Name: extracellular vesicle uptake assay via confocal microscope imaging analysis
Uploaded: 2022-02-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da n. di sovvenzione NCI. U54CA143803, CA163124, CA093900 e CA143055 a K. J. P. Questa ricerca è stata supportata da una sovvenzione del Korea Health Technology R&D Project attraverso il Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finanziato dal Ministero della Salute e del Welfare, Repubblica di Corea (numero di sovvenzione: HI19C1122). Opera di J. Kim e Y.-K. Cho è stato sostenuto dall'Institute for Basic Science (IBS-R020-D1), finanziato dal governo coreano. Gli autori ringraziano i membri attuali e passati del Brady Urological Institute, in particolare i membri del laboratorio Pienta-Amend, per la lettura critica del manoscritto.

1. Isolamento EV ed etichettatura EV immuno-fluorescente su chip
<ol><li>Raccolta di terreni di coltura cellulare (CCM) e pre-elaborazione di CCM per l'isolamento EV<ol>
<li>Semina cellule PC3 al 30% di confluenza in un pallone di coltura cellulare di 75 cm2 . Consentire alle cellule di controllo di crescere fino al 90% di confluenza (~ 48 h) nei media standard e negli integratori specifici della linea cellulare. NOTA: Per evitare che i componenti contenenti EV influenzino l'assorbimento cellulare (ad ese...

<ol>
	<li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+Ectosomes+in+Intercellular+Communication.">Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication.</a> Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).</li><li>Sunkara, V., Woo, H. -. K., Cho, Y. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+techniques+in+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles+and+their+roles+in+cancer+diagnostics+and+prognostics.">Emerging techniques in the isolation and characterization of extracellular vesicles and their roles in cancer diagnostics and prognostics.</a> The Analyst. 141 (2), 371-381 (2016).</li><li>Kalluri, R., Lebleu, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology,+function,+and+biomedical+applications+of+exosomes.">The biology, function, and biomedical applications of exosomes.</a> Science. 367 (6478), (2020).</li><li>Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificities+of+secretion+and+uptake+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+cell-to-cell+communication.">Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).</li><li>Bonsergent, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+characterization+of+extracellular+vesicle+uptake+and+content+delivery+within+mammalian+cells.">Quantitative characterization of extracellular vesicle uptake and content delivery within mammalian cells.</a> Nature Communications. 12, 1864 (2021).</li><li>Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routes+and+mechanisms+of+extracellular+vesicle+uptake.">Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).</li><li>Dehghani, M., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+extracellular+vesicles.">Fluorescent labeling of extracellular vesicles.</a> Methods Enzymology. 645, 15-42 (2020).</li><li>Ragni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovative+Visualization+and+Quantification+of+Extracellular+Vesicles+Interaction+with+and+Incorporation+in+Target+Cells+in+3D+Microenvironments.">Innovative Visualization and Quantification of Extracellular Vesicles Interaction with and Incorporation in Target Cells in 3D Microenvironments.</a> Cells. 9 (5), 1180 (2020).</li><li>Saari, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLIM+reveals+alternative+EV-mediated+cellular+up-take+pathways+of+paclitaxel.">FLIM reveals alternative EV-mediated cellular up-take pathways of paclitaxel.</a> Journal of Controlled Release. 284, 133-143 (2018).</li><li>Franzen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Uptake+and+Internalization+of+Exosomes+by+Bladder+Cancer+Cells.">Characterization of Uptake and Internalization of Exosomes by Bladder Cancer Cells.</a> BioMed Research International. 2014, 619829 (2014).</li><li>Feng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Internalization+of+Exosomes+Occurs+Through+Phagocytosis.">Cellular Internalization of Exosomes Occurs Through Phagocytosis.</a> Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).</li><li>Hoen, E. N. M. N. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+qualitative+flow+cytometric+analysis+of+nanosized+cell-derived+membrane+vesicles.">Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).</li><li>Van Der Vlist, E. J., Nolte-'T Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry.">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).</li><li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+Exosome+Isolation+Techniques.">Progress in Exosome Isolation Techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+perspective+on+exosome+isolation+-+efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics.">and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li><li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+distinct+exosome+subpopulations:+isolation+and+characterization+approaches+and+their+associated+challenges.">Separation of distinct exosome subpopulations: isolation and characterization approaches and their associated challenges.</a> The Analyst. 146 (12), 3731-3749 (2021).</li><li>Woo, H. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exodisc+for+Rapid,+Size-Selective,+and+Efficient+Isolation+and+Analysis+of+Nanoscale+Extracellular+Vesicles+from+Biological+Samples.">Exodisc for Rapid, Size-Selective, and Efficient Isolation and Analysis of Nanoscale Extracellular Vesicles from Biological Samples.</a> ACS Nano. 11 (2), 1360-1370 (2017).</li><li>Kim, T. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAST:+Size-Selective,+Clog-Free+Isolation+of+Rare+Cancer+Cells+from+Whole+Blood+at+a+Liquid-Liquid+Interface.">FAST: Size-Selective, Clog-Free Isolation of Rare Cancer Cells from Whole Blood at a Liquid-Liquid Interface.</a> Analytical Chemistry. 89 (2), 1155-1162 (2017).</li><li>Joshi, B. S., De Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+of+Extracellular+Vesicles+and+Release+of+Their+Cargo+from+Endosomes.">Endocytosis of Extracellular Vesicles and Release of Their Cargo from Endosomes.</a> ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).</li><li>Sung, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+live+cell+reporter+of+exosome+secretion+and+uptake+reveals+pathfinding+behavior+of+migrating+cells.">A live cell reporter of exosome secretion and uptake reveals pathfinding behavior of migrating cells.</a> Nature Communications. 11, 2092 (2020).</li><li>Heusermann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+surf+on+filopodia+to+enter+cells+at+endocytic+hot+spots,+traffic+within+endosomes,+and+are+targeted+to+the+ER.">Exosomes surf on filopodia to enter cells at endocytic hot spots, traffic within endosomes, and are targeted to the ER.</a> Journal of Cell Biology. 213 (2), 173-184 (2016).</li><li>Reclusa, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+extracellular+vesicles+visualization:+From+static+to+motion.">Improving extracellular vesicles visualization: From static to motion.</a> Scientific Reports. 10, 6494 (2020).</li><li>Verweij, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Tracking+of+Inter-organ+Communication+by+Endogenous+Exosomes+In+Vivo.">Live Tracking of Inter-organ Communication by Endogenous Exosomes In Vivo.</a> Developmental Cell. 48 (4), 573-589 (2019).</li><li>Lai, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+tracking+of+tumour+extracellular+vesicle+delivery+and+RNA+translation+using+multiplexed+reporters.">Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters.</a> Nature Communications. 6, 7029 (2015).</li><li>Durak-Kozica, M., Baster, Z., Kubat, K., St&#281;pie&#324;, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+visualization+of+extracellular+vesicle+uptake+by+endothelial+cells.">3D visualization of extracellular vesicle uptake by endothelial cells.</a> Cellular &amp; Molecular Biology Letters. 23, 57 (2018).</li><li>Sunkara, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+Automated,+Label-Free+Isolation+of+Extracellular+Vesicles+from+Whole+Blood+for+Cancer+Diagnosis+and+Monitoring.">Fully Automated, Label-Free Isolation of Extracellular Vesicles from Whole Blood for Cancer Diagnosis and Monitoring.</a> Theranostics. 9 (7), 1851-1863 (2019).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+trophoblastic+small+extracellular+vesicles+and+detection+of+their+miRNA+cargo+in+P-bodies.">Internalization of trophoblastic small extracellular vesicles and detection of their miRNA cargo in P-bodies.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1812261 (2020).</li><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+evaluation+of+methods+for+small+extracellular+vesicles+separation+from+human+plasma,+urine+and+cell+culture+medium.">Comprehensive evaluation of methods for small extracellular vesicles separation from human plasma, urine and cell culture medium.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10, 12044 (2020).</li></ol>

Un test di assorbimento EV basato sull'imaging a fluorescenza 3D tramite microscopia confocale fornisce una metodologia efficiente e un'analisi sensibile. Questa etichettatura fluorescente dei veicoli elettrici facilita la visualizzazione dei veicoli elettrici ed esegue con successo un preciso test di assorbimento dei veicoli elettrici. I metodi precedenti per l'etichettatura dei veicoli elettrici e la rimozione del colorante residuo sono stati segnalati rimuovendo la precipitazione utilizzando l'ultracentrifuga...

Le vescicole extracellulari (EV) sono particelle legate alla membrana lipidica di dimensioni nanometriche che sono classificate in base alle loro dimensioni: ectosomi (100-500 nm) ed esosomi (50-150 nm)1. Gli EV contengono varie biomolecole, come proteine, acidi nucleici e lipidi. Queste biomolecole provengono dalle cellule prima di essere incapsulate come carico e rilasciate nello spazio extracellulare tramite EV1,2,3.
A causa della varietà del loro carico, si ritiene che i veicoli elettrici svolgano un ruolo attivo nella comunicazione intercellulare. Il rilascio e l'assorbimento di VEICOLI elettrici da parte delle cellule consentono il trasferimento di biomolecole tra le cellule4,5. L'introduzione di un carico EV in una cella può alterare le funzioni della cellula ricevente e lo stato omeostatico4,5,6. I veicoli elettrici sono interiorizzati attraverso più percorsi; tuttavia, i meccanismi esatti non sono stati dimostrati con precisione.
La maggior parte dei test di assorbimento dei veicoli elettrici, come l'etichettatura genetica, etichettano fluorescentemente i singoli veicoli elettrici7. Il segnale risultante può essere misurato mediante fotometro a micropiastre, citometria a flusso o microscopia, con ogni tecnologia che presenta limitazioni sostanziali. I fotometri a micropiastre, la citometria a flusso o la microscopia bidimensionale standard (2D) non possono distinguere tra EV internalizzati e attaccati superficialmente8,9. Inoltre, la necessaria preparazione del campione per ciascuna di queste tecniche può introdurre ulteriori problemi nella valutazione dell'assorbimento dei veicoli elettrici. Ad esempio, il sollevamento di cellule aderenti con tripsina prima dell'analisi dell'assorbimento di EV può scindere alcuni EV attaccati superficialmente sulla superficie della cellula10,11. La tripsina può anche interagire con la superficie cellulare, influenzando la cellula e il fenotipo EV. Inoltre, la tripsina non può staccare completamente i veicoli elettrici superficiali, distorcendo le popolazioni isolate.
Per etichettare accuratamente i veicoli elettrici con coloranti fluorescenti, sono necessarie ulteriori fasi di lavaggio per rimuovere il colorante residuo7. Le tecniche di isolamento accettate possono anche contribuire a segnali falsi positivi a causa della coagulazione che si verifica durante l'isolamento EV. Ad esempio, l'ultracentrifugazione seriale (UC) è ampiamente utilizzata per isolare i veicoli elettrici e rimuovere il colorante immobilizzato. Tuttavia, UC può co-precipitare i veicoli elettrici e il colorante residuo può portare a un segnale falso positivo12,13. Altri metodi di nanofiltrazione, come la filtrazione a colonna, sono anche ampiamente utilizzati per la rimozione del colorante non immobilizzato. La natura complessa dei veicoli elettrici e del colorante che interagiscono all'interno della matrice della colonna può portare alla rimozione incompleta del colorante residuo a causa del cut-off molecolare della colonna alterato dal complesso input14,15,16.
L'attuale protocollo propone un dispositivo microfluidico basato sulla nanofiltrazione per isolare e lavare i veicoli elettrici isolati etichettati fluorescentemente. Il dispositivo microfluidico basato sulla nanofiltrazione può fornire una filtrazione efficiente tramite la tecnologia di separazione assistita da fluido (FAST)17,18. FAST riduce la caduta di pressione attraverso il filtro, riducendo così la potenziale aggregazione tra veicoli elettrici e coloranti. Rimuovendo in modo efficiente il colorante residuo, è possibile migliorare la qualità dei veicoli elettrici etichettati fluorescentemente e la specificità del test.
La microscopia confocale è in grado di distinguere tra EV internalizzati e superficialmente attaccati sulla superficie cellulare e studiare in modo completo i meccanismi cellulari di assorbimento dei veicoli elettrici in una risoluzione spaziotemporale19,20,21,22,23,24,25. Ad esempio, Sung et al. hanno descritto la visualizzazione del ciclo di vita dell'esosoma utilizzando il loro reporter di cellule vive sviluppato. La posizione dei veicoli elettrici internalizzati è stata rilevata e analizzata utilizzando un microscopio confocale in strumenti tridimensionali (3D) e di elaborazione post-immagine20. Sebbene la dimensione dei piccoli veicoli elettrici (40-200 nm) sia inferiore al limite di risoluzione del microscopio ottico, i veicoli elettrici marcati fluorescentemente possono essere rilevati al microscopio confocale poiché il fotorivelatore può rilevare l'emissione di fluorescenza potenziata. Pertanto, la localizzazione subcellulare dei veicoli elettrici marcati fluorescentemente all'interno di una cellula può essere determinata con precisione acquisendo più immagini impilate z dei veicoli elettrici e degli organelli cellulari circostanti.
Inoltre, la ricostruzione 3D e l'elaborazione post-dati possono fornire ulteriori informazioni sul posizionamento dei veicoli elettrici internalizzati, superficiali e fluttuanti. Utilizzando questi processi in combinazione con l'imaging delle cellule vive time-lapse offerto dalla microscopia confocale, il livello di assorbimento dei veicoli elettrici può essere valutato con precisione ed è anche possibile il monitoraggio in tempo reale dell'assorbimento dei veicoli elettrici. Inoltre, l'analisi del traffico di veicoli elettrici può essere eseguita utilizzando la microscopia confocale valutando la co-localizzazione dei veicoli elettrici con gli organelli, un primo passo per determinare come i veicoli elettrici internalizzati sono coinvolti nella funzione intracellulare. Questo protocollo descrive la metodologia per l'esecuzione di un test di assorbimento di EV utilizzando il dispositivo microfluidico basato su nanofiltrazione17,26, la microscopia confocale e l'analisi post-immagine.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>353038</td>
			<td>Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Orange CMTMR Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C2927</td>
			<td>Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Apo Lambda S 40XC WI</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77400</td>
			<td>Objective for confocal imaging, NA=1.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo VC 20X</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD70200</td>
			<td>Objective for confocal imaging, NA=0.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exodisc</td>
			<td>Labspinner Inc.</td>
			<td>EX-D1001</td>
			<td>A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoDiscovery</td>
			<td>Labspinner Inc.</td>
			<td>EX-R1001</td>
			<td>Operation device for Exodisc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-depleted FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2720801</td>
			<td>Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1500-500</td>
			<td>Nutrient for cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L preadsorbed</td>
			<td>abcam</td>
			<td>&#160;ab7063</td>
			<td>Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi USA&#160;U DISH &#956;-Dish 35 mm</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td>Culture dish for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 9.7.1</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>9.7.1</td>
			<td>Post-image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer</td>
			<td>Live Cell Instrument</td>
			<td>TU-O-20</td>
			<td>Incubator system for live cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Camera for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Inverted microscope for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 4.50.00</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>4.50.00</td>
			<td>Image processing software for Nikon microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA, NanoSight NS500</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>NS500</td>
			<td>Measurement device for EV concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 2020</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td>9.7.0.185</td>
			<td>Graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Antibiotics for cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21875034</td>
			<td>Cell culture media for PC3 cell line cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solution in DMSO</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S32703</td>
			<td>RNA staining fluorescent dye for the EV labeling</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extracellular vesicle uptake assay via confocal microscope imaging analysis

C'è bisogno di saggi pratici per visualizzare e quantificare l'assorbimento delle vescicole extracellulari (EV) delle cellule. L'assorbimento di veicoli elettrici svolge un ruolo nella comunicazione intercellulare in vari campi di ricerca; biologia del cancro, neuroscienze e somministrazione di farmaci. Molti saggi di assorbimento dei veicoli elettrici sono stati riportati in letteratura; tuttavia, vi è una mancanza di metodologia sperimentale pratica e dettagliata. L'assorbimento dei veicoli elettrici può essere valutato etichettando in modo fluorescente i veicoli elettrici per rilevare la loro posizione all'interno delle cellule. Distinguere tra EV internalizzati nelle celle e EV superficiali sulle cellule è difficile, ma fondamentale, per determinare con precisione l'assorbimento ev. Pertanto, in questo lavoro viene proposto un test che quantifica in modo efficiente l'assorbimento di EV attraverso la microscopia confocale a fluorescenza tridimensionale (3D). I veicoli elettrici con etichetta fluorescente sono stati preparati utilizzando un dispositivo microfluidico basato sulla nanofiltrazione, visualizzato mediante microscopia confocale 3D e quindi analizzato attraverso un software avanzato di elaborazione delle immagini. Il protocollo fornisce una solida metodologia per l'analisi dei veicoli elettrici a livello cellulare e un approccio pratico per un'analisi efficiente.

Utilizzando un dispositivo microfluidico basato sulla nanofiltrazione, i veicoli elettrici sono stati isolati dal PC3 CCM ed etichettati con un anticorpo EV-specifico (CD63) coniugato con fluoroforo (Figura 1). I veicoli elettrici etichettati sono stati visualizzati con successo dalla microscopia confocale 3D (Figura 2). I veicoli elettrici etichettati sono stati incubati con cellule per diverse ore in mezzi impoveriti di esosomi. Dopo l'incubazione, le cellule ...

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Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Le vescicole extracellulari (EV) contribuiscono alla biologia cellulare e alle comunicazioni intercellulari. C'è bisogno di saggi pratici per visualizzare e quantificare l'assorbimento dei veicoli elettrici da parte delle cellule. L'attuale protocollo propone il test di assorbimento EV utilizzando l'imaging tridimensionale a fluorescenza tramite microscopia confocale, dopo l'isolamento EV da un dispositivo microfluidico basato su nanofiltrazione.

Test di assorbimento delle vescicole extracellulari tramite analisi di imaging al microscopio confocale

There is a need for practical assays to visualize and quantify the cells' extracellular vesicle (EV) uptake. EV uptake plays a role in intercellular ...

Questo protocollo fornisce una solida metodologia per l'analisi dei veicoli elettrici a livello cellulare e un approccio pratico per l'assorbimento efficiente dei veicoli elettrici e l'analisi del tracciamento dei veicoli elettrici. Questo metodo di etichettatura EV elimina la co-precipitazione di veicoli elettrici e coloranti, migliorando così i segnali EV. L'assorbimento dei veicoli elettrici viene misurato mediante analisi volumetrica per distinguere i veicoli elettrici internalizzati dai veicoli elettrici superficiali.I veicoli elettrici sono carichi attivi, quindi il loro assorbimento consente il trasferimento di molecole biochimiche. Per la ricerca sulla somministrazione di farmaci basata su EV e sulla terapia del cancro, questa tecnica può essere uno strumento di valutazione. L'assorbimento di EV svolge un ruolo nella comunicazione intercellulare ed è studiato in vari campi di ricerca, come la biologia del cancro, le neuroscienze e la somministrazione di farmaci.Questo protocollo facilita potenzialmente un efficiente test di assorbimento dei veicoli elettrici. Per l'isolamento di vescicole extracellulari, o EV, iniettare un millilitro di terreno di coltura cellulare pre-elaborato nella camera del campione del dispositivo microfluidico basato sulla nanofiltrazione. Per far funzionare il dispositivo, ruotare il dispositivo nella filatrice da banco a 3000 RPM per 10 minuti.Dopo la filatura, rimuovere il fluido dalla camera di scarico mediante pipettaggio o aspirazione, quindi ripetere questa procedura due volte per elaborare altri due millilitri del terreno di coltura cellulare. Successivamente, per lavare i veicoli elettrici isolati, iniettare un millilitro di PBS nella camera del campione e far girare il dispositivo nella filatrice da banco. Per l'etichettatura immunofluorescente dei veicoli elettrici, iniettare un microgrammo per millilitro dell'anticorpo ev-specifico nel foro di eluizione del dispositivo contenente 100 microlitri di veicoli elettrici isolati.Quindi incubare per un'ora al buio su uno shaker a piastre per garantire la distribuzione uniforme dell'anticorpo attraverso il campione. Quindi, attaccare un nastro adesivo al foro di eluizione. Iniettare un millilitro di PBS nella camera del campione per lavare gli anticorpi residui, quindi far girare il dispositivo fino a quando la camera del campione è vuota.Ripetere il lavaggio iniettando un altro millilitro di PBS nella camera del campione e ruotando il dispositivo come dimostrato in precedenza. Dopo aver rimosso il fluido residuo dalla camera, pipettare i veicoli elettrici marcati fluorescenti dalla camera a membrana in un tubo ambrato o micro tubo. Proteggere il tubo dalla luce fino all'uso.Semina quattro volte 10 alla quarta cella PC3 in un piatto da 35 millilitri con un mezzo millilitro. Consentire alle cellule di aderire durante la notte in condizioni ottimali di coltura cellulare. Il giorno seguente, lavare le cellule aderenti due volte con mezzi impoveriti di esosomi.Dopo aver diluito i veicoli elettrici marcati fluorescentemente alla concentrazione appropriata utilizzando mezzi impoveriti di esosomi, aggiungere i veicoli elettrici diluiti alle cellule bersaglio aderenti e incubare per il tempo sperimentale desiderato. Dopo aver rimosso gli EV non internalizzati lavando le cellule tre volte con mezzi privi di esosomi, etichettare il citoplasma delle cellule aderenti con un microgrammo per millilitro di CMTMR e incubare in condizioni ottimali di coltura cellulare. Per l'imaging di cellule vive, posizionare le cellule preparate nell'incubatrice sul palco.Dopo aver impostato i parametri di imaging in base ai campioni di controllo, determinare la profondità delle celle target e l'intervallo di dimensioni di impilamento nella direzione Z per acquisire immagini confocali 3D, quindi impostare l'acquisizione dell'immagine su più immagini impilate Z sia del colorante specifico della cellula che del colorante specifico EV contemporaneamente. Per l'elaborazione delle immagini, utilizzare un software di elaborazione automatica delle immagini. Per creare superfici virtuali delle celle, fare clic su Aggiungi nuove superfici.Per configurare le superfici delle celle virtuali, fare clic sul pulsante Aggiungi e selezionare Qualità come tipo di filtro. Soglie il valore appropriato per il limite basso mediante ispezione visiva, impostare il valore massimo per il limite superiore e fare clic sul pulsante Fine Avanti, per costruire i punti virtuali dei veicoli elettrici, fare clic sul pulsante Aggiungi nuovi spot. In Impostazioni algoritmo, seleziona Diverse dimensioni spot e Calcolo della distanza più breve, quindi fai clic su Avanti e seleziona Canale 1 Alexa Fluor 488 come canale sorgente.Immettete il valore appropriato per il diametro XY stimato in Rilevamento punti e fate clic su Avanti. Per configurare i punti EV virtuali, fare clic sul pulsante Aggiungi e selezionare Qualità come tipo di filtro. Impostate la soglia inferiore mediante un'ispezione visiva e fate clic su Avanti Per il tipo di regioni spot, selezionate Intensità assoluta (Absolute Intensity), quindi fate clic su Avanti (Next).Per sogliere la regione dei punti EV, immettere il valore appropriato per Region Threshold mediante ispezione visiva. Selezionate Diametro da sotto Volume regione (Region Volume) e fate clic su Fine (Finish). Per dividere i punti raggruppati all'interno della superficie costruita, fai clic su Costruisci punti e vai in Filtri.Quindi fare clic sul pulsante Aggiungi e selezionare Distanza più breve dalle superfici, Superficie superfici 1 come tipo di filtro. Dopo aver impostato la soglia più bassa per il limite basso e il valore appropriato per il limite superiore, fate clic sul pulsante Duplica sezione per visualizzare i nuovi spot. Per il conteggio automatico dei veicoli elettrici all'interno delle celle, fai clic sulla selezione Spot costruiti 1, vai a Statistiche ed esporta il valore dal Numero totale di spot.Per ottenere il numero di celle, fare clic su Superfici costruite 1, quindi passare a Statistiche ed esportare il valore di Numero totale di superfici da Complessivo. Infine, vai alla scheda Dettagli in Statistiche per esportare il volume. I veicoli elettrici isolati dai terreni di coltura cellulare PC3 utilizzando un dispositivo microfluidico basato sulla nanofiltrazione sono stati etichettati con un anticorpo specifico EV coniugato fluoro-4 e visualizzati utilizzando la microscopia confocale 3D.I veicoli elettrici internalizzati sono stati visualizzati come puncta e una singola EV.Post-elaborazione di queste immagini consente la visualizzazione e la quantificazione dell'internalizzazione EV nelle celle. I risultati del test di assorbimento dei veicoli elettrici indicano che il livello di assorbimento dei veicoli elettrici dipende dalla durata del periodo di incubazione. Il numero di veicoli elettrici internalizzati può essere normalizzato al volume della cella ricevente per determinare il tasso effettivo di assorbimento dei veicoli elettrici per la cella specificata.Questa procedura consente l'esclusione sistematica dei veicoli elettrici non internalizzati per misurare con precisione il numero di veicoli elettrici internalizzati. La distribuzione dimensionale dei punti EV internalizzati è mostrata qui. Quindi i passaggi chiave sono l'utilizzo del dispositivo microfluidico per l'etichettatura dei veicoli elettrici, la minimizzazione della fluorescenza di fondo durante la visualizzazione di veicoli elettrici fluorescenti e quindi l'analisi post-imaging per determinare i veicoli elettrici internalizzati rispetto a quelli superficiali.Quindi il tracciamento intracellulare ev può essere eseguito in tempo reale su un piano 3D e, inoltre, è possibile ottenere l'analisi del traffico EV su risoluzioni spaziali / temporali e la co-localizzazione di veicoli elettrici con organelli subcellulari. Quindi crediamo che questa tecnica fornisca un modo più semplice ed efficiente per studiare i veicoli elettrici all'interno delle matrici intra ed extracellulari per i ricercatori nel campo della comunicazione cellulare per i veicoli elettrici.

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Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

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