Name: extracellular vesicle uptake assay via confocal microscope imaging analysis
Uploaded: 2022-02-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af NIC-tilskudsnr. U54CA143803, CA163124, CA093900 og CA143055 til K.J.P. Denne forskning blev støttet af en bevilling fra Korea Health Technology R &D Project gennem Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finansieret af Ministeriet for Sundhed og Velfærd, Republikken Korea (tilskudsnummer: HI19C1122). Arbejde af J. Kim og Y.-K. Cho blev støttet af Institute for Basic Science (IBS-R020-D1), finansieret af den koreanske regering. Forfatterne takker de nuværende og tidligere medlemmer af Brady Urological Institute, især medlemmer af Pienta-Amend laboratoriet, for den kritiske læsning af manuskriptet.

1. EV isolation og on-chip immun-fluorescerende EV mærkning
<ol><li>Indsamling af cellekulturmedier (CCM) og forbehandling af CCM til EV-isolering<ol>
<li>Seed PC3 celler ved 30% sammenløb i en 75 cm2 celle kultur kolbe. Tillad kontrolceller at vokse til 90% sammenløb (~48 h) i standard medier og celle-line-specifikke kosttilskud. BEMÆRK: For at forhindre, at EV-holdige komponenter påvirker cellulær optagelse (dvs. fosterkvægsserum), skal du bruge exosome-udtømte medier og kosttilskud.</li>
		<li>...

<ol>
	<li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+Ectosomes+in+Intercellular+Communication.">Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication.</a> Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).</li><li>Sunkara, V., Woo, H. -. K., Cho, Y. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+techniques+in+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles+and+their+roles+in+cancer+diagnostics+and+prognostics.">Emerging techniques in the isolation and characterization of extracellular vesicles and their roles in cancer diagnostics and prognostics.</a> The Analyst. 141 (2), 371-381 (2016).</li><li>Kalluri, R., Lebleu, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology,+function,+and+biomedical+applications+of+exosomes.">The biology, function, and biomedical applications of exosomes.</a> Science. 367 (6478), (2020).</li><li>Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificities+of+secretion+and+uptake+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+cell-to-cell+communication.">Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).</li><li>Bonsergent, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+characterization+of+extracellular+vesicle+uptake+and+content+delivery+within+mammalian+cells.">Quantitative characterization of extracellular vesicle uptake and content delivery within mammalian cells.</a> Nature Communications. 12, 1864 (2021).</li><li>Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routes+and+mechanisms+of+extracellular+vesicle+uptake.">Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).</li><li>Dehghani, M., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+extracellular+vesicles.">Fluorescent labeling of extracellular vesicles.</a> Methods Enzymology. 645, 15-42 (2020).</li><li>Ragni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovative+Visualization+and+Quantification+of+Extracellular+Vesicles+Interaction+with+and+Incorporation+in+Target+Cells+in+3D+Microenvironments.">Innovative Visualization and Quantification of Extracellular Vesicles Interaction with and Incorporation in Target Cells in 3D Microenvironments.</a> Cells. 9 (5), 1180 (2020).</li><li>Saari, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLIM+reveals+alternative+EV-mediated+cellular+up-take+pathways+of+paclitaxel.">FLIM reveals alternative EV-mediated cellular up-take pathways of paclitaxel.</a> Journal of Controlled Release. 284, 133-143 (2018).</li><li>Franzen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Uptake+and+Internalization+of+Exosomes+by+Bladder+Cancer+Cells.">Characterization of Uptake and Internalization of Exosomes by Bladder Cancer Cells.</a> BioMed Research International. 2014, 619829 (2014).</li><li>Feng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Internalization+of+Exosomes+Occurs+Through+Phagocytosis.">Cellular Internalization of Exosomes Occurs Through Phagocytosis.</a> Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).</li><li>Hoen, E. N. M. N. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+qualitative+flow+cytometric+analysis+of+nanosized+cell-derived+membrane+vesicles.">Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).</li><li>Van Der Vlist, E. J., Nolte-'T Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry.">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).</li><li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+Exosome+Isolation+Techniques.">Progress in Exosome Isolation Techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+perspective+on+exosome+isolation+-+efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics.">and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li><li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+distinct+exosome+subpopulations:+isolation+and+characterization+approaches+and+their+associated+challenges.">Separation of distinct exosome subpopulations: isolation and characterization approaches and their associated challenges.</a> The Analyst. 146 (12), 3731-3749 (2021).</li><li>Woo, H. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exodisc+for+Rapid,+Size-Selective,+and+Efficient+Isolation+and+Analysis+of+Nanoscale+Extracellular+Vesicles+from+Biological+Samples.">Exodisc for Rapid, Size-Selective, and Efficient Isolation and Analysis of Nanoscale Extracellular Vesicles from Biological Samples.</a> ACS Nano. 11 (2), 1360-1370 (2017).</li><li>Kim, T. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAST:+Size-Selective,+Clog-Free+Isolation+of+Rare+Cancer+Cells+from+Whole+Blood+at+a+Liquid-Liquid+Interface.">FAST: Size-Selective, Clog-Free Isolation of Rare Cancer Cells from Whole Blood at a Liquid-Liquid Interface.</a> Analytical Chemistry. 89 (2), 1155-1162 (2017).</li><li>Joshi, B. S., De Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+of+Extracellular+Vesicles+and+Release+of+Their+Cargo+from+Endosomes.">Endocytosis of Extracellular Vesicles and Release of Their Cargo from Endosomes.</a> ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).</li><li>Sung, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+live+cell+reporter+of+exosome+secretion+and+uptake+reveals+pathfinding+behavior+of+migrating+cells.">A live cell reporter of exosome secretion and uptake reveals pathfinding behavior of migrating cells.</a> Nature Communications. 11, 2092 (2020).</li><li>Heusermann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+surf+on+filopodia+to+enter+cells+at+endocytic+hot+spots,+traffic+within+endosomes,+and+are+targeted+to+the+ER.">Exosomes surf on filopodia to enter cells at endocytic hot spots, traffic within endosomes, and are targeted to the ER.</a> Journal of Cell Biology. 213 (2), 173-184 (2016).</li><li>Reclusa, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+extracellular+vesicles+visualization:+From+static+to+motion.">Improving extracellular vesicles visualization: From static to motion.</a> Scientific Reports. 10, 6494 (2020).</li><li>Verweij, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Tracking+of+Inter-organ+Communication+by+Endogenous+Exosomes+In+Vivo.">Live Tracking of Inter-organ Communication by Endogenous Exosomes In Vivo.</a> Developmental Cell. 48 (4), 573-589 (2019).</li><li>Lai, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+tracking+of+tumour+extracellular+vesicle+delivery+and+RNA+translation+using+multiplexed+reporters.">Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters.</a> Nature Communications. 6, 7029 (2015).</li><li>Durak-Kozica, M., Baster, Z., Kubat, K., St&#281;pie&#324;, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+visualization+of+extracellular+vesicle+uptake+by+endothelial+cells.">3D visualization of extracellular vesicle uptake by endothelial cells.</a> Cellular &amp; Molecular Biology Letters. 23, 57 (2018).</li><li>Sunkara, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+Automated,+Label-Free+Isolation+of+Extracellular+Vesicles+from+Whole+Blood+for+Cancer+Diagnosis+and+Monitoring.">Fully Automated, Label-Free Isolation of Extracellular Vesicles from Whole Blood for Cancer Diagnosis and Monitoring.</a> Theranostics. 9 (7), 1851-1863 (2019).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+trophoblastic+small+extracellular+vesicles+and+detection+of+their+miRNA+cargo+in+P-bodies.">Internalization of trophoblastic small extracellular vesicles and detection of their miRNA cargo in P-bodies.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1812261 (2020).</li><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+evaluation+of+methods+for+small+extracellular+vesicles+separation+from+human+plasma,+urine+and+cell+culture+medium.">Comprehensive evaluation of methods for small extracellular vesicles separation from human plasma, urine and cell culture medium.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10, 12044 (2020).</li></ol>

En EV optagelse assay baseret på 3D fluorescens billeddannelse via konfokal mikroskopi giver en effektiv metode og følsom analyse. Denne fluorescerende EV mærkning letter visualisering af elbiler og med succes udfører en præcis EV optagelse assay. Tidligere metoder til mærkning af elbiler og fjernelse af restfarvestof er blevet rapporteret ved at fjerne nedbør ved hjælp af ultracentrifugering (UC); UC kan dog være med til at udfælde elbiler, og det immobiliserede farvestof kan føre til et falsk-positi...

Ekstracellulære vesikler (elbiler) er nano-størrelse, lipidmembran-bundet partikler, der er kategoriseret efter deres størrelser: ectosomes (100-500 nm) og exosomer (50-150 nm)1. Elbiler indeholder forskellige biomolekyler, såsom proteiner, nukleinsyrer og lipider. Disse biomolekyler stammer fra cellerne, før de indkapsles som last og frigives i det ekstracellulære rum via elbiler1,2,3.
På grund af de mange forskellige deres last, elbiler menes at spille en aktiv rolle i intercellulær kommunikation. Frigivelse og optagelse af elbiler af celler gør det muligt at overføre biomolekyler mellem cellerne4,5. Indførelsen af EV-last til en celle kan ændre modtagercellens funktioner og homøostatisk tilstand4,5,6. Elbiler internaliseres gennem flere veje; De nøjagtige mekanismer er dog ikke blevet nøjagtigt påvist.
De fleste af ev optagelse assays, såsom genetisk mærkning, fluorescerende mærke individuelle elbiler7. Det resulterende signal kan måles ved mikropladefotometer, flowcytometri eller mikroskopi, hvor hver teknologi har betydelige begrænsninger. Mikropladefotometre, flowcytometri eller standard todimensionel (2D) mikroskopi kan ikke skelne mellem internaliserede og overfladisk vedhæftede elbiler8,9. Desuden kan den nødvendige prøveforberedelse for hver af disse teknikker medføre yderligere problemer i forbindelse med evaluering af ev-optagelse. For eksempel, løfte klæbede celler med trypsin før EV optagelse analyse kan kløve nogle overfladisk vedhæftede elbiler på cellens overflade10,11. Trypsin kan også interagere med celleoverfladen, påvirker celle og EV fænotype. Derudover kan trypsin ikke løsne overfladiske elbiler helt, skævvridning isolerede populationer.
For nøjagtigt at mærke elbiler med fluorescerende farvestoffer kræves der yderligere vasketrin for at fjerne restfarvet7. Accepterede isolationsteknikker kan også bidrage til falsk-positive signaler på grund af koagulation, der opstår under EV-isolation. For eksempel er seriel ultracentrifugering (UC) meget udbredt til at isolere elbiler og fjerne det immobiliserede farvestof. UC kan dog være med til at udfælde elbiler, og restfarvestoffet kan føre til et falsk-positivt signal12,13. Andre nanofiltreringsmetoder, såsom kolonnebaseret filtrering, anvendes også i vid udstrækning til ikke-immobiliseret farvefjernelse. Den komplekse karakter af elbiler og farvestof, der interagerer inden for kolonnematrixen, kan føre til ufuldstændig fjernelse af restfarvestof, fordi søjlens molekylære afskæring ændres af den komplekse indgang14,15,16.
Den nuværende protokol foreslår en nanofiltreringsbaseret mikrofluidisk enhed til at isolere og vaske fluorescerende mærket isolerede elbiler. Den nanofiltreringsbaserede mikrofluidiske enhed kan give effektiv filtrering via væskeassisteret separationsteknologi (FAST)17,18. FAST reducerer trykfaldet på tværs af filteret, hvilket reducerer den potentielle sammenlægning mellem elbiler og farvestoffer. Ved effektivt at fjerne restfarve, er det muligt at forbedre kvaliteten af fluorescerende mærket elbiler og analysens specificitet.
Konfokal mikroskopi kan skelne mellem internaliserede og overfladisk vedhæftede elbiler på celleoverfladen og grundigt undersøge de cellulære mekanismer af EV optagelse i en spatiotemporal opløsning19,20,21,22,23,24,25. For eksempel beskrev Sung et al. visualiseringen af den exosome livscyklus ved hjælp af deres udviklede live-celle reporter. Placeringen af de internaliserede elbiler blev opdaget og analyseret ved hjælp af et konfokalt mikroskop i 3D-værktøjer (three-dimension) og post-image processing20. Selv om størrelsen af små elbiler (40-200 nm) er under opløsningsgrænsen for det optiske mikroskop, kan de fluorescerende mærkede elbiler detekteres ved konfokal mikroskopi, da fotodetektoren kan detektere den forbedrede fluorescensemission. Derfor kan den subcellulære lokalisering af de fluorescerende mærkede elbiler i en celle bestemmes præcist ved at erhverve flere z-stablede billeder af elbilerne og de omkringliggende cellulære organeller.
Derudover kan 3D-rekonstruktion og post-databehandling give yderligere indsigt i placeringen af de internaliserede, overfladiske og fritflydende elbiler. Ved at udnytte disse processer i forbindelse med time-lapse live-celle billeddannelse, der tilbydes af konfokal mikroskopi, kan niveauet af EV optagelse vurderes præcist, og real-time tracking af EV optagelse er også muligt. Endvidere kan ev trafficking analyse udføres ved hjælp af konfokal mikroskopi ved at vurdere co-lokalisering af elbiler med organeller, et første skridt til at bestemme, hvordan internaliserede elbiler er involveret i den intracellulære funktion. Denne protokol beskriver metoden til udførelse af en EV-optagelsesanalyse ved hjælp af den nanofiltreringsbaserede mikrofluidiske enhed17,26, konfokal mikroskopi og analyse efter billede.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>353038</td>
			<td>Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Orange CMTMR Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C2927</td>
			<td>Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Apo Lambda S 40XC WI</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77400</td>
			<td>Objective for confocal imaging, NA=1.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo VC 20X</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD70200</td>
			<td>Objective for confocal imaging, NA=0.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exodisc</td>
			<td>Labspinner Inc.</td>
			<td>EX-D1001</td>
			<td>A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoDiscovery</td>
			<td>Labspinner Inc.</td>
			<td>EX-R1001</td>
			<td>Operation device for Exodisc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-depleted FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2720801</td>
			<td>Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1500-500</td>
			<td>Nutrient for cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L preadsorbed</td>
			<td>abcam</td>
			<td>&#160;ab7063</td>
			<td>Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi USA&#160;U DISH &#956;-Dish 35 mm</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td>Culture dish for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 9.7.1</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>9.7.1</td>
			<td>Post-image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer</td>
			<td>Live Cell Instrument</td>
			<td>TU-O-20</td>
			<td>Incubator system for live cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Camera for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Inverted microscope for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 4.50.00</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>4.50.00</td>
			<td>Image processing software for Nikon microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA, NanoSight NS500</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>NS500</td>
			<td>Measurement device for EV concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 2020</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td>9.7.0.185</td>
			<td>Graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Antibiotics for cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21875034</td>
			<td>Cell culture media for PC3 cell line cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solution in DMSO</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S32703</td>
			<td>RNA staining fluorescent dye for the EV labeling</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extracellular vesicle uptake assay via confocal microscope imaging analysis

Der er behov for praktiske analyser til at visualisere og kvantificere cellernes ekstracellulære vesikel (EV) optagelse. Udbredelsen af el-og el-eks. kræftbiologi, neurovidenskab og lægemiddellevering. Mange EV optagelse assays er blevet rapporteret i litteraturen; Der mangler imidlertid en praktisk og detaljeret eksperimentel metode. EV optagelse kan vurderes ved fluorescerende mærkning elbiler til at opdage deres placering i celler. Det er vanskeligt, men kritisk at skelne mellem internaliserede elbiler i celler og de overfladiske elbiler på celler, men det er vigtigt at bestemme EV-optagelsen nøjagtigt. Derfor foreslås en analyse, der effektivt kvantificerer EV-optagelse gennem tredimensionel (3D) fluorescenskonfokal mikroskopi i dette arbejde. Fluorescerende mærket elbiler blev udarbejdet ved hjælp af en nano-filtrering-baseret mikrofluidisk enhed, visualiseret af 3D konfokal mikroskopi, og derefter analyseret gennem avanceret billedbehandling software. Protokollen giver en robust metode til analyse af elbiler på celleniveau og en praktisk tilgang til effektiv analyse.

Ved hjælp af en nanofiltreringsbaseret mikrofluidisk enhed blev elbiler isoleret fra PC3 CCM og mærket med et fluorophore-konjugeret EV-specifikt (CD63) antistof (figur 1). De mærkede elbiler blev med succes visualiseret af 3D-konfokal mikroskopi (figur 2). De mærkede elbiler blev inkuberet med celler i flere timer i exosome-udtømte medier. Efter inkubation blev celler vasket med exosome udtømte medier. De resterende elbiler blev internaliseret eller klæb...

Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis at JoVE.com

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Ekstracellulære vesikler (elbiler) bidrager til cellulær biologi og intercellulær kommunikation. Der er behov for praktiske analyser til at visualisere og kvantificere elbiler optagelse af cellerne. Den nuværende protokol foreslår EV optagelse assay ved hjælp af tre-dimensionelle fluorescens billeddannelse via konfokal mikroskopi, efter EV isolation af en nano-filtrering-baseret mikrofluidisk enhed.

Ekstracellulære vesikel Optagelse Assay via Confocal Microscope Imaging Analyse

There is a need for practical assays to visualize and quantify the cells' extracellular vesicle (EV) uptake. EV uptake plays a role in intercellular ...

Denne protokol giver en robust metode til analyse af elbiler på celleniveau og en praktisk tilgang til effektiv EV-optagelse og EV-sporingsanalyse. Denne metode til EV mærkning eliminerer co-nedbør af elbiler og farvestof, og dermed øge EV signaler. EV-optagelse måles ved volumetrisk analyse for at skelne de internaliserede elbiler fra de overfladiske elbiler.Elbiler er aktiv last, således tillader deres optagelse overførsel af biokemiske molekyler. Til forskning i EV-baseret lægemiddellevering og kræftbehandling kan denne teknik være et vurderingsværktøj. EV optagelse spiller en rolle i intercellulær kommunikation og undersøges inden for forskellige forskningsområder, såsom kræftbiologi, neurovidenskab, og lægemiddellevering.Denne protokol potentielt letter effektiv EV optagelse assay. Ved isolering af ekstracellulære vesikler eller elbiler skal du injicere en milliliter forbehandlede cellekulturmedier i prøvekammeret i den nanofiltrede mikrofluidiske anordning. Hvis du vil betjene enheden, skal du dreje enheden i spindemaskinen på 3000 omdr./min. i 10 minutter.Efter spinding fjernes væsken fra affaldskammeret ved at pipettere eller aspirere og derefter gentage denne procedure to gange til behandling af yderligere to milliliter af cellekulturmediet. For derefter at vaske de isolerede elbiler skal du injicere en milliliter PBS i prøvekammeret og dreje enheden i bænken spindemaskine. Ved immunfluorescentmærkning af elbilerne skal du injicere et mikrogram pr. milliliter af det EV-specifikke antistof i elutionshullet på enheden, der indeholder 100 mikroliter af isolerede elbiler.Inkuber derefter i en time i mørket på en plade shaker for at sikre jævn fordeling af antistoffet på tværs af prøven. Derefter fastgøres et klæbebånd til elutionhullet. Sprøjt en milliliter PBS ind i prøvekammeret for at vaske restantistoffer ud, og drej derefter enheden, indtil prøvekammeret er tomt.Gentag vasken ved at sprøjte endnu en milliliter PBS ind i prøvekammeret og dreje enheden som tidligere påvist. Når restvæsken er fjernet fra kammeret, pipettes de fluorescerende mærkede elbiler fra membrankammeret til et ravrør eller mikrorør. Beskyt røret mod lys, indtil det er i brug.Seed fire gange 10 til den fjerde PC3 celler i en 35-milliliter skål med en milliliter medier. Lad cellerne klæbe natten over under optimale cellekulturforhold. Den følgende dag vaskes de klæbede celler to gange med exosome-udtømte medier.Efter fortynding af de fluorescerende mærkede elbiler til den relevante koncentration ved hjælp af exosome-udtømte medier, tilsæt de fortyndede elbiler til de klæbede målceller og inkuberes i den ønskede forsøgstid. Efter fjernelse af ikke-internaliserede elbiler ved at vaske cellerne tre gange med exosome-fri medier, mærke cytoplasma af de klæbede celler med et mikrogram per milliliter AF CMTMR, og inkubere i optimale cellekultur betingelser. For levende cellebilleddannelse skal du placere de forberedte celler i inkubatoren på scenen.Når du har indstillet billedbehandlingsparametrene baseret på kontrolprøver, skal du bestemme dybden af målcellerne og rækkevidden af stablingsstørrelse i Z-retningen for at erhverve 3D-konfokale billeder og derefter indstille billedopsamlingen til flere Z-stablede billeder af både cellespecifikt farvestof og EV-specifikt farvestof samtidigt. Til billedbehandling skal du bruge automatisk billedbehandlingssoftware. Hvis du vil bygge virtuelle overflader af cellerne, skal du klikke på Tilføj nye overflader.Hvis du vil konfigurere de virtuelle celleoverflader, skal du klikke på knappen Tilføj og vælge Kvalitet som filtertype. Tærskel den relevante værdi for den lave grænse ved visuel inspektion, angiv maksimumværdien for den øvre grænse, og klik på knappen Udfør næste for at opbygge de virtuelle prikker på elbilerne, klik på knappen Tilføj nye pletter. Vælg Forskellige staffagestørrelser og korteste afstandsberegning under Algoritmeindstillinger, og klik derefter på Næste, og vælg Kanal 1 Alexa Fluor 488 som kildekanal.Angiv den relevante værdi for den anslåede XY-diameter under Spotdetektering, og klik på Næste. Hvis du vil konfigurere de virtuelle EV-prikker, skal du klikke på knappen Tilføj og vælge Kvalitet som filtertype. Angiv den nederste tærskel ved en visuel inspektion, og klik på Næste for områdetype for staffage, vælg Absolut intensitet, og klik derefter på Næste.Hvis du vil tærskel området for EV-prikker, skal du angive den relevante værdi for Områdetærskel ved visuel inspektion. Vælg Diameter fra under Områdevolumen, og klik på Udfør. Hvis du vil opdele de grupperede pletter inde i den byggede overflade, skal du klikke på Build Spots og gå ind i Filtre.Klik derefter på knappen Tilføj, og vælg Korteste afstand til overflader, Surface Surface 1 som filtertype. Når du har angivet den laveste grænse for den lave grænse og den relevante værdi for den øvre grænse, skal du klikke på duplikersektionen til knappen Nye pletter. Hvis du vil have automatisk optælling af elbiler i cellerne, skal du klikke på valget Afbyggede pletter 1, gå til Statistik og eksportere værdien fra det samlede antal pletter.Hvis du vil have fat i antallet af celler, skal du klikke på De byggede overflader 1 og derefter gå til Statistik og eksportere værdien af det samlede antal overflader fra Samlet. Endelig skal du gå til fanen Detaljeret under Statistik for at eksportere diskenheden. Elbiler isoleret fra PC3 celle kultur medier ved hjælp af en nanofiltration-baseret mikrofluidisk enhed blev mærket med en fluor-4-konjugeret EV-specifikke antistof, og visualiseret ved hjælp af 3D konfokal mikroskopi.De internaliserede elbiler blev visualiseret som punktta, og en individuel EV.Post-behandling af disse billeder gør det muligt at visualisere og kvantificere EV internalisering i cellerne. Resultaterne af EV-optagelsesanalysen viser, at ev-optagelsen afhænger af inkubationsperiodens længde. Antallet af internaliserede elbiler kan normaliseres til modtagercellevolumen for at bestemme den faktiske hastighed for ev-optagelse for den angivne celle.Denne procedure giver mulighed for systematisk udelukkelse af ikke-internaliserede elbiler for præcist at måle antallet af internaliserede elbiler. Størrelsen fordeling af internaliserede EV prikker er vist her. Så de vigtigste trin er udnyttelsen af den mikrofluidiske enhed til EV-mærkning, minimering af baggrundslysstofscens ved visualisering af fluorescerende elbiler og derefter post-imaging-analysen for at bestemme internaliserede versus overfladiske elbiler.Så intracellulær EV tracking kan udføres i realtid på et 3D-fly, og derudover, EV menneskehandel analyse på rumlige / tidsmæssige opløsninger og co-lokalisering af elbiler med subcellulære organeller kan opnås. Så vi mener, at denne teknik giver en nemmere og mere effektiv måde at undersøge elbiler inden for de intra-og ekstracellulære matricer for forskere inden for det cellulære kommunikationsområde for elbiler.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Unit 1

Endocytosis and Exocytosis

SCIENTISTS IN ACTION

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluorescens-baserede Måling af Store betjente Calcium indtastning i levende celler: fra kulturperler kræftcellen til at Skeletmuskel Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

LDL-kolesterol optagelse Assay ved hjælp af levende celle Imaging analyse med celle sundhedsovervågning

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...

Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization by Nano-Flow Cytometry

Enkelt ekstracellulær vesikel transmembranproteinkarakterisering ved nano-flowcytometri

Single particle characterization has become increasingly relevant for research into extracellular vesicles, progressing from bulk analysis techniques and ...

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

Analyse af ekstracellulær vesikelmedieret vaskulær forkalkning ved hjælp af in vitro- og in vivo-modeller

Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world, and vascular calcification is the most significant predictor of cardiovascular events; ...

Multimodal Analytical Platform on a Multiplexed Surface Plasmon Resonance Imaging Chip for the Analysis of Extracellular Vesicle Subsets

Multimodal analytisk platform på en multiplexeret overfladeplasmonresonansbilleddannelseschip til analyse af ekstracellulære vesikelundergrupper

Extracellular vesicles (EVs) are membrane-derived, tiny vesicles produced by all cells that range from 50 to several hundreds of nanometers in diameter ...

Imaging of Mitochondrial Peroxide in Living Yeast Cells Using mtHyper7

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Advancing Mitochondrial Research Â– mtHyper7 Biosensor for Subcellular Analysis (Video) | JoVE

Billeddannelse af mtHyPer7, en ratiometrisk biosensor for mitokondrieperoxid, i levende gærceller

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...

Intravital Imaging Using an Inverted Microscope to Track Skin Cell Dynamics

Streamlined Intravital Imaging Approach for Long-Term Monitoring of Epithelial Tissue Dynamics on an Inverted Confocal Microscope

Developing a Tool for Using Inverted Confocal Microscopes for In Vivo Intravital Imaging (Video) | JoVE

Strømlinet intravital billeddannelsesmetode til langsigtet overvågning af epitelvævsdynamik på et inverteret konfokalmikroskop

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It ...