Name: extracellular vesicle uptake assay via confocal microscope imaging analysis
Uploaded: 2022-02-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis at JoVE.com

이 작품은 NCI 보조금 Nos에 의해 지원되었다. U54CA143803, CA163124, CA093900 및 CA143055 ~ K. J. P. 이 연구는 한국보건복지부의 지원을 받아 한국보건산업개발원(KHIDI)을 통해 한국보건기술R&D 사업의 지원(교부금 번호: HI19C1122)에 의해 지원되었다. 김제이와 Y.K. 조 대표는 한국 정부의 지원을 받아 기초과학연구소(IBS-R020-D1)의 지원을 받았다. 저자는 원고의 비판적 독서에 대한 브래디 비뇨기과 연구소의 현재와 과거 회원, 특히 피엔타 - 수정 연구소의 구성원을 감사드립니다.

1. EV 절연 및 온칩 면역 형광 EV 라벨링
<ol><li>EV 절연을 위한 세포 배양 매체(CCM) 및 CCM의 사전 처리<ol>
<li>종자 PC3 세포는 75cm2 세포 배양 플라스크에서 30% 합류한다. 제어 세포가 표준 미디어 및 세포 선별 보충제에서 90%의 합류(~48h)로 증가하도록 허용합니다. 참고: EV 함유 성분이 세포 섭취(즉, 태아 소 혈청)에 영향을 미치지 않도록 하려면 외성 고갈된 미디어와 보충제를 사용하십시오...

<ol>
	<li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+Ectosomes+in+Intercellular+Communication.">Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication.</a> Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).</li><li>Sunkara, V., Woo, H. -. K., Cho, Y. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+techniques+in+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles+and+their+roles+in+cancer+diagnostics+and+prognostics.">Emerging techniques in the isolation and characterization of extracellular vesicles and their roles in cancer diagnostics and prognostics.</a> The Analyst. 141 (2), 371-381 (2016).</li><li>Kalluri, R., Lebleu, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology,+function,+and+biomedical+applications+of+exosomes.">The biology, function, and biomedical applications of exosomes.</a> Science. 367 (6478), (2020).</li><li>Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificities+of+secretion+and+uptake+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+cell-to-cell+communication.">Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).</li><li>Bonsergent, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+characterization+of+extracellular+vesicle+uptake+and+content+delivery+within+mammalian+cells.">Quantitative characterization of extracellular vesicle uptake and content delivery within mammalian cells.</a> Nature Communications. 12, 1864 (2021).</li><li>Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routes+and+mechanisms+of+extracellular+vesicle+uptake.">Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).</li><li>Dehghani, M., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+extracellular+vesicles.">Fluorescent labeling of extracellular vesicles.</a> Methods Enzymology. 645, 15-42 (2020).</li><li>Ragni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovative+Visualization+and+Quantification+of+Extracellular+Vesicles+Interaction+with+and+Incorporation+in+Target+Cells+in+3D+Microenvironments.">Innovative Visualization and Quantification of Extracellular Vesicles Interaction with and Incorporation in Target Cells in 3D Microenvironments.</a> Cells. 9 (5), 1180 (2020).</li><li>Saari, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLIM+reveals+alternative+EV-mediated+cellular+up-take+pathways+of+paclitaxel.">FLIM reveals alternative EV-mediated cellular up-take pathways of paclitaxel.</a> Journal of Controlled Release. 284, 133-143 (2018).</li><li>Franzen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Uptake+and+Internalization+of+Exosomes+by+Bladder+Cancer+Cells.">Characterization of Uptake and Internalization of Exosomes by Bladder Cancer Cells.</a> BioMed Research International. 2014, 619829 (2014).</li><li>Feng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Internalization+of+Exosomes+Occurs+Through+Phagocytosis.">Cellular Internalization of Exosomes Occurs Through Phagocytosis.</a> Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).</li><li>Hoen, E. N. M. N. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+qualitative+flow+cytometric+analysis+of+nanosized+cell-derived+membrane+vesicles.">Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).</li><li>Van Der Vlist, E. J., Nolte-'T Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry.">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).</li><li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+Exosome+Isolation+Techniques.">Progress in Exosome Isolation Techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+perspective+on+exosome+isolation+-+efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics.">and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li><li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+distinct+exosome+subpopulations:+isolation+and+characterization+approaches+and+their+associated+challenges.">Separation of distinct exosome subpopulations: isolation and characterization approaches and their associated challenges.</a> The Analyst. 146 (12), 3731-3749 (2021).</li><li>Woo, H. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exodisc+for+Rapid,+Size-Selective,+and+Efficient+Isolation+and+Analysis+of+Nanoscale+Extracellular+Vesicles+from+Biological+Samples.">Exodisc for Rapid, Size-Selective, and Efficient Isolation and Analysis of Nanoscale Extracellular Vesicles from Biological Samples.</a> ACS Nano. 11 (2), 1360-1370 (2017).</li><li>Kim, T. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAST:+Size-Selective,+Clog-Free+Isolation+of+Rare+Cancer+Cells+from+Whole+Blood+at+a+Liquid-Liquid+Interface.">FAST: Size-Selective, Clog-Free Isolation of Rare Cancer Cells from Whole Blood at a Liquid-Liquid Interface.</a> Analytical Chemistry. 89 (2), 1155-1162 (2017).</li><li>Joshi, B. S., De Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+of+Extracellular+Vesicles+and+Release+of+Their+Cargo+from+Endosomes.">Endocytosis of Extracellular Vesicles and Release of Their Cargo from Endosomes.</a> ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).</li><li>Sung, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+live+cell+reporter+of+exosome+secretion+and+uptake+reveals+pathfinding+behavior+of+migrating+cells.">A live cell reporter of exosome secretion and uptake reveals pathfinding behavior of migrating cells.</a> Nature Communications. 11, 2092 (2020).</li><li>Heusermann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+surf+on+filopodia+to+enter+cells+at+endocytic+hot+spots,+traffic+within+endosomes,+and+are+targeted+to+the+ER.">Exosomes surf on filopodia to enter cells at endocytic hot spots, traffic within endosomes, and are targeted to the ER.</a> Journal of Cell Biology. 213 (2), 173-184 (2016).</li><li>Reclusa, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+extracellular+vesicles+visualization:+From+static+to+motion.">Improving extracellular vesicles visualization: From static to motion.</a> Scientific Reports. 10, 6494 (2020).</li><li>Verweij, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Tracking+of+Inter-organ+Communication+by+Endogenous+Exosomes+In+Vivo.">Live Tracking of Inter-organ Communication by Endogenous Exosomes In Vivo.</a> Developmental Cell. 48 (4), 573-589 (2019).</li><li>Lai, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+tracking+of+tumour+extracellular+vesicle+delivery+and+RNA+translation+using+multiplexed+reporters.">Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters.</a> Nature Communications. 6, 7029 (2015).</li><li>Durak-Kozica, M., Baster, Z., Kubat, K., St&#281;pie&#324;, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+visualization+of+extracellular+vesicle+uptake+by+endothelial+cells.">3D visualization of extracellular vesicle uptake by endothelial cells.</a> Cellular &amp; Molecular Biology Letters. 23, 57 (2018).</li><li>Sunkara, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+Automated,+Label-Free+Isolation+of+Extracellular+Vesicles+from+Whole+Blood+for+Cancer+Diagnosis+and+Monitoring.">Fully Automated, Label-Free Isolation of Extracellular Vesicles from Whole Blood for Cancer Diagnosis and Monitoring.</a> Theranostics. 9 (7), 1851-1863 (2019).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+trophoblastic+small+extracellular+vesicles+and+detection+of+their+miRNA+cargo+in+P-bodies.">Internalization of trophoblastic small extracellular vesicles and detection of their miRNA cargo in P-bodies.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1812261 (2020).</li><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+evaluation+of+methods+for+small+extracellular+vesicles+separation+from+human+plasma,+urine+and+cell+culture+medium.">Comprehensive evaluation of methods for small extracellular vesicles separation from human plasma, urine and cell culture medium.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10, 12044 (2020).</li></ol>

공초점 현미경 검사를 통한 3D 형광 이미징을 기반으로 하는 EV 섭취 분석법은 효율적인 방법론과 민감한 분석을 제공합니다. 이 형광 EV 라벨링은 EV의 시각화를 용이하게 하고 정확한 EV 업테이크 분석기를 성공적으로 수행합니다. EV 라벨링 및 잔류 염료 를 제거하기위한 이전 방법은 초음파 심립분리 (UC)를 사용하여 침전을 제거하여보고되었습니다. 그러나, UC는 전기자동차를 공동 침전시?...

세포외 소포(EV)는 나노 크기의 지질 막 결합 입자로, 이독(100-500 nm) 및 엑소좀(50-150 nm)1의 크기로 분류된다. 전기 는 단백질, 핵산 및 지질과 같은 다양한 생체 분자를 포함합니다. 이 생체 분자는 화물로 캡슐화 되고 EVs1,2,3을 통해 세포 외 공간으로 방출되기 전에 세포에서 유래합니다.
그들의 화물의 다양성때문에, 전기는 세포 간 통신에 적극적인 역할을 하는 것으로 여겨진다. 세포별 전기자동차의 방출 및 섭취는 세포 4,5 사이의 생체 분자의 전달을 허용한다. 셀에 EV 화물을 도입하면 수신자 셀의 기능 및 근종 상태를 변경할 수 있습니다4,5,6. 전기 자동차는 여러 경로를 통해 내면화됩니다. 그러나 정확한 메커니즘은 정확하게 입증되지 않았습니다.
유전 적 태깅, 형광 라벨 개별 EVs7과 같은 EV 섭취량 소의 대다수. 결과 신호는 마이크로 플레이트 광미터, 유동 세포측정법 또는 현미경 검사법으로 측정할 수 있으며 각 기술은 상당한 한계를 가지고 있습니다. 마이크로 플레이트 광계, 유동 세포측정, 또는 표준 2차원(2D) 현미경 검사는 내재및 피상적으로 부착된 EV8,9을 구별할 수 없다. 또한 이러한 각 기술에 필요한 샘플 준비는 EV uptake 평가에 추가 적인 문제를 야기할 수 있습니다. 예를 들어, EV 섭취량 분석 전에 트립신으로 부착된 셀을 리프팅하면 셀 표면에 일부 피상적으로 부착된 EV가 갈라질 수 있습니다10,11. 트립신은 또한 세포 표면과 상호 작용할 수 있습니다., 세포 및 EV 표현형에 영향을 미치는. 또한 트립신은 피상적 인 전기 를 완전히 분리하여 격리 된 인구를 왜곡하지 않을 수 있습니다.
형광염염으로 전기자동차에 정확하게 라벨을 붙이려면 잔류 염료7을 제거하기 위해 추가 세척 단계가 필요합니다. 허용된 격리 기술은 EV 격리 중에 발생하는 응고로 인한 거짓 긍정 신호에도 기여할 수 있습니다. 예를 들어, 직렬 초원심분리(UC)는 널리 전기를 분리하고 고정된 염료를 제거하는 데 사용된다. 그러나, UC는 전기자동차를 공동 침전시킬 수 있으며, 잔류염은 거짓 양성 신호12,13로 이어질 수 있다. 컬럼 계 여과와 같은 다른 나노 여과 방법도 비 고정 염료 제거에 널리 사용됩니다. 컬럼 매트릭스 내에서 상호 작용하는 전기 및 염료의 복잡한 특성은 복잡한 입력14,15,16에 의해 변경되는 컬럼의 분자 차단으로 인해 잔류 염료의 불완전한 제거로 이어질 수 있다.
현재 프로토콜은 형광 으로 표시된 절연 된 전기 를 분리하고 세척하기 위해 나노 여과 기반 의 미세 유체 장치를 제안합니다. 나노 여과 기반 의 미세 유체 장치는 유체 보조 분리 기술 (FAST)17,18을 통해 효율적인 여과를 제공 할 수 있습니다. FAST는 필터 전체의 압력 강하를 줄여 EV와 염료 간의 잠재적 집계를 줄입니다. 잔류 염료를 효율적으로 제거함으로써 형광라벨이 부착된 EV의 품질과 분석의 특이성을 향상시킬 수 있습니다.
공초점 현미경 검사는 세포 표면에 내재화 및 피상적으로 부착된 EV를 구별하고 지각 측량 해상도19,20,21,22,23,24,25에서 EV 섭취량의 세포 메커니즘을 포괄적으로 조사할 수 있다. 예를 들어, Sung et al.은 개발된 라이브 셀 리포터를 사용하여 엑소솜 라이프사이클의 시각화를 설명했습니다. 내부화된 전기자동차의 위치는 공초점 현미경을 3차원(3D) 및 후이미지 처리 툴20으로 검출및 분석하였다. 소형 전기자동차(40-200nm)의 크기는 광학 현미경의 해상도 한계 미만이지만, 광검출기가 향상된 형광 방출을 감지할 수 있기 때문에 형광표시 전기자동차는 공초점 현미경으로 검출될 수 있다. 따라서, 세포 내형 표지된 전기자동차의 세포세포 소중화는 전기자동차와 주변 세포 기관의 여러 z-stacked 이미지를 획득함으로써 정확하게 결정될 수 있다.
또한 3D 재구성 및 사후 데이터 처리는 내부화, 피상적 및 자유 부동 EV의 위치에 대한 추가 통찰력을 제공할 수 있습니다. 공초점 현미경 검사법에 의해 제공되는 시간 경과 라이브 셀 이미징과 함께 이러한 프로세스를 활용하여 EV 섭취량의 수준을 정확하게 평가할 수 있으며 EV 섭취량의 실시간 추적도 가능합니다. 또한, EV 인신 매매 분석은 세포내 기능에 내재된 전기자동차가 어떻게 관여하는지 결정하는 첫 번째 단계인 세포기관과 함께 전기자동차의 공동 국소화를 평가함으로써 공초점 현미경을 사용하여 수행될 수 있다. 이 프로토콜은 나노 여과 계 미세 유체 장치17,26, 공초점 현미경 검사법 및 사후 이미지 분석을 사용하여 EV 섭취량 분석을 수행하는 방법론을 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>353038</td>
			<td>Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Orange CMTMR Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C2927</td>
			<td>Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Apo Lambda S 40XC WI</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77400</td>
			<td>Objective for confocal imaging, NA=1.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo VC 20X</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD70200</td>
			<td>Objective for confocal imaging, NA=0.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exodisc</td>
			<td>Labspinner Inc.</td>
			<td>EX-D1001</td>
			<td>A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoDiscovery</td>
			<td>Labspinner Inc.</td>
			<td>EX-R1001</td>
			<td>Operation device for Exodisc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-depleted FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2720801</td>
			<td>Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1500-500</td>
			<td>Nutrient for cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L preadsorbed</td>
			<td>abcam</td>
			<td>&#160;ab7063</td>
			<td>Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi USA&#160;U DISH &#956;-Dish 35 mm</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td>Culture dish for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 9.7.1</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>9.7.1</td>
			<td>Post-image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer</td>
			<td>Live Cell Instrument</td>
			<td>TU-O-20</td>
			<td>Incubator system for live cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Camera for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Inverted microscope for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 4.50.00</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>4.50.00</td>
			<td>Image processing software for Nikon microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA, NanoSight NS500</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>NS500</td>
			<td>Measurement device for EV concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 2020</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td>9.7.0.185</td>
			<td>Graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Antibiotics for cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21875034</td>
			<td>Cell culture media for PC3 cell line cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solution in DMSO</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S32703</td>
			<td>RNA staining fluorescent dye for the EV labeling</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extracellular vesicle uptake assay via confocal microscope imaging analysis

세포의 세포 외 소포 (EV) 섭취량을 시각화하고 정량화하기 위한 실용적인 에세이가 필요합니다. EV 섭취량은 다양한 연구 분야에서 세포간 통신에 중요한 역할을 합니다. 암 생물학, 신경 과학 및 약물 전달. 많은 EV 섭취량 은 문학에서 보고되었습니다. 그러나 실용적이고 상세한 실험 방법론이 부족합니다. EV 섭취량은 형광 라벨을 부착하여 세포 내의 위치를 감지하여 평가할 수 있습니다. 세포의 내이화 된 전기와 셀의 피상적 인 전기를 구별하는 것은 EV 섭취량을 정확하게 결정하는 것이 어렵지만 중요합니다. 따라서, 3차원(3D) 형광 공초점 현미경을 통해 EV 의 섭취를 효율적으로 정량화하는 분석이 이 작품에서 제안된다. 형광 라벨이 부착된 전기는 나노 여과 계 미세 유체 장치를 사용하여 제조되었으며, 3D 공초점 현미경검사법에 의해 시각화된 다음 고급 이미지 처리 소프트웨어를 통해 분석하였다. 이 프로토콜은 셀룰러 수준에서 전기를 분석하기 위한 강력한 방법론과 효율적인 분석을 위한 실용적인 접근 방식을 제공합니다.

나노 여과 계 미세 유체 장치를 사용하여, 전기는 PC3 CCM에서 분리되고 불소 -컨쥬게이트 EV 특이적 (CD63) 항체로 표시되었다 (도 1). 표지된 EV는 3D 공초점 현미경 검사법(그림 2)에 의해 성공적으로 시각화되었습니다. 표지된 전기 는 엑소좀 고갈된 매체에서 몇 시간 동안 세포로 배양되었다. 배양 후, 세포는 엑소좀 고갈된 매체로 세척하였다. 나머지 EV는...

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Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

세포 외 소포 (전기)는 세포 생물학 및 세포 간 통신에 기여합니다. 세포에 의한 전기자동차 의 섭취를 시각화하고 정량화하기 위한 실용적인 에세이의 필요성이 있다. 현재 프로토콜은 나노 여과 계 미세 유체 장치에 의한 EV 절연에 따라 공초점 현미경 검사를 통해 3차원 형광 이미징을 활용하여 EV uptake 분석법을 제안합니다.

공초점 현미경 화상 진찰 분석을 통해 세포외 소포 Uptake 분석

There is a need for practical assays to visualize and quantify the cells' extracellular vesicle (EV) uptake. EV uptake plays a role in intercellular ...

이 프로토콜은 셀룰러 수준에서 전기를 분석하기 위한 강력한 방법론과 효율적인 EV 섭취 및 EV 추적 분석을 위한 실용적인 접근 방식을 제공합니다. 이 EV 라벨링 방법은 EV와 염료의 공동 침전을 제거하여 EV 신호를 향상시킵니다. EV 섭취량은 피상적 인 전기 EV와 내부화된 전기를 구별하기 위해 체적 분석에 의해 측정됩니다.전기자동차는 활성 화물이므로, 이들의 섭취는 생화학분자의 전달을 허용한다. EV 기반 약물 전달 및 암 치료에 대한 연구를 위해이 기술은 평가 도구가 될 수 있습니다. EV 섭취량은 세포간 통신에서 중요한 역할을 하며 암 생물학, 신경과학 및 약물 전달과 같은 다양한 연구 분야에서 조사됩니다.이 프로토콜은 잠재적으로 효율적인 EV uptake 분석작업을 용이하게 합니다. 세포외 소포 또는 전기 의 격리를 위해, 나노 여과 기반 미세 유체 장치의 샘플 챔버에 사전 처리 된 세포 배양 매체의 1 밀리리터를 주입한다. 장치를 작동하려면 벤치탑 회전 기계에서 장치를 3000 RPM에서 10분 동안 회전합니다.회전 후, 파이펫팅 또는 흡입에 의해 폐기물 챔버에서 유체를 제거한 다음 세포 배양 매체의 추가 2 밀리리터를 처리하기 위해 이 절차를 두 번 반복합니다. 다음으로, 격리된 전기를 세척하고, 샘플 챔버에 PBS의 1밀리리터를 주입하고 벤치탑 회전 기계에서 장치를 회전시킵니다. 전기자동차의 면역형광 라벨링의 경우, EV 특이적 항체의 밀리리터당 1마이크로그램을 절연 된 전기 의 100 마이크로리터를 포함하는 장치의 용출 구멍에 주입한다.그런 다음 플레이트 셰이커에서 어둠 속에서 1시간 동안 배양하여 시료를 가로지르는 항체의 균일한 분포를 보장합니다. 다음으로 용출 구멍에 접착제 테이프를 부착합니다. PBS의 1 밀리리터를 샘플 챔버에 주입하여 잔류 항체를 씻어낸 다음 샘플 챔버가 비어있을 때까지 장치를 회전시하십시오.샘플 챔버에 PBS의 또 다른 밀리리터를 주입하고 이전에 설명한 대로 장치를 회전시켜 세척을 반복한다. 챔버에서 잔류 액을 제거 한 후, 광색 튜브 또는 마이크로 튜브로 멤브레인 챔버에서 형광 라벨 이비드 EV를 피펫. 사용까지 튜브를 빛으로부터 보호하십시오.4번 10번 시드를 4번 1밀리리터 미디어로 35밀리리터 접시에 넣습니다. 세포가 최적의 세포 배양 조건에서 하룻밤 동안 부착되도록 합니다. 다음 날, 부착된 세포를 외성 고갈된 매체로 두 번 씻는다.형광 라벨이 부착된 전기를 엑소좀 고갈된 매체를 사용하여 적절한 농도로 희석한 전기를 희석한 후, 희석된 전기자동차를 부착된 표적 세포에 추가하고 원하는 실험 시간 동안 배양한다. 외성 없는 매체로 세 번 세포를 세척하여 비내화 된 전기를 제거 한 후, CMTMR의 밀리리터 당 하나의 마이크로그램으로 부착 된 세포의 세포질에 라벨을 지정하고 최적의 세포 배양 조건에서 배양하십시오. 라이브 세포 이미징의 경우 준비된 세포를 무대 인큐베이터에 배치합니다.제어 샘플을 기반으로 이미징 매개변수를 설정한 후, 3D 공초점 이미지를 획득하기 위해 Z 방향으로 표적 셀의 깊이와 스태킹 크기 범위를 결정한 다음, 세포별 염료 및 EV 특이적 염료의 여러 Z 적층 이미지로 이미지 수집을 동시에 설정합니다. 이미지 처리를 위해 자동 이미지 프로세싱 소프트웨어를 활용하십시오. 셀의 가상 표면을 빌드하려면 새 서피스 추가를 클릭합니다.가상 셀 표면을 구성하려면 추가 단추를 클릭하고 품질을 필터 유형으로 선택합니다. 육안 검사에 의해 낮은 한계에 적합한 값을 임계값, 상한에 대한 최대 값을 설정하고, 다음 완료 버튼을 클릭하여 EV의 가상 점을 빌드하고, 버튼을 클릭하여 새 스팟 추가 버튼을 클릭합니다. 알고리즘 설정에서 다른 스팟 크기와 최단 거리 계산을 선택한 다음 을 클릭하고 채널 1 알렉사 플루오 488을 소스 채널로 선택합니다.스팟 감지에서 예상 XY 직경에 적합한 값을 입력하고 다음을 클릭합니다. 가상 EV 점을 구성하려면 추가 단추를 클릭하고 품질을 필터 유형으로 선택합니다. 육안 검사를 통해 낮은 임계값을 설정하고 다음 을 클릭하면 스팟 영역 유형의 경우 절대 강도를 선택한 다음 을 클릭합니다.EV 점 영역의 임계값을 임계값으로 설정하려면 육안으로 검사하여 지역 임계값에 적합한 값을 입력합니다. 지역 볼륨 아래에서 직경을 선택하고 마무리를 클릭합니다. 내장된 서피스 내부의 그룹화 된 스팟을 분할하려면 스팟 빌드를 클릭하고 필터로 이동합니다.다음으로 추가 버튼을 클릭하고 표면에 가장 짧은 거리를 선택, 필터 유형으로 표면 1 표면 1. 낮은 제한에 대한 가장 낮은 임계값과 상한에 적합한 값을 설정한 후 중복 섹션을 새 스팟 단추로 클릭합니다. 셀 내부의 전기 EV자동 계산을 위해 빌드스팟 1 선택을 클릭하고 통계로 이동하여 총 반점 수에서 값을 내보냅니다.셀 수를 얻으려면 기본 서피스 1을 클릭한 다음 통계로 이동하여 전체표면 총 수의 값을 내보냅니다. 마지막으로 통계 아래의 자세한 탭으로 이동하여 볼륨을 내보냅니다. 나노여과계 의 미세유체 장치를 이용하여 PC3 세포 배양 배지로부터 분리된 전기자동차는 플루오로-4-공주 된 EV 특이적 항체로 표지되고, 3D 공초점 현미경을 사용하여 시각화되었다.내부화된 EV는 말장난으로 시각화되었으며 이러한 이미지의 개별 EV.Post 처리는 EV 내재화의 시각화 및 정량화를 세포로 시각화하고 정량화할 수 있게 합니다. EV 섭취량 분석 결과는 EV 섭취량수준이 인큐베이션 기간의 길이에 따라 달라지음을 나타냅니다. 지정된 셀에 대한 실제 EV 섭취량 속도를 결정하기 위해 내부화된 전기 TV의 수를 받는 셀 볼륨으로 정규화할 수 있습니다.이 절차를 통해 비내부화된 EV를 체계적으로 배제하여 내부화된 EV 수를 정확하게 측정할 수 있습니다. 내부화된 EV 점의 크기 분포는 여기에 표시됩니다. 따라서 주요 단계는 EV 라벨링을 위한 미세 유체 장치의 사용, 형광 EV를 시각화할 때 배경 형광의 최소화, 그리고 이미징 후 분석을 통해 내부화 대 피상적 전기를 결정하는 것입니다.따라서 세포 내 EV 추적은 3D 평면에서 실시간으로 수행 될 수 있으며, 또한, 공간 / 측두해상도에 대한 EV 인신 매매 분석 및 세포 외 세포 세포기관을 가진 EV의 공동 지역화를 달성 할 수 있습니다. 따라서 이 기술은 전기자동차의 세포통신 분야 내 의 연구자들을 위해 세포내 및 세포외 행렬 내에서 전기자동차를 보다 쉽고 효율적으로 조사할 수 있는 방법을 제공한다고 믿습니다.

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Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Unit 1

Endocytosis and Exocytosis

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Proper Care and Cleaning of the Microscope

현미경의 올바른 관리 및 청소

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

연구

생물학

Major Components of the Light Microscope

라이트 현미경의 주요 구성 요소

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Neurotoxicity 높은 컨텐츠 분석의 연결 및 Astrocyte 공동 문화 분석

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

라이브 세포의 저장소로 작동하는 칼슘 항목의 형광 기반의 측정 : 교양 암 세포에서 골격근 섬유에

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

LDL 콜레스테롤 이해 분석 결과 라이브 셀 이미징 분석 셀을 사용 하 여 상태 모니터링

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...

Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization by Nano-Flow Cytometry

나노유세포분석을 통한 단일 세포외 소포 막횡단 단백질 특성 분석

Single particle characterization has become increasingly relevant for research into extracellular vesicles, progressing from bulk analysis techniques and ...

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

In Vitro 및 In Vivo 모델을 사용한 세포외 Vesicle-Mediated Vascular Calcification 분석

Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world, and vascular calcification is the most significant predictor of cardiovascular events; ...

Multimodal Analytical Platform on a Multiplexed Surface Plasmon Resonance Imaging Chip for the Analysis of Extracellular Vesicle Subsets

세포외 소포 하위 집합 분석을 위한 Multiplexed Surface Plasmon Resonance Imaging Chip의 다중 모드 분석 플랫폼

Extracellular vesicles (EVs) are membrane-derived, tiny vesicles produced by all cells that range from 50 to several hundreds of nanometers in diameter ...

Imaging of Mitochondrial Peroxide in Living Yeast Cells Using mtHyper7

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Advancing Mitochondrial Research Â– mtHyper7 Biosensor for Subcellular Analysis (Video) | JoVE

살아있는 효모 세포에서 미토콘드리아 과산화물을 위한 비율계량 바이오센서인 mtHyPer7의 이미징

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...

Intravital Imaging Using an Inverted Microscope to Track Skin Cell Dynamics

Streamlined Intravital Imaging Approach for Long-Term Monitoring of Epithelial Tissue Dynamics on an Inverted Confocal Microscope

Developing a Tool for Using Inverted Confocal Microscopes for In Vivo Intravital Imaging (Video) | JoVE

도립 컨포칼 현미경에서 상피 조직 역학의 장기 모니터링을 위한 간소화된 생체 내 이미징 접근 방식

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It ...