Name: extracellular vesicle uptake assay via confocal microscope imaging analysis
Uploaded: 2022-02-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי NCI מענק nos. U54CA143803, CA163124, CA093900 ו- CA143055 ל- K. J. P. מחקר זה נתמך על ידי מענק של פרויקט מו"פ טכנולוגיית הבריאות של קוריאה באמצעות המכון לפיתוח תעשיית הבריאות בקוריאה (KHIDI), במימון משרד הבריאות והרווחה, הרפובליקה של קוריאה (מספר מענק: HI19C1122). עבודה של ג'יי קים וי-קיי. צ'ו נתמך על ידי המכון למדע בסיסי (IBS-R020-D1), במימון ממשלת קוריאה. המחברים מודים לחברי המכון האורולוגי הנוכחי והעבר של המכון האורולוגי בריידי, במיוחד חברי המעבדה פינטה-תיקון, על הקריאה הביקורתית של כתב היד.

1. בידוד EV ותיוג EV אימונו-פלואורסצנטי על שבב
<ol><li>איסוף מדיה של תרבית תאים (CCM) ועיבוד מקדים של CCM לבידוד EV<ol>
<li>תאי PC3 זרע ב 30% השפעה בבקבוק תרבית תאים 75 ס"מ2 . אפשר לתאי בקרה לגדול ל-90% השפעה (~48 שעות) בתוספי מדיה סטנדרטיים ותוספי מזון ספציפיים לקו התא. הערה: כדי למנוע מרכיבים המכילים EV להש?...

<ol>
	<li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+Ectosomes+in+Intercellular+Communication.">Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication.</a> Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).</li><li>Sunkara, V., Woo, H. -. K., Cho, Y. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+techniques+in+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles+and+their+roles+in+cancer+diagnostics+and+prognostics.">Emerging techniques in the isolation and characterization of extracellular vesicles and their roles in cancer diagnostics and prognostics.</a> The Analyst. 141 (2), 371-381 (2016).</li><li>Kalluri, R., Lebleu, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology,+function,+and+biomedical+applications+of+exosomes.">The biology, function, and biomedical applications of exosomes.</a> Science. 367 (6478), (2020).</li><li>Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificities+of+secretion+and+uptake+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+cell-to-cell+communication.">Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).</li><li>Bonsergent, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+characterization+of+extracellular+vesicle+uptake+and+content+delivery+within+mammalian+cells.">Quantitative characterization of extracellular vesicle uptake and content delivery within mammalian cells.</a> Nature Communications. 12, 1864 (2021).</li><li>Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routes+and+mechanisms+of+extracellular+vesicle+uptake.">Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).</li><li>Dehghani, M., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+extracellular+vesicles.">Fluorescent labeling of extracellular vesicles.</a> Methods Enzymology. 645, 15-42 (2020).</li><li>Ragni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovative+Visualization+and+Quantification+of+Extracellular+Vesicles+Interaction+with+and+Incorporation+in+Target+Cells+in+3D+Microenvironments.">Innovative Visualization and Quantification of Extracellular Vesicles Interaction with and Incorporation in Target Cells in 3D Microenvironments.</a> Cells. 9 (5), 1180 (2020).</li><li>Saari, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLIM+reveals+alternative+EV-mediated+cellular+up-take+pathways+of+paclitaxel.">FLIM reveals alternative EV-mediated cellular up-take pathways of paclitaxel.</a> Journal of Controlled Release. 284, 133-143 (2018).</li><li>Franzen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Uptake+and+Internalization+of+Exosomes+by+Bladder+Cancer+Cells.">Characterization of Uptake and Internalization of Exosomes by Bladder Cancer Cells.</a> BioMed Research International. 2014, 619829 (2014).</li><li>Feng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Internalization+of+Exosomes+Occurs+Through+Phagocytosis.">Cellular Internalization of Exosomes Occurs Through Phagocytosis.</a> Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).</li><li>Hoen, E. N. M. N. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+qualitative+flow+cytometric+analysis+of+nanosized+cell-derived+membrane+vesicles.">Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).</li><li>Van Der Vlist, E. J., Nolte-'T Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry.">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).</li><li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+Exosome+Isolation+Techniques.">Progress in Exosome Isolation Techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+perspective+on+exosome+isolation+-+efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics.">and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li><li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+distinct+exosome+subpopulations:+isolation+and+characterization+approaches+and+their+associated+challenges.">Separation of distinct exosome subpopulations: isolation and characterization approaches and their associated challenges.</a> The Analyst. 146 (12), 3731-3749 (2021).</li><li>Woo, H. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exodisc+for+Rapid,+Size-Selective,+and+Efficient+Isolation+and+Analysis+of+Nanoscale+Extracellular+Vesicles+from+Biological+Samples.">Exodisc for Rapid, Size-Selective, and Efficient Isolation and Analysis of Nanoscale Extracellular Vesicles from Biological Samples.</a> ACS Nano. 11 (2), 1360-1370 (2017).</li><li>Kim, T. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAST:+Size-Selective,+Clog-Free+Isolation+of+Rare+Cancer+Cells+from+Whole+Blood+at+a+Liquid-Liquid+Interface.">FAST: Size-Selective, Clog-Free Isolation of Rare Cancer Cells from Whole Blood at a Liquid-Liquid Interface.</a> Analytical Chemistry. 89 (2), 1155-1162 (2017).</li><li>Joshi, B. S., De Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+of+Extracellular+Vesicles+and+Release+of+Their+Cargo+from+Endosomes.">Endocytosis of Extracellular Vesicles and Release of Their Cargo from Endosomes.</a> ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).</li><li>Sung, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+live+cell+reporter+of+exosome+secretion+and+uptake+reveals+pathfinding+behavior+of+migrating+cells.">A live cell reporter of exosome secretion and uptake reveals pathfinding behavior of migrating cells.</a> Nature Communications. 11, 2092 (2020).</li><li>Heusermann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+surf+on+filopodia+to+enter+cells+at+endocytic+hot+spots,+traffic+within+endosomes,+and+are+targeted+to+the+ER.">Exosomes surf on filopodia to enter cells at endocytic hot spots, traffic within endosomes, and are targeted to the ER.</a> Journal of Cell Biology. 213 (2), 173-184 (2016).</li><li>Reclusa, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+extracellular+vesicles+visualization:+From+static+to+motion.">Improving extracellular vesicles visualization: From static to motion.</a> Scientific Reports. 10, 6494 (2020).</li><li>Verweij, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Tracking+of+Inter-organ+Communication+by+Endogenous+Exosomes+In+Vivo.">Live Tracking of Inter-organ Communication by Endogenous Exosomes In Vivo.</a> Developmental Cell. 48 (4), 573-589 (2019).</li><li>Lai, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+tracking+of+tumour+extracellular+vesicle+delivery+and+RNA+translation+using+multiplexed+reporters.">Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters.</a> Nature Communications. 6, 7029 (2015).</li><li>Durak-Kozica, M., Baster, Z., Kubat, K., St&#281;pie&#324;, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+visualization+of+extracellular+vesicle+uptake+by+endothelial+cells.">3D visualization of extracellular vesicle uptake by endothelial cells.</a> Cellular &amp; Molecular Biology Letters. 23, 57 (2018).</li><li>Sunkara, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+Automated,+Label-Free+Isolation+of+Extracellular+Vesicles+from+Whole+Blood+for+Cancer+Diagnosis+and+Monitoring.">Fully Automated, Label-Free Isolation of Extracellular Vesicles from Whole Blood for Cancer Diagnosis and Monitoring.</a> Theranostics. 9 (7), 1851-1863 (2019).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+trophoblastic+small+extracellular+vesicles+and+detection+of+their+miRNA+cargo+in+P-bodies.">Internalization of trophoblastic small extracellular vesicles and detection of their miRNA cargo in P-bodies.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1812261 (2020).</li><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+evaluation+of+methods+for+small+extracellular+vesicles+separation+from+human+plasma,+urine+and+cell+culture+medium.">Comprehensive evaluation of methods for small extracellular vesicles separation from human plasma, urine and cell culture medium.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10, 12044 (2020).</li></ol>

בדיקת ספיגת EV המבוססת על הדמיית פלואורסצנטיות תלת-ממדית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית מספקת מתודולוגיה יעילה וניתוח רגיש. תיוג EV פלואורסצנטי זה מקל על הדמיה של EVs ומבצע בהצלחה בדיקה מדויקת של ספיגת EV. שיטות קודמות לתיוג EVs והסרת הצבע שיורית דווחו על ידי הסרת משקעים באמצעות ultracentrifugation...

שלשולים חוץ-תאיים (EVs) הם חלקיקים ננו-בגודל ננו, הקשורים לקרום השומנים המסווגים לפי גודלם: אקטוזומים (100-500 ננומטר) ואקסוזומים (50-150 ננומטר)1. רכבים יפים מכילים ביומולקולים שונים, כגון חלבונים, חומצות גרעין ושומנים. ביומולקולים אלה מקורם בתאים לפני שהם עטופים כמטען ומשוחררים לחלל החוץ-תאי באמצעות EVs1,2,3.
בשל מגוון המטען שלהם, רכבים חשמליים הם האמינו לשחק תפקיד פעיל בתקשורת בין תאית. שחרור וספיגה של רכבים ותשובים על ידי תאים מאפשרים העברה של biomolecules בין התאים4,5. כניסת מטען EV לתא עשויה לשנות את הפונקציות של תא הנמען ואת המצב ההומיאוסטטי4,5,6. כלי ינוי מופנמים באמצעות מסלולים מרובים; עם זאת, המנגנונים המדויקים לא הוכחו במדויק.
רוב בדיקות ספיגת EV, כגון תיוג גנטי, תווית פלואורסצנטית EVs7 בודדים. האות המתקבל יכול להימדד על ידי פוטומטר מיקרו-לוחית, ציטומטריית זרימה או מיקרוסקופיה, כאשר לכל טכנולוגיה יש מגבלות משמעותיות. מיקרו-לוח צילום, ציטומטריית זרימה או מיקרוסקופיה דו-ממדית סטנדרטית (דו-ממדית) אינם יכולים להבחין בין EVs8,9 מופנם ומוצמד באופן שטחי. בנוסף, הכנת המדגם הדרושה לכל אחת מהטכניקות הללו עשויה להכניס בעיות נוספות להערכת ספיגת EV. לדוגמה, הרמת תאים דבוקים עם טריפסין לפני ניתוח ספיגת EV עשויה לבקע כמה EVs מחוברים באופן שטחי על פני השטח של התא10,11. טריפסין עשוי גם לקיים אינטראקציה עם פני השטח של התא, המשפיעים על פנוטיפ התא ו- EV. בנוסף, טריפסין לא יכול לנתק EVs שטחי לחלוטין, מוטה אוכלוסיות מבודדות.
כדי לסמן במדויק את ה-EVs בצבעים פלואורסצנטיים, נדרשים שלבי כביסה נוספים כדי להסיר את שאריות הצבע7. טכניקות בידוד מקובלות יכולות גם לתרום לאותות חיוביים כוזבים עקב קרישה המתרחשת במהלך בידוד EV. לדוגמה, אולטרה-צנטריפוגה טורית (UC) נמצאת בשימוש נרחב כדי לבודד רכבים אופן אלקטרוני ולהסיר את הצבע משותק. עם זאת, UC עשוי לזרז את ה- EVs, והצבע השיורי עלול להוביל לאות חיובי כוזב12,13. שיטות ננו-סינון אחרות, כגון סינון מבוסס טורים, נמצאות בשימוש נרחב גם להסרת צבע לא משותק. האופי המורכב של רכבים EVs וצבע אינטראקציה בתוך מטריצת העמודה עלול להוביל הסרה חלקית של צבע שיורית עקב החתך המולקולרי של העמודה משתנה על ידי קלט מורכב14,15,16.
הפרוטוקול הנוכחי מציע מכשיר מיקרופלואידי מבוסס ננו-סינון כדי לבודד ולשטוף EVscented שכותרתו פלואורסצנטית מבודדת. ההתקן המיקרו-פלוידי מבוסס ננו-סינון יכול לספק סינון יעיל באמצעות טכנולוגיית הפרדה בסיוע נוזלים (FAST)17,18. FAST מפחית את ירידת הלחץ על-פני המסנן, ובכך מפחית את הצבירה הפוטנציאלית בין הרכבים החמוצים והצבעים. על ידי הסרת שיורי צבע ביעילות, ניתן לשפר את האיכות של EVs שכותרת פלואורסצנטית ואת הספציפיות של ה- assay.
מיקרוסקופיה קונפוקלית יכולה להבחין בין EVs מופנם ושטחי מחובר על פני התא ולחקור באופן מקיף את המנגנונים התאיים של ספיגת EV ברזולוציה spatiotemporal19,20,21,22,23,24,25. לדוגמה, סונג ואח ' תיארו את ההדמיה של מחזור החיים האקסויזום באמצעות כתב התא החי המפותח שלהם. המיקום של כלי העבודה האלקטרוניים שהופנמו זוהה ונותח באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי בכלי עיבוד תלת-ממדיים (3D) ופוסט-תמונה20. למרות שגודלם של כלי הרכב האלקטרוניים הקטנים (40-200 ננומטר) נמוך ממגבלת הרזולוציה של המיקרוסקופ האופטי, ניתן לזהות את הרכבים האלקטרוניים המסומנים באופן פלואורסצנטי על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית מכיוון שצלם הצילום יכול לזהות את פליטת הפלואורסצנטיות המשופרת. לכן, לוקליזציה תת-תאית של EVs פלואורסצנטית בתוך תא ניתן לקבוע במדויק על ידי רכישת תמונות z-stacked מרובים של EVs ואת organelles הסלולר שמסביב.
בנוסף, שחזור תלת-ממד ועיבוד לאחר נתונים יכולים לספק תובנה נוספת לגבי המיקום של הרובוטים האלקטרוניים המופנמים, השטחיים והצפים בחינם. על ידי ניצול תהליכים אלה בשילוב עם הדמיית תאים חיים בזמן לשגות המוצעת על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית, ניתן להעריך במדויק את רמת ספיגת EV, ואת המעקב בזמן אמת של ספיגת EV אפשרי גם. יתר על כן, ניתוח סחר EV יכול להתבצע באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית על ידי הערכת לוקליזציה משותפת של רכבים אופניים עם אברונים, צעד ראשון כדי לקבוע כיצד EVs מופנמים מעורבים בפונקציה התארית. פרוטוקול זה מתאר את המתודולוגיה לביצוע בדיקת ספיגת EV באמצעות התקן מיקרופלואידי מבוסס ננו-סינון17,26, מיקרוסקופיה קונפוקלית וניתוח לאחר התמונה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>353038</td>
			<td>Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Orange CMTMR Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C2927</td>
			<td>Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Apo Lambda S 40XC WI</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77400</td>
			<td>Objective for confocal imaging, NA=1.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo VC 20X</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD70200</td>
			<td>Objective for confocal imaging, NA=0.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exodisc</td>
			<td>Labspinner Inc.</td>
			<td>EX-D1001</td>
			<td>A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoDiscovery</td>
			<td>Labspinner Inc.</td>
			<td>EX-R1001</td>
			<td>Operation device for Exodisc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-depleted FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2720801</td>
			<td>Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1500-500</td>
			<td>Nutrient for cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L preadsorbed</td>
			<td>abcam</td>
			<td>&#160;ab7063</td>
			<td>Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi USA&#160;U DISH &#956;-Dish 35 mm</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td>Culture dish for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 9.7.1</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>9.7.1</td>
			<td>Post-image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer</td>
			<td>Live Cell Instrument</td>
			<td>TU-O-20</td>
			<td>Incubator system for live cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Camera for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Inverted microscope for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 4.50.00</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>4.50.00</td>
			<td>Image processing software for Nikon microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA, NanoSight NS500</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>NS500</td>
			<td>Measurement device for EV concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 2020</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td>9.7.0.185</td>
			<td>Graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Antibiotics for cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21875034</td>
			<td>Cell culture media for PC3 cell line cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solution in DMSO</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S32703</td>
			<td>RNA staining fluorescent dye for the EV labeling</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extracellular vesicle uptake assay via confocal microscope imaging analysis

יש צורך לבדיקות מעשיות כדי לדמיין ולכומת את ספיגת ההדבקה החוץ-תאית (EV) של התאים. ספיגת EV ממלאת תפקיד בתקשורת בין-תאית בתחומי מחקר שונים; ביולוגיה של סרטן, מדעי המוח, ואספקת תרופות. ספרות דיווחו על ספיגת EV רבים; עם זאת, קיים חוסר במתודולוגיה ניסיונית מעשית ומפורטת. ניתן להעריך את ספיגת EV על ידי תיוג פלואורסצנטי של EVs כדי לזהות את מיקומם בתוך התאים. קשה להבחין בין EVs מופנמים בתאים לבין ה-EVs השטחיים בתאים, אך קריטיים, כדי לקבוע במדויק את ספיגת EV. לכן, בדיקה כי ביעילות כימות ספיגת EV באמצעות תלת מימדי (3D) פלואורסצנטיות קונפוקלית מיקרוסקופיה מוצעת בעבודה זו. כלי עבודה אלקטרוניים בעלי תווית פלואורסצנטית הוכנו באמצעות התקן מיקרופלואידי מבוסס ננו-סינון, שנודע על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית תלת-ממדית, ולאחר מכן נותחו באמצעות תוכנה מתקדמת לעיבוד תמונה. הפרוטוקול מספק מתודולוגיה חזקה לניתוח כלי עבודה אלקטרוניים ברמה התאית וגישה מעשית לניתוח יעיל.

באמצעות מכשיר מיקרופלואידי מבוסס ננו-סינון, הושבים החמצוניים היו מבודדים מ-PC3 CCM ותויגו בנוגדן EV (CD63) ספוג פלואורופור (איור 1). ה-EVs המסומנים בתווית הוצגו בהצלחה על-ידי מיקרוסקופיית הקונפוקליים תלת-ממדית (איור 2). כלי ה-EV המסומנים דוגרו בתאים במשך מספר שעות במדי...

Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis at JoVE.com

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

שלל חוץ-תאי (EVs) תורמים לביולוגיה תאית ולתקשורת בין-תאית. יש צורך לבדיקות מעשיות כדי לדמיין ולתייג ספיגת EVs על ידי התאים. הפרוטוקול הנוכחי מציע את בדיקת ספיגת EV על ידי שימוש בהדמיית פלואורסצנטיות תלת ממדית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקל, לאחר בידוד EV על ידי מכשיר מיקרופלואידי מבוסס ננו-סינון.

ספיגת ארסיה חוץ-תאית באמצעות ניתוח הדמיית מיקרוסקופ קונפוצלי

There is a need for practical assays to visualize and quantify the cells' extracellular vesicle (EV) uptake. EV uptake plays a role in intercellular ...

פרוטוקול זה מספק מתודולוגיה חזקה לניתוח כלי עבודה אלקטרוניים ברמה התאית, וגישה מעשית לספיגת EV יעילה וניתוח מעקב אחר EV. שיטה זו של תיוג EV מבטלת משקעים משותפים של EVs וצבע, ובכך לשפר את אותות EV. ספיגת EV נמדדת על ידי ניתוח נפחי כדי להבחין בין EVs מופנמים מן EVs השטחי.רכבים ים הם מטענים פעילים, ולכן, ספיגתם מאפשרת העברה של מולקולות ביוכימיות. למחקר על משלוח תרופות מבוססות EV וטיפול בסרטן, טכניקה זו יכולה להיות כלי הערכה. ספיגת EV ממלאת תפקיד בתקשורת בין-תאית ונחקרת בתחומי מחקר שונים, כגון ביולוגיה של סרטן, מדעי המוח ואספקת תרופות.פרוטוקול זה עשוי להקל על ספיגת EV יעילה. לבידוד של שלל חוץ-תאי, או רכבים אלקטרוניים, הזריקו מיליליטר אחד של מדיה של תרבית תאים מעובדת מראש לתא המדגם של התקן מיקרופלואידי מבוסס ננו-סינון. כדי להפעיל את ההתקן, סובב את ההתקן במכונת הספינינג של הספסל במהירות של 3000 סל"ד למשך 10 דקות.לאחר ספינינג, להסיר את הנוזל מתא הפסולת על ידי pipetting או שאיפה, ולאחר מכן לחזור על הליך זה פעמיים לעיבוד שני מיליליטר נוספים של מדיה תרבות התא. לאחר מכן, כדי לשטוף את EVs מבודד, להזריק מיליליטר אחד של PBS לתוך תא המדגם ולסובב את המכשיר במכונת ספינינג הספסל. עבור תיוג חיסוני של כלי ה-EV, הזריקו מיקרוגרם אחד למיליליטר של הנוגדן הספציפי EV לחור ההצתה של המכשיר המכיל 100 מיקרוליטרים של כלי הפעלה אלקטרוניים מבודדים.לאחר מכן לדגור במשך שעה אחת בחושך על שייקר צלחת כדי להבטיח את ההפצה הזוגית של הנוגדן על פני המדגם. לאחר מכן, חבר סרט הדבקה לחור ההתחמקות. הזריקו מיליליטר אחד של PBS לתא הדגימה כדי לשטוף את שאריות הנוגדנים, ואז לסובב את המכשיר עד תא המדגם ריק.חזור על הכביסה על ידי הזרקת מיליליטר אחר של PBS לתוך תא המדגם, ומסובב את המכשיר כפי שהודגם בעבר. לאחר הסרת שאריות הנוזל מהתא, pipette את EVs תווית פלואורסצנטית מתא הממברנה לתוך צינור ענבר או צינור מיקרו. הגן על הצינור מפני אור עד לשימוש.זרע ארבע פעמים 10 לתאי PC3 הרביעי לתוך צלחת 35 מיליליטר עם מדיה מיליליטר אחד. אפשר לתאים לדבוק בן לילה בתנאי תרבית תאים אופטימליים. למחרת, לשטוף את התאים דבק פעמיים עם מדיה exosome-מרוקן.לאחר דילול רכבים אלקטרוניים עם תווית פלואורסצנטית לריכוז המתאים באמצעות מדיה מרוקנת אקסוזום, הוסיפו את כלי העבודה האלקטרוניים המדוללים לתאי היעד הדבוקים ודגרו לזמן הניסיוני הרצוי. לאחר הסרת רכבים אופניים לא מופנמים על ידי שטיפת התאים שלוש פעמים עם מדיה נטולת אקסוזומים, סמן את הציטופלסמה של התאים הדבוקים במיקרוגרם אחד למיליליטר של CMTMR, ודגרה בתנאי תרבית תאים אופטימליים. להדמיית תאים חיים, הניחו את התאים המוכנים באינקובטור על הבמה.לאחר הגדרת פרמטרי ההדמיה בהתבסס על דגימות בקרה, קבע את עומק תאי היעד ואת טווח גודל הערימה בכיוון Z כדי לרכוש תמונות קונפוקליות תלת-ממדיות, ולאחר מכן הגדר את רכישת התמונה לתמונות מרובות של צבע ספציפי לתא וצבע ספציפי ל- EV בו-זמנית. לעיבוד תמונה, השתמש בתוכנת עיבוד תמונה אוטומטית. כדי לבנות משטחים וירטואליים של התאים, לחץ על הוסף משטחים חדשים.כדי לקבוע את התצורה של משטחי התא הווירטואלי, לחץ על לחצן הוסף ובחר איכות כסוג המסנן. סף את הערך המתאים עבור המגבלה הנמוכה על-ידי בדיקה חזותית, הגדר את הערך המרבי עבור הגבול העליון ולחץ על לחצן סיום הבא, כדי לבנות את הנקודות הווירטואליות של ה- EVs, לחץ על הלחצן הוסף כתמים חדשים. תחת הגדרות אלגוריתם, בחר גדלי ספוט שונים וחישוב המרחק הקצר ביותר ולאחר מכן לחץ על הבא ובחר ערוץ 1 Alexa Fluor 488 כערוץ המקור.הזינו את הערך המתאים לקוטר XY המשוער תחת 'זיהוי ספוט' ולחצו על הבא. כדי לקבוע את התצורה של נקודות EV וירטואליות, לחץ על לחצן הוסף ובחר איכות כסוג המסנן. הגדר את הסף התחתון על-ידי בדיקה חזותית ולחץ על הבא עבור סוג אזורי ספוט, בחר עוצמה מוחלטת ולאחר מכן לחץ על הבא.כדי לסף את האזור של נקודות EV, הזן את הערך המתאים עבור סף אזור על-ידי בדיקה חזותית. בחר קוטר מתחת לאמצעי אחסון באזור ולחץ על סיום. כדי לפצל את הנקודות המקובצות בתוך המשטח הבנוי, לחץ על בניית כתמים ועבור למסננים.לאחר מכן לחצו על הלחצן 'הוסף' ובחרו 'המרחק הקצר ביותר למשטחים', 'משטחים משטחים 1' כסוג המסנן. לאחר הגדרת הסף הנמוך ביותר עבור המגבלה הנמוכה ואת הערך המתאים עבור הגבול העליון, לחץ על המקטע שכפל ללחצן כתמים חדש. לספירה אוטומטית של כלי עבודה חדשים בתוך התאים, לחצו על הבחירה 'נקודות מובנות 1', עבורו לסטטיסטיקה ויצאו את הערך ממספר הנקודות הכולל.כדי להשיג את מספר התאים, לחץ על המשטחים הבנויים 1 ולאחר מכן עבור אל סטטיסטיקה וייצוא הערך של המספר הכולל של משטחים מתוך כולל. לבסוף, עבור לכרטיסיה מפורט תחת סטטיסטיקה כדי לייצא את אמצעי האחסון. רכבים נטויים שבודדו ממדיית תרבית תאים PC3 באמצעות התקן מיקרופלואידי מבוסס ננו-סינון תויגו בנוגדן ספציפי ל-EV מצומד פלואורו-4, ודמיינו אותם באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית תלת-ממדית.ה- EVs שהופנמו הוצגו כנוקטה ועיבוד EV.Post בודד של תמונות אלה מאפשר הדמיה וכימות של הפנמת EV לתאים. תוצאות ספיגת EV מצביעות על כך שרמת ספיגת EV תלויה באורך תקופת הדגירה. ניתן לנרמל את מספר ה- EVs הפנמיים לאמצעי האחסון של תא הנמען כדי לקבוע את הקצב בפועל של ספיגת EV עבור התא שצוין.הליך זה מאפשר אי-הכללה שיטתית של כלי הפעלה אלקטרוניים שאינם מופנמים כדי למדוד במדויק את מספר כלי ה-EV המופנמים. התפלגות הגודל של נקודות EV מופנמות מוצגת כאן. אז השלבים העיקריים הם ניצול של המכשיר microfluidic עבור תיוג EV, מזעור של פלואורסצנטיות רקע בעת הדמיית EVs פלורסנט, ולאחר מכן ניתוח שלאחר הדמיה כדי לקבוע פנים לעומת EVs שטחי.אז מעקב EV תאי יכול להתבצע בזמן אמת על מישור 3D, ובנוסף, ניתוח סחר EV על רזולוציות מרחביות / זמניות ואת לוקליזציה משותפת של רכבים EVs עם אברונים תת-תאיים ניתן להשיג. אז אנחנו מאמינים שטכניקה זו מספקת דרך קלה ויעילה יותר לחקור את ה- EVs בתוך מטריצות פנים-תאיות לחוקרים בתחום התקשורת הסלולרית עבור EVs.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Unit 1

Endocytosis and Exocytosis

SCIENTISTS IN ACTION

Proper Care and Cleaning of the Microscope

טיפול ניקוי נאות של המיקרוסקופ

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Major Components of the Light Microscope

הרכיבים העיקריים של מיקרוסקופ אור

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

הקרינה מבוסס מדידה הכניסה חנות המופעל הסידן בתאים חיים: מתא הסרטן תרבותי כדי סיב שריר שלד

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

ספיגת כולסטרול LDL Assay באמצעות תא חי הדמיה ניתוח עם התא לניטור תקינות

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...

Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization by Nano-Flow Cytometry

אפיון חלבון טרנס-ממברנה חוץ-תאי יחיד על-ידי ציטומטריה של זרימה ננו

Single particle characterization has become increasingly relevant for research into extracellular vesicles, progressing from bulk analysis techniques and ...

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

ניתוח הסתיידות כלי דם חוץ-תאית בתיווך שלפוחית באמצעות מודלים In Vitro ו-In Vivo

Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world, and vascular calcification is the most significant predictor of cardiovascular events; ...

Multimodal Analytical Platform on a Multiplexed Surface Plasmon Resonance Imaging Chip for the Analysis of Extracellular Vesicle Subsets

פלטפורמה אנליטית רב-מודאלית על שבב דימות תהודה פלסמון מרובה פני שטח לניתוח תת-קבוצות שלפוחית חוץ-תאית

Extracellular vesicles (EVs) are membrane-derived, tiny vesicles produced by all cells that range from 50 to several hundreds of nanometers in diameter ...

Imaging of Mitochondrial Peroxide in Living Yeast Cells Using mtHyper7

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Advancing Mitochondrial Research Â– mtHyper7 Biosensor for Subcellular Analysis (Video) | JoVE

הדמיה של mtHyPer7, ביוסנסור רציומטרי למי חמצן מיטוכונדריאליים, בתאי שמרים חיים

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...

Intravital Imaging Using an Inverted Microscope to Track Skin Cell Dynamics

Streamlined Intravital Imaging Approach for Long-Term Monitoring of Epithelial Tissue Dynamics on an Inverted Confocal Microscope

Developing a Tool for Using Inverted Confocal Microscopes for In Vivo Intravital Imaging (Video) | JoVE

גישת הדמיה תוך-חיונית יעילה לניטור ארוך טווח של דינמיקה של רקמת אפיתל במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It ...