Name: extracellular vesicle uptake assay via confocal microscope imaging analysis
Uploaded: 2022-02-14T13:00:00
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Diese Arbeit wurde durch NGI-Fördernummern unterstützt. U54CA143803, CA163124, CA093900 und CA143055 an K. J. P. Diese Forschung wurde durch einen Zuschuss des Korea Health Technology R&D Project durch das Korea Health Industry Development Institute (KHIDI) unterstützt, das vom Ministerium für Gesundheit und Soziales der Republik Korea finanziert wurde (Fördernummer: HI19C1122). Arbeiten von J. Kim und Y.-K. Cho wurde vom Institute for Basic Science (IBS-R020-D1) unterstützt, das von der koreanischen Regierung finanziert wurde. Die Autoren danken den aktuellen und ehemaligen Mitgliedern des Brady Urological Institute, insbesondere den Mitgliedern des Pienta-Amend-Labors, für die kritische Lektüre des Manuskripts.

1. EV-Isolierung und On-Chip-Immunfluoreszenz-EV-Markierung
<ol><li>Sammlung von Zellkulturmedien (CCM) und Vorverarbeitung von CCM zur EV-Isolierung<ol>
<li>Seed PC3-Zellen bei 30% Konfluenz in einem 75 cm2 Zellkulturkolben. Lassen Sie Die Kontrollzellen in Standardmedien und zelllinienspezifischen Nahrungsergänzungsmitteln auf 90% Konfluenz (~ 48 h) wachsen. HINWEIS: Um zu verhindern, dass EV-haltige Komponenten die zelluläre Aufnahme beeinflussen (z. B. fötales Rinderserum), verwenden Sie exosomenar...

<ol>
	<li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+Ectosomes+in+Intercellular+Communication.">Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication.</a> Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).</li><li>Sunkara, V., Woo, H. -. K., Cho, Y. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+techniques+in+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles+and+their+roles+in+cancer+diagnostics+and+prognostics.">Emerging techniques in the isolation and characterization of extracellular vesicles and their roles in cancer diagnostics and prognostics.</a> The Analyst. 141 (2), 371-381 (2016).</li><li>Kalluri, R., Lebleu, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology,+function,+and+biomedical+applications+of+exosomes.">The biology, function, and biomedical applications of exosomes.</a> Science. 367 (6478), (2020).</li><li>Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificities+of+secretion+and+uptake+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+cell-to-cell+communication.">Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).</li><li>Bonsergent, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+characterization+of+extracellular+vesicle+uptake+and+content+delivery+within+mammalian+cells.">Quantitative characterization of extracellular vesicle uptake and content delivery within mammalian cells.</a> Nature Communications. 12, 1864 (2021).</li><li>Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routes+and+mechanisms+of+extracellular+vesicle+uptake.">Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).</li><li>Dehghani, M., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+extracellular+vesicles.">Fluorescent labeling of extracellular vesicles.</a> Methods Enzymology. 645, 15-42 (2020).</li><li>Ragni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovative+Visualization+and+Quantification+of+Extracellular+Vesicles+Interaction+with+and+Incorporation+in+Target+Cells+in+3D+Microenvironments.">Innovative Visualization and Quantification of Extracellular Vesicles Interaction with and Incorporation in Target Cells in 3D Microenvironments.</a> Cells. 9 (5), 1180 (2020).</li><li>Saari, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLIM+reveals+alternative+EV-mediated+cellular+up-take+pathways+of+paclitaxel.">FLIM reveals alternative EV-mediated cellular up-take pathways of paclitaxel.</a> Journal of Controlled Release. 284, 133-143 (2018).</li><li>Franzen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Uptake+and+Internalization+of+Exosomes+by+Bladder+Cancer+Cells.">Characterization of Uptake and Internalization of Exosomes by Bladder Cancer Cells.</a> BioMed Research International. 2014, 619829 (2014).</li><li>Feng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Internalization+of+Exosomes+Occurs+Through+Phagocytosis.">Cellular Internalization of Exosomes Occurs Through Phagocytosis.</a> Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).</li><li>Hoen, E. N. M. N. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+qualitative+flow+cytometric+analysis+of+nanosized+cell-derived+membrane+vesicles.">Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).</li><li>Van Der Vlist, E. J., Nolte-'T Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry.">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).</li><li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+Exosome+Isolation+Techniques.">Progress in Exosome Isolation Techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+perspective+on+exosome+isolation+-+efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics.">and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li><li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+distinct+exosome+subpopulations:+isolation+and+characterization+approaches+and+their+associated+challenges.">Separation of distinct exosome subpopulations: isolation and characterization approaches and their associated challenges.</a> The Analyst. 146 (12), 3731-3749 (2021).</li><li>Woo, H. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exodisc+for+Rapid,+Size-Selective,+and+Efficient+Isolation+and+Analysis+of+Nanoscale+Extracellular+Vesicles+from+Biological+Samples.">Exodisc for Rapid, Size-Selective, and Efficient Isolation and Analysis of Nanoscale Extracellular Vesicles from Biological Samples.</a> ACS Nano. 11 (2), 1360-1370 (2017).</li><li>Kim, T. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAST:+Size-Selective,+Clog-Free+Isolation+of+Rare+Cancer+Cells+from+Whole+Blood+at+a+Liquid-Liquid+Interface.">FAST: Size-Selective, Clog-Free Isolation of Rare Cancer Cells from Whole Blood at a Liquid-Liquid Interface.</a> Analytical Chemistry. 89 (2), 1155-1162 (2017).</li><li>Joshi, B. S., De Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+of+Extracellular+Vesicles+and+Release+of+Their+Cargo+from+Endosomes.">Endocytosis of Extracellular Vesicles and Release of Their Cargo from Endosomes.</a> ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).</li><li>Sung, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+live+cell+reporter+of+exosome+secretion+and+uptake+reveals+pathfinding+behavior+of+migrating+cells.">A live cell reporter of exosome secretion and uptake reveals pathfinding behavior of migrating cells.</a> Nature Communications. 11, 2092 (2020).</li><li>Heusermann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+surf+on+filopodia+to+enter+cells+at+endocytic+hot+spots,+traffic+within+endosomes,+and+are+targeted+to+the+ER.">Exosomes surf on filopodia to enter cells at endocytic hot spots, traffic within endosomes, and are targeted to the ER.</a> Journal of Cell Biology. 213 (2), 173-184 (2016).</li><li>Reclusa, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+extracellular+vesicles+visualization:+From+static+to+motion.">Improving extracellular vesicles visualization: From static to motion.</a> Scientific Reports. 10, 6494 (2020).</li><li>Verweij, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Tracking+of+Inter-organ+Communication+by+Endogenous+Exosomes+In+Vivo.">Live Tracking of Inter-organ Communication by Endogenous Exosomes In Vivo.</a> Developmental Cell. 48 (4), 573-589 (2019).</li><li>Lai, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+tracking+of+tumour+extracellular+vesicle+delivery+and+RNA+translation+using+multiplexed+reporters.">Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters.</a> Nature Communications. 6, 7029 (2015).</li><li>Durak-Kozica, M., Baster, Z., Kubat, K., St&#281;pie&#324;, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+visualization+of+extracellular+vesicle+uptake+by+endothelial+cells.">3D visualization of extracellular vesicle uptake by endothelial cells.</a> Cellular &amp; Molecular Biology Letters. 23, 57 (2018).</li><li>Sunkara, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+Automated,+Label-Free+Isolation+of+Extracellular+Vesicles+from+Whole+Blood+for+Cancer+Diagnosis+and+Monitoring.">Fully Automated, Label-Free Isolation of Extracellular Vesicles from Whole Blood for Cancer Diagnosis and Monitoring.</a> Theranostics. 9 (7), 1851-1863 (2019).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+trophoblastic+small+extracellular+vesicles+and+detection+of+their+miRNA+cargo+in+P-bodies.">Internalization of trophoblastic small extracellular vesicles and detection of their miRNA cargo in P-bodies.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1812261 (2020).</li><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+evaluation+of+methods+for+small+extracellular+vesicles+separation+from+human+plasma,+urine+and+cell+culture+medium.">Comprehensive evaluation of methods for small extracellular vesicles separation from human plasma, urine and cell culture medium.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10, 12044 (2020).</li></ol>

Ein EV-Aufnahmeassay, der auf 3D-Fluoreszenzbildgebung mittels konfokaler Mikroskopie basiert, bietet eine effiziente Methodik und empfindliche Analyse. Diese fluoreszierende EV-Markierung erleichtert die Visualisierung von Elektrofahrzeugen und führt erfolgreich einen präzisen EV-Aufnahmeassay durch. Frühere Methoden zur Kennzeichnung von Elektrofahrzeugen und zur Entfernung des Restfarbstoffs wurden durch Entfernen der Fällung mittels Ultrazentrifugation (UC) berichtet; UC kann jedoch EVs mitausfällen, un...

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind nanogroße, lipidmembrangebundene Partikel, die nach ihren Größen kategorisiert werden: Ektosomen (100-500 nm) und Exosomen (50-150 nm)1. EVs enthalten verschiedene Biomoleküle wie Proteine, Nukleinsäuren und Lipide. Diese Biomoleküle stammen aus den Zellen, bevor sie als Fracht eingekapselt und über EVs in den extrazellulären Raum freigesetzt werden1,2,3.
Aufgrund der Vielfalt ihrer Ladung wird angenommen, dass Elektrofahrzeuge eine aktive Rolle in der interzellulären Kommunikation spielen. Die Freisetzung und Aufnahme von EVs durch Zellen ermöglicht den Transfer von Biomolekülen zwischen den Zellen4,5. Die Einführung von EV-Ladung in eine Zelle kann die Funktionen und den homöostatischen Zustand der Empfängerzelle verändern4,5,6. EVs werden über mehrere Wege verinnerlicht; Die genauen Mechanismen wurden jedoch nicht genau demonstriert.
Die Mehrheit der EV-Aufnahmeassays, wie z. B. genetische Markierungen, markiert fluoreszierend einzelne EVs7. Das resultierende Signal kann per Mikroplattenphotometer, Durchflusszytometrie oder Mikroskopie gemessen werden, wobei jede Technologie erhebliche Einschränkungen aufweist. Mikroplattenphotometer, Durchflusszytometrie oder zweidimensionale Standardmikroskopie (2D) können nicht zwischen internalisierten und oberflächlich angebrachten EVs unterscheiden8,9. Darüber hinaus kann die notwendige Probenvorbereitung für jede dieser Techniken zusätzliche Probleme bei der Bewertung der EV-Aufnahme mit sich bringen. Zum Beispiel kann das Anheben von anhaftenden Zellen mit Trypsin vor der EV-Aufnahmeanalyse einige oberflächlich angebrachte EVs auf der Zelloberfläche spalten10,11. Trypsin kann auch mit der Zelloberfläche interagieren und den Zell- und EV-Phänotyp beeinflussen. Darüber hinaus kann Trypsin oberflächliche EVs nicht vollständig lösen, wodurch isolierte Populationen verzerrt werden.
Um EVs genau mit Fluoreszenzfarbstoffen zu kennzeichnen, sind zusätzliche Waschschritte erforderlich, um den Restfarbstoff zu entfernen7. Akzeptierte Isolationstechniken können auch zu falsch-positiven Signalen aufgrund der Koagulation beitragen, die während der EV-Isolierung auftritt. Zum Beispiel wird die serielle Ultrazentrifugation (UC) häufig verwendet, um EVs zu isolieren und den immobilisierten Farbstoff zu entfernen. UC kann jedoch EVs mitverfälschen, und der Restfarbstoff kann zu einem falsch-positiven Signal führen12,13. Andere Nanofiltrationsmethoden, wie die säulenbasierte Filtration, werden ebenfalls häufig für die nicht immobilisierte Farbstoffentfernung verwendet. Die komplexe Natur von EVs und Farbstoffen, die innerhalb der Säulenmatrix interagieren, kann zu einer unvollständigen Entfernung des Restfarbstoffs führen, da der molekulare Cut-off der Säule durch den komplexen Input verändert wird14,15,16.
Das aktuelle Protokoll schlägt ein nanofiltrationsbasiertes mikrofluidisches Gerät vor, um fluoreszenzmarkierte isolierte EVs zu isolieren und zu waschen. Das auf Nanofiltration basierende mikrofluidische Gerät kann eine effiziente Filtration über die flüssigkeitsunterstützte Trenntechnologie (FAST)17,18 ermöglichen. FAST reduziert den Druckabfall über den Filter und reduziert so die potenzielle Aggregation zwischen Elektrofahrzeugen und Farbstoffen. Durch die effiziente Entfernung von Restfarbstoffen ist es möglich, die Qualität fluoreszenzmarkierter EVs und die Spezifität des Assays zu verbessern.
Die konfokale Mikroskopie kann zwischen internalisierten und oberflächlich angebrachten EVs auf der Zelloberfläche unterscheiden und die zellulären Mechanismen der EV-Aufnahme in einer raumzeitlichen Auflösung umfassend untersuchen19,20,21,22,23,24,25. Zum Beispiel beschrieben Sung et al. die Visualisierung des Exosomen-Lebenszyklus mit ihrem entwickelten Live-Cell-Reporter. Die Position der verinnerlichten EVs wurde mit einem konfokalen Mikroskop in dreidimensionalen (3D) und Post-Bildverarbeitungswerkzeugen erkannt und analysiert20. Obwohl die Größe kleiner EVs (40-200 nm) unter der Auflösungsgrenze des optischen Mikroskops liegt, können die fluoreszenzmarkierten EVs durch konfokale Mikroskopie nachgewiesen werden, da der Photodetektor die verstärkte Fluoreszenzemission nachweisen kann. Daher kann die subzelluläre Lokalisation der fluoreszenzmarkierten EVs innerhalb einer Zelle präzise bestimmt werden, indem mehrere z-gestapelte Bilder der EVs und der umgebenden Zellorganellen aufgenommen werden.
Darüber hinaus können die 3D-Rekonstruktion und die Nachdatenverarbeitung weitere Einblicke in die Positionierung der verinnerlichten, oberflächlichen und frei schwebenden Elektrofahrzeuge geben. Durch die Verwendung dieser Prozesse in Verbindung mit der Zeitraffer-Live-Cell-Bildgebung, die die konfokale Mikroskopie bietet, kann der Grad der EV-Aufnahme genau bewertet werden, und die Echtzeitverfolgung der EV-Aufnahme ist ebenfalls möglich. Darüber hinaus kann die EV-Trafficking-Analyse unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie durchgeführt werden, indem die Co-Lokalisation von EVs mit Organellen bewertet wird, ein erster Schritt, um zu bestimmen, wie internalisierte EVs an der intrazellulären Funktion beteiligt sind. Dieses Protokoll beschreibt die Methodik zur Durchführung eines EV-Aufnahmeassays unter Verwendung des nanofiltrationsbasierten mikrofluidischen Geräts17,26, der konfokalen Mikroskopie und der Post-Image-Analyse.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>353038</td>
			<td>Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Orange CMTMR Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C2927</td>
			<td>Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Apo Lambda S 40XC WI</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77400</td>
			<td>Objective for confocal imaging, NA=1.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo VC 20X</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD70200</td>
			<td>Objective for confocal imaging, NA=0.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exodisc</td>
			<td>Labspinner Inc.</td>
			<td>EX-D1001</td>
			<td>A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoDiscovery</td>
			<td>Labspinner Inc.</td>
			<td>EX-R1001</td>
			<td>Operation device for Exodisc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-depleted FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2720801</td>
			<td>Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1500-500</td>
			<td>Nutrient for cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L preadsorbed</td>
			<td>abcam</td>
			<td>&#160;ab7063</td>
			<td>Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi USA&#160;U DISH &#956;-Dish 35 mm</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td>Culture dish for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 9.7.1</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>9.7.1</td>
			<td>Post-image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer</td>
			<td>Live Cell Instrument</td>
			<td>TU-O-20</td>
			<td>Incubator system for live cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Camera for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Inverted microscope for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 4.50.00</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>4.50.00</td>
			<td>Image processing software for Nikon microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA, NanoSight NS500</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>NS500</td>
			<td>Measurement device for EV concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 2020</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td>9.7.0.185</td>
			<td>Graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Antibiotics for cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21875034</td>
			<td>Cell culture media for PC3 cell line cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solution in DMSO</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S32703</td>
			<td>RNA staining fluorescent dye for the EV labeling</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extracellular vesicle uptake assay via confocal microscope imaging analysis

Es besteht ein Bedarf an praktischen Assays, um die extrazelluläre Vesikelaufnahme (EV) der Zellen zu visualisieren und zu quantifizieren. Die Aufnahme von Elektrofahrzeugen spielt eine Rolle bei der interzellulären Kommunikation in verschiedenen Forschungsbereichen; Krebsbiologie, Neurowissenschaften und Arzneimittelabgabe. Viele EV-Aufnahmeassays wurden in der Literatur berichtet; Es fehlt jedoch an einer praktischen, detaillierten experimentellen Methodik. Die EV-Aufnahme kann durch fluoreszierende Markierung von EVs beurteilt werden, um ihre Position in Zellen zu erkennen. Die Unterscheidung zwischen internalisierten EVs in Zellen und den oberflächlichen EVs auf Zellen ist schwierig, aber kritisch, um die EV-Aufnahme genau zu bestimmen. Daher wird in dieser Arbeit ein Assay vorgeschlagen, der die EV-Aufnahme durch dreidimensionale (3D) Fluoreszenz-Konfokalmikroskopie effizient quantifiziert. Fluoreszenzmarkierte EVs wurden mit einem auf Nanofiltration basierenden mikrofluidischen Gerät hergestellt, durch konfokale 3D-Mikroskopie visualisiert und dann durch fortschrittliche Bildverarbeitungssoftware analysiert. Das Protokoll bietet eine robuste Methodik für die Analyse von Elektrofahrzeugen auf zellulärer Ebene und einen praktischen Ansatz für eine effiziente Analyse.

Unter Verwendung eines mikrofluidischen Geräts auf Nanofiltrationsbasis wurden EVs aus PC3 CCM isoliert und mit einem fluorophorkonjugierten EV-spezifischen (CD63) Antikörper markiert (Abbildung 1). Die markierten EVs wurden erfolgreich durch die konfokale 3D-Mikroskopie visualisiert (Abbildung 2). Die markierten EVs wurden mehrere Stunden lang mit Zellen in Exosomen-depletierten Medien inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen mit Exosomen-depletierten...

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Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Extrazelluläre Vesikel (EVs) tragen zur Zellbiologie und interzellulären Kommunikation bei. Es besteht ein Bedarf an praktischen Assays, um die Aufnahme von Elektrofahrzeugen durch die Zellen zu visualisieren und zu quantifizieren. Das aktuelle Protokoll schlägt den EV-Aufnahmeassay vor, indem eine dreidimensionale Fluoreszenzbildgebung mittels konfokaler Mikroskopie verwendet wird, nachdem die EV-Isolierung durch ein mikrofluidisches Gerät auf Nanofiltrationsbasis erfolgt.

Extrazellulärer Vesikelaufnahme-Assay mittels konfokaler Mikroskop-Bildgebungsanalyse

There is a need for practical assays to visualize and quantify the cells' extracellular vesicle (EV) uptake. EV uptake plays a role in intercellular ...

Dieses Protokoll bietet eine robuste Methodik für die Analyse von Elektrofahrzeugen auf zellulärer Ebene und einen praktischen Ansatz für eine effiziente EV-Aufnahme und EV-Tracking-Analyse. Diese Methode der EV-Kennzeichnung eliminiert die co-Fällung von Elektrofahrzeugen und Farbstoffen und verbessert so die EV-Signale. Die EV-Aufnahme wird durch volumetrische Analyse gemessen, um die internalisierten EVs von den oberflächlichen EVs zu unterscheiden.EVs sind aktive Fracht, daher ermöglicht ihre Aufnahme den Transfer biochemischer Moleküle. Für die Forschung zur EV-basierten Arzneimittelabgabe und Krebstherapie kann diese Technik ein Bewertungsinstrument sein. Die Aufnahme von Elektrofahrzeugen spielt eine Rolle in der interzellulären Kommunikation und wird in verschiedenen Forschungsbereichen wie Krebsbiologie, Neurowissenschaften und Arzneimittelabgabe untersucht.Dieses Protokoll ermöglicht möglicherweise einen effizienten EV-Aufnahmeassay. Zur Isolierung extrazellulärer Vesikel oder EVs wird ein Milliliter vorbearbeiteter Zellkulturmedien in die Probenkammer des nanofiltrationsbasierten mikrofluidischen Geräts injiziert. Um das Gerät zu bedienen, drehen Sie das Gerät in der Tischspinnmaschine mit 3000 U / min für 10 Minuten.Entfernen Sie nach dem Spinnen die Flüssigkeit aus der Abfallkammer durch Pipettieren oder Ansaugen und wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal, um weitere zwei Milliliter des Zellkulturmediums zu verarbeiten. Als nächstes, um die isolierten EVs zu waschen, injizieren Sie einen Milliliter PBS in die Probenkammer und drehen Sie das Gerät in der Tischspinnmaschine. Für die immunfluoreszierende Markierung der EVs wird ein Mikrogramm pro Milliliter des EV-spezifischen Antikörpers in das Elutionsloch des Geräts injiziert, das 100 Mikroliter isolierter EVs enthält.Dann eine Stunde im Dunkeln auf einem Plattenschüttler inkubieren, um die gleichmäßige Verteilung des Antikörpers über die Probe zu gewährleisten. Als nächstes befestigen Sie ein Klebeband am Elutionsloch. Injizieren Sie einen Milliliter PBS in die Probenkammer, um Restantikörper auszuwaschen, und drehen Sie dann das Gerät, bis die Probenkammer leer ist.Wiederholen Sie die Wäsche, indem Sie einen weiteren Milliliter PBS in die Probenkammer injizieren und das Gerät wie zuvor gezeigt drehen. Nachdem Sie die Restflüssigkeit aus der Kammer entfernt haben, pipettieren Sie die fluoreszierend markierten EVs aus der Membrankammer in eine bernsteinfarbene Röhre oder ein Mikrorohr. Schützen Sie die Röhre bis zum Gebrauch vor Licht.Säen Sie viermal 10 bis zur vierten PC3-Zelle in eine 35-Milliliter-Schale mit einem Milliliter-Medium. Lassen Sie die Zellen über Nacht unter optimalen Zellkulturbedingungen haften. Am nächsten Tag waschen Sie die anhaftenden Zellen zweimal mit Exosomen-depletierten Medien.Nach dem Verdünnen der fluoreszenzmarkierten EVs auf die entsprechende Konzentration unter Verwendung exosomenarmer Medien werden die verdünnten EVs zu den adhärenten Zielzellen gegeben und für die gewünschte experimentelle Zeit inkubiert. Nachdem Sie nicht internalisierte EVs durch dreimaliges Waschen der Zellen mit exosomenfreien Medien entfernt haben, markieren Sie das Zytoplasma der anhaftenden Zellen mit einem Mikrogramm pro Milliliter CMTMR und inkubieren Sie unter optimalen Zellkulturbedingungen. Für die Lebendzellbildgebung legen Sie die vorbereiteten Zellen in den Inkubator auf der Bühne.Nachdem Sie die Bildgebungsparameter basierend auf Kontrollproben festgelegt haben, bestimmen Sie die Tiefe der Zielzellen und den Bereich der Stapelgröße in Z-Richtung, um konfokale 3D-Bilder zu erfassen, und stellen Sie dann die Bildaufnahme auf mehrere Z-gestapelte Bilder von zellspezifischem Farbstoff und EV-spezifischem Farbstoff gleichzeitig ein. Verwenden Sie für die Bildverarbeitung eine automatische Bildverarbeitungssoftware. Um virtuelle Flächen der Zellen zu erstellen, klicken Sie auf Neue Flächen hinzufügen.Um die virtuellen Zellenoberflächen zu konfigurieren, klicken Sie auf die Schaltfläche Hinzufügen, und wählen Sie Qualität als Filtertyp aus. Schwellenwert für den entsprechenden Wert für den niedrigen Grenzwert durch visuelle Inspektion, legen Sie den Maximalwert für den oberen Grenzwert fest und klicken Sie auf die Schaltfläche Fertig stellen Weiter, um die virtuellen Punkte der EVs zu erstellen, klicken Sie auf die Schaltfläche Neue Spots hinzufügen. Wählen Sie unter Algorithmuseinstellungen die Option Unterschiedliche Spotgrößen und Berechnung der kürzesten Entfernung aus, klicken Sie dann auf Weiter und wählen Sie Kanal 1 Alexa Fluor 488 als Quellkanal aus.Geben Sie unter Punkterkennung den entsprechenden Wert für den geschätzten XY-Durchmesser ein und klicken Sie auf Weiter. Um die virtuellen EV-Punkte zu konfigurieren, klicken Sie auf die Schaltfläche Hinzufügen und wählen Sie Qualität als Filtertyp aus. Legen Sie den unteren Schwellenwert für eine visuelle Inspektion fest, und klicken Sie auf Weiter Für den Typ der Punktbereiche wählen Sie Absolute Intensität und dann auf Weiter.Um einen Schwellenwert für den Bereich der EV-Punkte festzulegen, geben Sie den entsprechenden Wert für Bereichsschwellenwert durch visuelle Inspektion ein. Wählen Sie unter Bereichsvolumen die Option Durchmesser von und klicken Sie auf Fertig stellen. Um die gruppierten Spots innerhalb der gebauten Oberfläche aufzuteilen, klicken Sie auf die Build Spots und gehen Sie zu Filter.Klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche Hinzufügen , und wählen Sie Kürzeste Entfernung zu Flächen, Flächen fläche 1 als Filtertyp aus. Nachdem Sie den niedrigsten Schwellenwert für den unteren Grenzwert und den entsprechenden Wert für den oberen Grenzwert festgelegt haben, klicken Sie auf die Schaltfläche Abschnitt auf die neuen Spots duplizieren. Um die EVs innerhalb der Zellen automatisch zu zählen, klicken Sie auf die Auswahl Build Spots 1, gehen Sie zu Statistik und exportieren Sie den Wert aus der Gesamtzahl der Spots.Um die Anzahl der Zellen zu ermitteln, klicken Sie auf Die erstellten Flächen 1, wechseln Sie dann zu Statistik, und exportieren Sie den Wert der Gesamtzahl der Flächen aus Gesamt. Gehen Sie schließlich zur Registerkarte Detailliert unter Statistik, um das Volume zu exportieren. EVs, die mit einem nanofiltrationsbasierten mikrofluidischen Gerät aus PC3-Zellkulturmedien isoliert wurden, wurden mit einem Fluor-4-konjugierten EV-spezifischen Antikörper markiert und mittels konfokaler 3D-Mikroskopie visualisiert.Die internalisierten EVs wurden als puncta visualisiert und eine individuelle EV.Post-Verarbeitung dieser Bilder ermöglicht die Visualisierung und Quantifizierung der EV-Internalisierung in die Zellen. Die Ergebnisse des EV-Aufnahmetests deuten darauf hin, dass das Niveau der EV-Aufnahme von der Länge der Inkubationszeit abhängt. Die Anzahl der internalisierten EVs kann auf das Empfängerzellvolumen normalisiert werden, um die tatsächliche Rate der EV-Aufnahme für die angegebene Zelle zu bestimmen.Dieses Verfahren ermöglicht den systematischen Ausschluss von nicht internalisierten Elektrofahrzeugen, um die Anzahl der internalisierten Elektrofahrzeuge genau zu messen. Die Größenverteilung der verinnerlichten EV-Punkte ist hier dargestellt. Die wichtigsten Schritte sind also die Verwendung des mikrofluidischen Geräts für die EV-Markierung, die Minimierung der Hintergrundfluoreszenz bei der Visualisierung fluoreszierender EVs und dann die Post-Imaging-Analyse zur Bestimmung von internalisierten gegenüber oberflächlichen EVs.So kann intrazelluläres EV-Tracking in Echtzeit auf einer 3D-Ebene durchgeführt werden, und zusätzlich kann eine EV-Trafficking-Analyse auf räumlichen/zeitlichen Auflösungen und die Co-Lokalisierung von EVs mit subzellulären Organellen erreicht werden. Wir glauben daher, dass diese Technik eine einfachere und effizientere Möglichkeit bietet, EVs innerhalb der intra- und extrazellulären Matrizen für Forscher im Bereich der zellulären Kommunikation für EVs zu untersuchen.

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Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

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