية التجريبية العملية والمفصلة. يمكن تقييم امتصاص EV عن طريق وضع علامات فلورية على المركبات الكهربائية للكشف عن مواقعها داخل الخلايا. من الصعب التمييز بين المركبات الكهربائية الداخلية في الخلايا والمركبات الكهربائية السطحية على الخلايا ، ولكنها حاسمة ، لتحديد امتصاص EV بدقة. لذلك، يقترح في هذا العمل إجراء تقييم يحدد كفاءة امتصاص EV من خلال المجهر المفلور ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد). تم إعداد المركبات الكهربائية ذات العلامات الفلورية باستخدام جهاز ميكروفلويدي قائم على الترشيح النانوي ، تم تصوره بواسطة المجهر البؤري ثلاثي الأبعاد ، ثم تم تحليله من خلال برامج معالجة الصور المتقدمة. يوفر البروتوكول منهجية قوية لتحليل المركبات الكهربائية على المستوى الخلوي ونهجا عمليا للتحليل الفعال.

وباستخدام جهاز ميكروفلويدي قائم على الترشيح النانوي، تم عزل المركبات الكهربائية من PC3 CCM وسمت بأجسام مضادة خاصة ب EV (CD63) مرتبطة بالفلوروفوري (الشكل 1). تم تصور المركبات الكهربائية المسماة بنجاح من خلال المجهر البؤري ثلاثي الأبعاد (الشكل 2). تم احتضان المركبات ...

Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis at JoVE.com

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

تساهم الحويصلات خارج الخلية (EVs) في البيولوجيا الخلوية والاتصالات بين الخلايا. هناك حاجة إلى إجراء فحوصات عملية لتصور وقياس امتصاص المركبات الكهربائية من قبل الخلايا. يقترح البروتوكول الحالي فحص امتصاص EV من خلال استخدام التصوير الفلوري ثلاثي الأبعاد عبر المجهر الكونفوكوكال ، بعد عزل EV بواسطة جهاز microfluidic قائم على الترشيح النانوي.

خارج الخلية Vesicle امتصاص المقايسة عبر تحليل التصوير المجهر Confocal

There is a need for practical assays to visualize and quantify the cells' extracellular vesicle (EV) uptake. EV uptake plays a role in intercellular ...

يوفر هذا البروتوكول منهجية قوية لتحليل المركبات الكهربائية على المستوى الخلوي، ونهجا عمليا لامتصاص EV الفعال وتحليل تتبع EV. هذه الطريقة من وضع العلامات EV يزيل هطول الأمطار المشترك من المركبات الكهربائية وصبغ، وبالتالي تعزيز إشارات EV. يتم قياس امتصاص EV من خلال التحليل الحجمي لتمييز المركبات الكهربائية الداخلية عن المركبات الكهربائية السطحية.المركبات الكهربائية هي البضائع النشطة، وبالتالي، فإن امتصاصها يسمح بنقل الجزيئات الكيميائية الحيوية. للبحث في تسليم الأدوية القائمة على EV وعلاج السرطان، يمكن أن تكون هذه التقنية أداة تقييم. يلعب امتصاص EV دورا في التواصل بين الخلايا ويتم التحقيق فيه في مختلف مجالات البحث ، مثل بيولوجيا السرطان وعلم الأعصاب وتوصيل الأدوية.من المحتمل أن يسهل هذا البروتوكول إجراء فحص امتصاص EV فعال. لعزل الحويصلات خارج الخلية، أو المركبات الكهربائية، قم بحقن ملليلتر واحد من وسائط ثقافة الخلايا المعالجة مسبقا في غرفة العينة لجهاز microfluidic القائم على الترشيح النانوي. لتشغيل الجهاز، قم بتدوير الجهاز في جهاز الغزل على سطح المقعد عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق.بعد الغزل، قم بإزالة السائل من غرفة النفايات عن طريق الأنابيب أو القرصنة، ثم كرر هذا الإجراء مرتين لمعالجة ملليلترين إضافيين من وسائط ثقافة الخلية. بعد ذلك ، لغسل المركبات الكهربائية المعزولة ، قم بحقن ملليلتر واحد من PBS في غرفة العينة وتدور الجهاز في آلة الغزل benchtop. بالنسبة للوسم المناعي للمركبات الكهربائية، قم بحقن ميكروجرام واحد لكل ملليلتر من الجسم المضاد الخاص EV في ثقب الوضوء للجهاز الذي يحتوي على 100 ميكرولتر من المركبات الكهربائية المعزولة.ثم احتضان لمدة ساعة واحدة في الظلام على شاكر لوحة لضمان التوزيع حتى من الأجسام المضادة عبر العينة. بعد ذلك، إرفاق شريط لاصق إلى ثقب elution. حقن ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني في غرفة العينة لغسل الأجسام المضادة المتبقية، ثم تدور الجهاز حتى غرفة العينة فارغة.كرر الغسيل عن طريق حقن ملليلتر آخر من PBS في غرفة العينة ، وغزل الجهاز كما هو موضح سابقا. بعد إزالة السائل المتبقي من الغرفة، ماصة المركبات الكهربائية المسمى fluorescently من غرفة الغشاء إلى أنبوب العنبر أو أنبوب صغير. حماية الأنبوب من الضوء حتى الاستخدام.البذور أربع مرات 10 إلى خلايا PC3 الرابعة في طبق 35 ملليلتر مع وسائط ملليلتر واحد. السماح للخلايا بالالتصاق بين عشية وضحاها في ظروف زراعة الخلايا المثلى. في اليوم التالي، اغسل الخلايا الملتصقة مرتين باستخدام وسائط مستنفدة للاكسوسوم.بعد تمييع المركبات الكهربائية ذات العلامات الفلورية إلى التركيز المناسب باستخدام الوسائط المستنفدة للاكسوسوم ، أضف المركبات الكهربائية المخففة إلى الخلايا المستهدفة الملتزم بها واحتضن الوقت التجريبي المطلوب. بعد إزالة المركبات الكهربائية غير الداخلية عن طريق غسل الخلايا ثلاث مرات مع وسائل الإعلام الخالية من الإكسوسوم، تسمية السيتوبلازم من الخلايا الملتزم بها مع ميكروغرام واحد لكل ملليلتر من CMTMR، واحتضان في ظروف ثقافة الخلايا الأمثل. لتصوير الخلايا الحية، ضع الخلايا المعدة في حاضنة على خشبة المسرح.بعد وضع معلمات التصوير على أساس عينات التحكم، حدد عمق الخلايا المستهدفة ونطاق حجم التراص في اتجاه Z للحصول على صور confocal ثلاثية الأبعاد، ثم قم بتعيين الحصول على الصورة إلى صور متعددة مكدسة من كل من الصبغة الخاصة بالخلايا والصبغة الخاصة EV في وقت واحد. لمعالجة الصور ، واستخدام برنامج معالجة الصور التلقائي. لبناء الأسطح الظاهرية للخلايا، انقر على إضافة أسطح جديدة.لتكوين أسطح الخلايا الظاهرية، انقر فوق الزر إضافة وحدد الجودة كنوع عامل التصفية. عتبة القيمة المناسبة للحد الأدنى عن طريق الفحص البصري، تعيين القيمة القصوى للحد الأعلى، وانقر فوق الزر إنهاء التالي، لبناء النقاط الظاهرية من المركبات الكهربائية، انقر فوق الزر إضافة بقع جديدة. ضمن إعدادات الخوارزمية، حدد أحجام مختلفة لأماكن العمل وأقصر حساب للمسافات، ثم انقر فوق التالي وحدد القناة 1 Alexa Fluor 488 كقناة مصدر.أدخل القيمة المناسبة لقطرة XY المقدرة ضمن الكشف الموضعي وانقر فوق التالي. لتكوين نقاط EV الظاهرية، انقر فوق الزر إضافة وحدد الجودة كنوع عامل التصفية. تعيين الحد الأدنى بواسطة فحص مرئي ثم انقر فوق التالي لنوع المناطق الموضعية حدد كثافة مطلقة ثم انقر فوق التالي.لتحديد عتبة منطقة نقاط EV، أدخل القيمة المناسبة ل عتبة المنطقة عن طريق الفحص البصري. حدد القطر من أسفل حجم المنطقة وانقر فوق إنهاء. لتقسيم البقع المجمعة داخل السطح المبني، انقر على نقاط البناء واذهب إلى الفلاتر.انقر بعد ذلك على زر إضافة وحدد أقصر مسافة إلى Surfaces، Surfaces Surface 1 كنوع عامل التصفية. بعد تعيين الحد الأدنى للحد الأدنى والقيمة المناسبة للحد الأعلى، انقر فوق المقطع مكررة إلى الزر البقع الجديدة. لحساب تلقائي للمركبات الكهربائية داخل الخلايا، انقر فوق تحديد البقع 1، انتقل إلى الإحصاءات، وتصدير القيمة من إجمالي عدد البقع.للحصول على عدد الخلايا، انقر فوق "السطوح المبنية 1"، ثم انتقل إلى "الإحصائيات" وتصدير قيمة إجمالي عدد الأسطح من "إجمالي". وأخيرا، انتقل إلى علامة التبويب مفصلة ضمن الإحصاءات لتصدير وحدة التخزين. وصفت المركبات الكهربائية المعزولة عن وسائط ثقافة الخلايا PC3 باستخدام جهاز microfluidic القائم على الترشيح النانوي بجسم مضاد خاص ب EV مترافق مع الفلورو-4، وتم تصورها باستخدام المجهر البؤري ثلاثي الأبعاد.تم تصور المركبات الكهربائية الداخلية على أنها puncta ويسمح EV.Post الفردية لهذه الصور بالتصور والتحديد الكمي لعملية استيعاب EV في الخلايا. تشير نتائج فحص امتصاص EV إلى أن مستوى امتصاص EV يعتمد على طول فترة الحضانة. يمكن تسوية عدد المركبات الكهربائية الداخلية إلى حجم الخلية المتلقي لتحديد المعدل الفعلي لامتصاص EV للخلية المحددة.يسمح هذا الإجراء بالاستبعاد المنهجي للمركبات الكهربائية غير الداخلية لقياس عدد المركبات الكهربائية الداخلية بدقة. يظهر هنا توزيع حجم نقاط EV الداخلية. وبالتالي فإن الخطوات الرئيسية هي استخدام الجهاز microfluidic لوضع العلامات EV ، والتقليل من مضان الخلفية عند تصور المركبات الكهربائية الفلورية ، ومن ثم تحليل ما بعد التصوير لتحديد المركبات الكهربائية الداخلية مقابل السطحية.لذلك يمكن إجراء تتبع EV داخل الخلايا في الوقت الحقيقي على مستوى ثلاثي الأبعاد ، بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تحقيق تحليل الاتجار EV على القرارات المكانية / الزمنية والتوطين المشترك للمركبات الكهربائية مع العضيات دون الخلوية. لذلك نعتقد أن هذه التقنية توفر طريقة أسهل وأكثر كفاءة للتحقيق في المركبات الكهربائية داخل المصفوفات داخل وخارج الخلية للباحثين في مجال الاتصالات الخلوية للمركبات الكهربائية.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Unit 1

Endocytosis and Exocytosis

SCIENTISTS IN ACTION

Proper Care and Cleaning of the Microscope

العناية والتنظيف السليم للمجهر

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Major Components of the Light Microscope

مكونات رئيسية مجهر الضوء

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

والخلايا العصبية ونجمية المشارك الثقافة الفحص لتحليل محتوى عال من العصبية

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

مضان القائم على القياس من دخول الكالسيوم المتجر الذي يعمل في الخلايا الحية: من خلية السرطان مثقف على عضلة

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

مقايسة الامتصاص الكولسترول استخدام الخلايا الحية التصوير التحليل مع خلية المراقبة الصحية

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...

Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization by Nano-Flow Cytometry

توصيف البروتين عبر الغشاء الحويصلة خارج الخلية بواسطة قياس التدفق الخلوي النانوي

Single particle characterization has become increasingly relevant for research into extracellular vesicles, progressing from bulk analysis techniques and ...

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

تحليل تكلس الأوعية الدموية بوساطة الحويصلة خارج الخلية باستخدام نماذج في المختبر وفي الجسم الحي

Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world, and vascular calcification is the most significant predictor of cardiovascular events; ...

Multimodal Analytical Platform on a Multiplexed Surface Plasmon Resonance Imaging Chip for the Analysis of Extracellular Vesicle Subsets

منصة تحليلية متعددة الوسائط على رقاقة تصوير رنين البلازمون السطحية متعددة الإرسال لتحليل مجموعات فرعية من الحويصلات خارج الخلية

Extracellular vesicles (EVs) are membrane-derived, tiny vesicles produced by all cells that range from 50 to several hundreds of nanometers in diameter ...

Imaging of Mitochondrial Peroxide in Living Yeast Cells Using mtHyper7

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Advancing Mitochondrial Research Â– mtHyper7 Biosensor for Subcellular Analysis (Video) | JoVE

تصوير mtHyPer7 ، وهو مستشعر حيوي نسبي لبيروكسيد الميتوكوندريا ، في خلايا الخميرة الحية

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...

Intravital Imaging Using an Inverted Microscope to Track Skin Cell Dynamics

Streamlined Intravital Imaging Approach for Long-Term Monitoring of Epithelial Tissue Dynamics on an Inverted Confocal Microscope

Developing a Tool for Using Inverted Confocal Microscopes for In Vivo Intravital Imaging (Video) | JoVE

نهج التصوير داخل الجسم المبسط للمراقبة طويلة المدى لديناميكيات الأنسجة الظهارية على مجهر متحد البؤر مقلوب

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It ...