Name: extracellular vesicle uptake assay via confocal microscope imaging analysis
Uploaded: 2022-02-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door NCI grant nos. U54CA143803, CA163124, CA093900 en CA143055 naar K. J. P. Dit onderzoek werd ondersteund door een subsidie van het Korea Health Technology R&D Project via het Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), gefinancierd door het Ministerie van Volksgezondheid & Welzijn, Republiek Korea (subsidienummer: HI19C1122). Werk van J. Kim en Y.-K. Cho werd ondersteund door het Institute for Basic Science (IBS-R020-D1), gefinancierd door de Koreaanse overheid. De auteurs bedanken de huidige en voormalige leden van het Brady Urological Institute, in het bijzonder leden van het Pienta-Amend laboratorium, voor de kritische lezing van het manuscript.

1. EV-isolatie en immuno-fluorescerende EV-etikettering op de chip
<ol><li>Verzameling van celkweekmedia (CCM) en voorbewerking van CCM voor EV-isolatie<ol>
<li>Zaai PC3-cellen met 30% confluentie in een celkweekkolf van 75 cm2 . Laat controlecellen groeien tot 90% confluentie (~ 48 uur) in standaardmedia en cellijnspecifieke supplementen. OPMERKING: Om te voorkomen dat EV-bevattende componenten de cellulaire opname beïnvloeden (d.w.z. foetaal runderserum), gebruikt u exosoomarme media en supplementen.</...

<ol>
	<li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+Ectosomes+in+Intercellular+Communication.">Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication.</a> Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).</li><li>Sunkara, V., Woo, H. -. K., Cho, Y. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+techniques+in+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles+and+their+roles+in+cancer+diagnostics+and+prognostics.">Emerging techniques in the isolation and characterization of extracellular vesicles and their roles in cancer diagnostics and prognostics.</a> The Analyst. 141 (2), 371-381 (2016).</li><li>Kalluri, R., Lebleu, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology,+function,+and+biomedical+applications+of+exosomes.">The biology, function, and biomedical applications of exosomes.</a> Science. 367 (6478), (2020).</li><li>Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificities+of+secretion+and+uptake+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+cell-to-cell+communication.">Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).</li><li>Bonsergent, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+characterization+of+extracellular+vesicle+uptake+and+content+delivery+within+mammalian+cells.">Quantitative characterization of extracellular vesicle uptake and content delivery within mammalian cells.</a> Nature Communications. 12, 1864 (2021).</li><li>Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routes+and+mechanisms+of+extracellular+vesicle+uptake.">Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).</li><li>Dehghani, M., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+extracellular+vesicles.">Fluorescent labeling of extracellular vesicles.</a> Methods Enzymology. 645, 15-42 (2020).</li><li>Ragni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovative+Visualization+and+Quantification+of+Extracellular+Vesicles+Interaction+with+and+Incorporation+in+Target+Cells+in+3D+Microenvironments.">Innovative Visualization and Quantification of Extracellular Vesicles Interaction with and Incorporation in Target Cells in 3D Microenvironments.</a> Cells. 9 (5), 1180 (2020).</li><li>Saari, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLIM+reveals+alternative+EV-mediated+cellular+up-take+pathways+of+paclitaxel.">FLIM reveals alternative EV-mediated cellular up-take pathways of paclitaxel.</a> Journal of Controlled Release. 284, 133-143 (2018).</li><li>Franzen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Uptake+and+Internalization+of+Exosomes+by+Bladder+Cancer+Cells.">Characterization of Uptake and Internalization of Exosomes by Bladder Cancer Cells.</a> BioMed Research International. 2014, 619829 (2014).</li><li>Feng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Internalization+of+Exosomes+Occurs+Through+Phagocytosis.">Cellular Internalization of Exosomes Occurs Through Phagocytosis.</a> Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).</li><li>Hoen, E. N. M. N. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+qualitative+flow+cytometric+analysis+of+nanosized+cell-derived+membrane+vesicles.">Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).</li><li>Van Der Vlist, E. J., Nolte-'T Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry.">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).</li><li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+Exosome+Isolation+Techniques.">Progress in Exosome Isolation Techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+perspective+on+exosome+isolation+-+efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics.">and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li><li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+distinct+exosome+subpopulations:+isolation+and+characterization+approaches+and+their+associated+challenges.">Separation of distinct exosome subpopulations: isolation and characterization approaches and their associated challenges.</a> The Analyst. 146 (12), 3731-3749 (2021).</li><li>Woo, H. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exodisc+for+Rapid,+Size-Selective,+and+Efficient+Isolation+and+Analysis+of+Nanoscale+Extracellular+Vesicles+from+Biological+Samples.">Exodisc for Rapid, Size-Selective, and Efficient Isolation and Analysis of Nanoscale Extracellular Vesicles from Biological Samples.</a> ACS Nano. 11 (2), 1360-1370 (2017).</li><li>Kim, T. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAST:+Size-Selective,+Clog-Free+Isolation+of+Rare+Cancer+Cells+from+Whole+Blood+at+a+Liquid-Liquid+Interface.">FAST: Size-Selective, Clog-Free Isolation of Rare Cancer Cells from Whole Blood at a Liquid-Liquid Interface.</a> Analytical Chemistry. 89 (2), 1155-1162 (2017).</li><li>Joshi, B. S., De Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+of+Extracellular+Vesicles+and+Release+of+Their+Cargo+from+Endosomes.">Endocytosis of Extracellular Vesicles and Release of Their Cargo from Endosomes.</a> ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).</li><li>Sung, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+live+cell+reporter+of+exosome+secretion+and+uptake+reveals+pathfinding+behavior+of+migrating+cells.">A live cell reporter of exosome secretion and uptake reveals pathfinding behavior of migrating cells.</a> Nature Communications. 11, 2092 (2020).</li><li>Heusermann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+surf+on+filopodia+to+enter+cells+at+endocytic+hot+spots,+traffic+within+endosomes,+and+are+targeted+to+the+ER.">Exosomes surf on filopodia to enter cells at endocytic hot spots, traffic within endosomes, and are targeted to the ER.</a> Journal of Cell Biology. 213 (2), 173-184 (2016).</li><li>Reclusa, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+extracellular+vesicles+visualization:+From+static+to+motion.">Improving extracellular vesicles visualization: From static to motion.</a> Scientific Reports. 10, 6494 (2020).</li><li>Verweij, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Tracking+of+Inter-organ+Communication+by+Endogenous+Exosomes+In+Vivo.">Live Tracking of Inter-organ Communication by Endogenous Exosomes In Vivo.</a> Developmental Cell. 48 (4), 573-589 (2019).</li><li>Lai, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+tracking+of+tumour+extracellular+vesicle+delivery+and+RNA+translation+using+multiplexed+reporters.">Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters.</a> Nature Communications. 6, 7029 (2015).</li><li>Durak-Kozica, M., Baster, Z., Kubat, K., St&#281;pie&#324;, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+visualization+of+extracellular+vesicle+uptake+by+endothelial+cells.">3D visualization of extracellular vesicle uptake by endothelial cells.</a> Cellular &amp; Molecular Biology Letters. 23, 57 (2018).</li><li>Sunkara, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+Automated,+Label-Free+Isolation+of+Extracellular+Vesicles+from+Whole+Blood+for+Cancer+Diagnosis+and+Monitoring.">Fully Automated, Label-Free Isolation of Extracellular Vesicles from Whole Blood for Cancer Diagnosis and Monitoring.</a> Theranostics. 9 (7), 1851-1863 (2019).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+trophoblastic+small+extracellular+vesicles+and+detection+of+their+miRNA+cargo+in+P-bodies.">Internalization of trophoblastic small extracellular vesicles and detection of their miRNA cargo in P-bodies.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1812261 (2020).</li><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+evaluation+of+methods+for+small+extracellular+vesicles+separation+from+human+plasma,+urine+and+cell+culture+medium.">Comprehensive evaluation of methods for small extracellular vesicles separation from human plasma, urine and cell culture medium.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10, 12044 (2020).</li></ol>

Een EV-opnametest op basis van 3D-fluorescentiebeeldvorming via confocale microscopie biedt een efficiënte methodologie en gevoelige analyse. Deze fluorescerende EV-etikettering vergemakkelijkt de visualisatie van EV's en voert met succes een nauwkeurige EV-opnametest uit. Eerdere methoden voor het labelen van EV's en het verwijderen van de resterende kleurstof zijn gemeld door neerslag te verwijderen met behulp van ultracentrifugatie (UC); UC kan echter ev's samen neerslaan en de geïmmobiliseerde kleurstof ka...

Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn nanogrote, lipidemembraangebonden deeltjes die zijn gecategoriseerd op basis van hun grootte: ectosomen (100-500 nm) en exosomen (50-150 nm)1. EV's bevatten verschillende biomoleculen, zoals eiwitten, nucleïnezuren en lipiden. Deze biomoleculen zijn afkomstig uit de cellen voordat ze als lading worden ingekapseld en via EV's in de extracellulaire ruimte worden vrijgegeven1,2,3.
Vanwege de verscheidenheid van hun lading, worden EV's verondersteld een actieve rol te spelen in intercellulaire communicatie. De afgifte en opname van EV's door cellen maakt de overdracht van biomoleculen tussen de cellen mogelijk4,5. De introductie van EV-lading in een cel kan de functies en homeostatische toestand van de ontvangende cel veranderen4,5,6. EV's worden geïnternaliseerd via meerdere paden; de exacte mechanismen zijn echter niet nauwkeurig aangetoond.
De meerderheid van de EV-opnametests, zoals genetische tagging, labelt fluorescerend individuele EV's7. Het resulterende signaal kan worden gemeten met een microplaatfotometer, flowcytometrie of microscopie, waarbij elke technologie aanzienlijke beperkingen heeft. Microplaatfotometers, flowcytometrie of standaard tweedimensionale (2D) microscopie kunnen geen onderscheid maken tussen geïnternaliseerde en oppervlakkig bevestigde EV's8,9. Bovendien kan de noodzakelijke monstervoorbereiding voor elk van deze technieken extra problemen met zich meebrengen voor de evaluatie van de ev-opname. Het opheffen van aangehechte cellen met trypsine vóór ev-opnameanalyse kan bijvoorbeeld enkele oppervlakkig gehechte EV's op het oppervlak van de cel splijten10,11. Trypsine kan ook interageren met het celoppervlak, waardoor het cel- en EV-fenotype wordt beïnvloed. Bovendien kan trypsine oppervlakkige EV's niet volledig losmaken, waardoor geïsoleerde populaties scheeftrekken.
Om EV's nauwkeurig te labelen met fluorescerende kleurstoffen, zijn extra wasstappen nodig om de resterende kleurstof7 te verwijderen. Geaccepteerde isolatietechnieken kunnen ook bijdragen aan vals-positieve signalen als gevolg van stolling die optreedt tijdens EV-isolatie. Seriële ultracentrifugatie (UC) wordt bijvoorbeeld veel gebruikt om EV's te isoleren en de geïmmobiliseerde kleurstof te verwijderen. UC kan echter ev's co-neerslaan en de resterende kleurstof kan leiden tot een vals-positief signaal12,13. Andere nanofiltratiemethoden, zoals kolomgebaseerde filtratie, worden ook veel gebruikt voor niet-geïmmobiliseerde kleurstofverwijdering. De complexe aard van EV's en kleurstof die binnen de kolommatrix interageren, kan leiden tot onvolledige verwijdering van resterende kleurstof als gevolg van de moleculaire afsnijding van de kolom die wordt gewijzigd door de complexe input14,15,16.
Het huidige protocol stelt een op nanofiltratie gebaseerd microfluïdisch apparaat voor om fluorescerend gelabelde geïsoleerde EV's te isoleren en te wassen. Het op nanofiltratie gebaseerde microfluïdische apparaat kan efficiënte filtratie bieden via vloeistofondersteunde scheidingstechnologie (FAST)17,18. FAST vermindert de drukval over het filter, waardoor de potentiële aggregatie tussen EV's en kleurstoffen wordt verminderd. Door restkleurstof efficiënt te verwijderen, is het mogelijk om de kwaliteit van fluorescerend gelabelde EV's en de specificiteit van de test te verbeteren.
Confocale microscopie kan onderscheid maken tussen geïnternaliseerde en oppervlakkig gehechte EV's op het celoppervlak en de cellulaire mechanismen van EV-opname uitgebreid onderzoeken in een spatiotemporale resolutie19,20,21,22,23,24,25. Sung et al. beschreven bijvoorbeeld de visualisatie van de exosoomlevenscyclus met behulp van hun ontwikkelde live-cell reporter. De locatie van de geïnternaliseerde EV's werd gedetecteerd en geanalyseerd met behulp van een confocale microscoop in driedimensionale (3D) en post-beeldverwerkingstools20. Hoewel de grootte van kleine EV's (40-200 nm) onder de resolutiegrens van de optische microscoop ligt, kunnen de fluorescerend gelabelde EV's worden gedetecteerd door confocale microscopie, omdat de fotodetector de verhoogde fluorescentie-emissie kan detecteren. Daarom kan de subcellulaire lokalisatie van de fluorescerend gelabelde EV's in een cel nauwkeurig worden bepaald door meerdere z-gestapelde beelden van de EV's en de omliggende cellulaire organellen te verkrijgen.
Daarnaast kunnen 3D-reconstructie en post-dataverwerking meer inzicht geven in de positionering van de geïnternaliseerde, oppervlakkige en vrij zwevende EV's. Door deze processen te gebruiken in combinatie met de time-lapse live-cell imaging die wordt aangeboden door confocale microscopie, kan het niveau van EV-opname nauwkeurig worden geëvalueerd en is het real-time volgen van EV-opname ook mogelijk. Verder kan ev-trafficking-analyse worden uitgevoerd met behulp van confocale microscopie door de co-lokalisatie van EV's met organellen te beoordelen, een eerste stap om te bepalen hoe geïnternaliseerde EV's betrokken zijn bij de intracellulaire functie. Dit protocol beschrijft de methodologie voor het uitvoeren van een EV-opnametest met behulp van het op nanofiltratie gebaseerde microfluïdische apparaat17,26, confocale microscopie en post-image analyse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>353038</td>
			<td>Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Orange CMTMR Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C2927</td>
			<td>Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Apo Lambda S 40XC WI</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77400</td>
			<td>Objective for confocal imaging, NA=1.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo VC 20X</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD70200</td>
			<td>Objective for confocal imaging, NA=0.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exodisc</td>
			<td>Labspinner Inc.</td>
			<td>EX-D1001</td>
			<td>A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoDiscovery</td>
			<td>Labspinner Inc.</td>
			<td>EX-R1001</td>
			<td>Operation device for Exodisc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-depleted FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2720801</td>
			<td>Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1500-500</td>
			<td>Nutrient for cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L preadsorbed</td>
			<td>abcam</td>
			<td>&#160;ab7063</td>
			<td>Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi USA&#160;U DISH &#956;-Dish 35 mm</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td>Culture dish for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 9.7.1</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>9.7.1</td>
			<td>Post-image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer</td>
			<td>Live Cell Instrument</td>
			<td>TU-O-20</td>
			<td>Incubator system for live cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Camera for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Inverted microscope for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 4.50.00</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>4.50.00</td>
			<td>Image processing software for Nikon microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA, NanoSight NS500</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>NS500</td>
			<td>Measurement device for EV concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 2020</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td>9.7.0.185</td>
			<td>Graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Antibiotics for cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21875034</td>
			<td>Cell culture media for PC3 cell line cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solution in DMSO</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S32703</td>
			<td>RNA staining fluorescent dye for the EV labeling</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extracellular vesicle uptake assay via confocal microscope imaging analysis

Er is behoefte aan praktische testen om de extracellulaire vesikelopname (EV) van de cellen te visualiseren en te kwantificeren. EV-opname speelt een rol in intercellulaire communicatie in verschillende onderzoeksgebieden; kankerbiologie, neurowetenschappen en medicijnafgifte. Veel EV-opnametests zijn gerapporteerd in de literatuur; er is echter een gebrek aan praktische, gedetailleerde experimentele methodologie. Ev-opname kan worden beoordeeld door EV's fluorescerend te labelen om hun locatie in cellen te detecteren. Onderscheid maken tussen geïnternaliseerde EV's in cellen en de oppervlakkige EV's op cellen is moeilijk, maar cruciaal, om de EV-opname nauwkeurig te bepalen. Daarom wordt in dit werk een test voorgesteld die de opname van EV efficiënt kwantificeert door middel van driedimensionale (3D) fluorescentie confocale microscopie. Fluorescerend gelabelde EV's werden voorbereid met behulp van een op nanofiltratie gebaseerd microfluïdisch apparaat, gevisualiseerd door 3D confocale microscopie en vervolgens geanalyseerd via geavanceerde beeldverwerkingssoftware. Het protocol biedt een robuuste methodologie voor het analyseren van EV's op cellulair niveau en een praktische aanpak voor efficiënte analyse.

Met behulp van een op nanofiltratie gebaseerd microfluïdisch apparaat werden EV's geïsoleerd uit PC3 CCM en gelabeld met een fluorofoor-geconjugeerd EV-specifiek (CD63) antilichaam (figuur 1). De gelabelde EV's werden met succes gevisualiseerd door de 3D confocale microscopie (figuur 2). De gelabelde EV's werden gedurende enkele uren geïncubeerd met cellen in exosoom-uitgeputte media. Na incubatie werden cellen gewassen met exosoom uitgeputte media. De rester...

Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis at JoVE.com

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Extracellulaire blaasjes (EV's) dragen bij aan cellulaire biologie en intercellulaire communicatie. Er is behoefte aan praktische testen om de opname van EV's door de cellen te visualiseren en te kwantificeren. Het huidige protocol stelt de EV-opnametest voor door gebruik te maken van driedimensionale fluorescentiebeeldvorming via confocale microscopie, na EV-isolatie door een op nanofiltratie gebaseerd microfluïdisch apparaat.

Extracellulaire vesikelopnametest via confocale microscoopbeeldvormingsanalyse

There is a need for practical assays to visualize and quantify the cells' extracellular vesicle (EV) uptake. EV uptake plays a role in intercellular ...

Dit protocol biedt een robuuste methodologie voor het analyseren van EV's op cellulair niveau en een praktische aanpak voor efficiënte EV-opname en EV-trackinganalyse. Deze methode van EV-etikettering elimineert co-neerslag van EV's en kleurstof, waardoor de EV-signalen worden verbeterd. Ev-opname wordt gemeten door volumetrische analyse om de geïnternaliseerde EV's te onderscheiden van de oppervlakkige EV's.EV's zijn actieve lading, dus hun opname maakt de overdracht van biochemische moleculen mogelijk. Voor onderzoek naar EV-gebaseerde medicijnafgifte en kankertherapie kan deze techniek een beoordelingsinstrument zijn. EV-opname speelt een rol in intercellulaire communicatie en wordt onderzocht in verschillende onderzoeksgebieden, zoals kankerbiologie, neurowetenschappen en medicijnafgifte.Dit protocol vergemakkelijkt mogelijk een efficiënte EV-opnametest. Injecteer voor de isolatie van extracellulaire blaasjes of EV's één milliliter voorbewerkte celkweekmedia in de monsterkamer van het op nanofiltratie gebaseerde microfluïdische apparaat. Om het apparaat te bedienen, draait u het apparaat in de benchtop spinmachine met 3000 RPM gedurende 10 minuten.Verwijder na het draaien de vloeistof uit de afvalkamer door te pipetteren of aan te zuigen en herhaal deze procedure vervolgens twee keer voor het verwerken van nog eens twee milliliter van de celkweekmedia. Om vervolgens de geïsoleerde EV's te wassen, injecteert u één milliliter PBS in de monsterkamer en draait u het apparaat in de benchtop-spinmachine. Injecteer voor immunofluorescentie-etikettering van de EV's één microgram per milliliter ev-specifiek antilichaam in het elutiegat van het apparaat dat 100 microliter geïsoleerde EV's bevat.Incubeer vervolgens gedurende een uur in het donker op een platenschudder om de gelijkmatige verdeling van het antilichaam over het monster te garanderen. Bevestig vervolgens een plakband op het elutiegat. Injecteer één milliliter PBS in de monsterkamer om resterende antilichamen uit te spoelen en draai het apparaat vervolgens totdat de monsterkamer leeg is.Herhaal de was door nog een milliliter PBS in de monsterkamer te injecteren en het apparaat te laten draaien zoals eerder is aangetoond. Nadat u de restvloeistof uit de kamer hebt verwijderd, pipettert u de fluorescerend gelabelde EV's uit de membraankamer in een amberkleurige buis of microbuis. Bescherm de buis tegen licht tot gebruik.Zaai vier keer 10 tot de vierde PC3-cellen in een schaal van 35 milliliter met één milliliter media. Laat de cellen zich 's nachts hechten in optimale celkweekomstandigheden. Was de volgende dag de aangehechte cellen tweemaal met exosoom-uitgeputte media.Na het verdunnen van de fluorescerend gelabelde EV's tot de juiste concentratie met behulp van exosoom-uitgeputte media, voegt u de verdunde EV's toe aan de gehechte doelcellen en incubeert u gedurende de gewenste experimentele tijd. Na het verwijderen van niet-geïnternaliseerde EV's door de cellen driemaal te wassen met exosoomvrije media, labelt u het cytoplasma van de aangehechte cellen met één microgram per milliliter CMTMR en incubeert u in optimale celkweekomstandigheden. Voor levende celbeeldvorming plaatst u de voorbereide cellen in de incubator op het podium.Nadat u de beeldvormingsparameters hebt ingesteld op basis van controlemonsters, bepaalt u de diepte van de doelcellen en het bereik van de stapelgrootte in de Z-richting om 3D-confocale afbeeldingen te verkrijgen en stelt u vervolgens de beeldacquisitie in op meerdere Z-gestapelde afbeeldingen van zowel celspecifieke kleurstof als EV-specifieke kleurstof tegelijkertijd. Gebruik voor beeldverwerking automatische beeldverwerkingssoftware. Als u virtuele oppervlakken van de cellen wilt bouwen, klikt u op Nieuwe oppervlakken toevoegen.Als u de virtuele celoppervlakken wilt configureren, klikt u op de knop Toevoegen en selecteert u Kwaliteit als filtertype. Drempelwaarde voor de juiste waarde voor de lage limiet door visuele inspectie, stel de maximumwaarde voor de bovengrens in en klik op de knop Voltooien Volgende, om de virtuele stippen van de EV's te bouwen, klikt u op de knop Nieuwe spots toevoegen. Selecteer onder Algoritme-instellingen de optie Verschillende spotgroottes en Berekening van de kortste afstand, klik vervolgens op Volgende en selecteer Kanaal 1 Alexa Fluor 488 als bronkanaal.Voer de juiste waarde in voor de geschatte XY-diameter onder Spotdetectie en klik op Volgende. Als u de virtuele EV-stippen wilt configureren, klikt u op de knop Toevoegen en selecteert u Kwaliteit als filtertype. Stel de onderste drempel in door een visuele inspectie en klik op Volgende Voor het type spotgebieden selecteert u Absolute intensiteit en klikt u op Volgende.Als u het gebied van EV-stippen wilt drempelwaarden, voert u de juiste waarde in voor Regiodrempel bij visuele inspectie. Selecteer Diameter van onder Regiovolume en klik op Voltooien. Als u de gegroepeerde plekken in het gebouwde oppervlak wilt splitsen, klikt u op De bouwvlekken en gaat u naar Filters.Klik vervolgens op de knop Toevoegen en selecteer Kortste afstand tot oppervlakken, Surfaces Surface 1 als filtertype. Nadat u de laagste drempel voor de lage limiet en de juiste waarde voor de bovengrens hebt ingesteld, klikt u op de knop Sectie dupliceren naar de nieuwe spots. Voor het automatisch tellen van EV's in de cellen klikt u op de selectie Gebouwde spots 1, gaat u naar Statistieken en exporteert u de waarde uit het totale aantal spots.Als u het aantal cellen wilt ophalen, klikt u op De gebouwde oppervlakken 1, gaat u naar Statistieken en exporteert u de waarde van Totaal aantal oppervlakken uit Totaal. Ga ten slotte naar het tabblad Gedetailleerd onder Statistieken om het volume te exporteren. EV's geïsoleerd uit PC3-celkweekmedia met behulp van een op nanofiltratie gebaseerd microfluïdisch apparaat werden gelabeld met een fluor-4-geconjugeerd EV-specifiek antilichaam en gevisualiseerd met behulp van 3D confocale microscopie.De geïnternaliseerde EV's werden gevisualiseerd als puncta en een individuele EV.Post verwerking van deze beelden maakt de visualisatie en kwantificering van EV-internalisatie in de cellen mogelijk. De resultaten van de EV-opnametest geven aan dat het niveau van EV-opname afhankelijk is van de lengte van de incubatietijd. Het aantal geïnternaliseerde EV's kan worden genormaliseerd naar het ontvangende celvolume om de werkelijke snelheid van EV-opname voor de opgegeven cel te bepalen.Deze procedure maakt het mogelijk om niet-geïnternaliseerde EV's systematisch uit te sluiten om het aantal geïnternaliseerde EV's nauwkeurig te meten. De grootteverdeling van geïnternaliseerde EV-stippen wordt hier weergegeven. Dus de belangrijkste stappen zijn het gebruik van het microfluïdische apparaat voor EV-etikettering, het minimaliseren van achtergrondfluorescentie bij het visualiseren van fluorescerende EV's en vervolgens de post-imaging analyse om geïnternaliseerde versus oppervlakkige EV's te bepalen.Dus intracellulaire EV-tracking kan in realtime op een 3D-vlak worden uitgevoerd, en bovendien kan EV-trafficking-analyse op ruimtelijke / temporele resoluties en de co-lokalisatie van EV's met subcellulaire organellen worden bereikt. We geloven dus dat deze techniek een eenvoudigere, efficiëntere manier biedt om EV's te onderzoeken binnen de intra- en extracellulaire matrices voor onderzoekers binnen het cellulaire communicatieveld voor EV's.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Unit 1

Endocytosis and Exocytosis

SCIENTISTS IN ACTION

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Een goede verzorging en reiniging van de microscoop

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Major Components of the Light Microscope

Belangrijke componenten van de lichtmicroscoop

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Een Neuronale en astrocyte co-cultuur assay voor High Content Analysis van neurotoxiciteit

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluorescentie-gebaseerde waardering van Store-bediende Calcium Entry in levende cellen: van Cultured Cancer Cell op Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

LDL Cholesterol opname Assay met behulp van levende cellen Imaging analyse met mobiele gezondheidsmonitoring

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...

Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization by Nano-Flow Cytometry

Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization door Nano-Flow Cytometry

Single particle characterization has become increasingly relevant for research into extracellular vesicles, progressing from bulk analysis techniques and ...

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

Analyse van extracellulaire vesicle-gemedieerde vasculaire calcificatie met behulp van in vitro en in vivo modellen

Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world, and vascular calcification is the most significant predictor of cardiovascular events; ...

Multimodal Analytical Platform on a Multiplexed Surface Plasmon Resonance Imaging Chip for the Analysis of Extracellular Vesicle Subsets

Multimodaal analytisch platform op een multiplexed surface plasmon resonance imaging chip voor de analyse van extracellulaire vesikel subsets

Extracellular vesicles (EVs) are membrane-derived, tiny vesicles produced by all cells that range from 50 to several hundreds of nanometers in diameter ...

Imaging of Mitochondrial Peroxide in Living Yeast Cells Using mtHyper7

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Advancing Mitochondrial Research Â– mtHyper7 Biosensor for Subcellular Analysis (Video) | JoVE

Beeldvorming van mtHyPer7, een ratiometrische biosensor voor mitochondriaal peroxide, in levende gistcellen

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...

Intravital Imaging Using an Inverted Microscope to Track Skin Cell Dynamics

Streamlined Intravital Imaging Approach for Long-Term Monitoring of Epithelial Tissue Dynamics on an Inverted Confocal Microscope

Developing a Tool for Using Inverted Confocal Microscopes for In Vivo Intravital Imaging (Video) | JoVE

Gestroomlijnde intravitale beeldvormingsbenadering voor langetermijnmonitoring van de dynamiek van epitheelweefsel op een omgekeerde confocale microscoop

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It ...