Name: extracellular vesicle uptake assay via confocal microscope imaging analysis
Uploaded: 2022-02-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av NCI grant nos. U54CA143803, CA163124, CA093900 og CA143055 til K. J. P. Denne forskningen ble støttet av et tilskudd fra Korea Health Technology R&D Project gjennom Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finansiert av Departementet for helse og velferd, Republikken Korea (tilskuddsnummer: HI19C1122). Arbeid av J. Kim og Y.-K. Cho ble støttet av Institute for Basic Science (IBS-R020-D1), finansiert av den koreanske regjeringen. Forfatterne takker nåværende og tidligere medlemmer av Brady Urological Institute, spesielt medlemmer av Pienta-Amend-laboratoriet, for den kritiske lesningen av manuskriptet.

1. EV-isolasjon og immunfluorescerende EV-merking på chip
<ol><li>Innsamling av cellekulturmedier (CCM) og forhåndsbehandling av CCM for EV-isolasjon<ol>
<li>Frø PC3 celler ved 30% samløp i en 75 cm2 cellekultur kolbe. Tillat at kontrollceller vokser til 90 % samløp (~48 h) i standard medie- og cellelinjespesifikke tillegg. MERK: For å forhindre at EV-inneholdende komponenter påvirker cellulært opptak (dvs. foster bovint serum), bruk exosome-utarmede medier og kosttilskudd.</li>
		<li>Høst CCM.</...

<ol>
	<li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+Ectosomes+in+Intercellular+Communication.">Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication.</a> Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).</li><li>Sunkara, V., Woo, H. -. K., Cho, Y. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+techniques+in+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles+and+their+roles+in+cancer+diagnostics+and+prognostics.">Emerging techniques in the isolation and characterization of extracellular vesicles and their roles in cancer diagnostics and prognostics.</a> The Analyst. 141 (2), 371-381 (2016).</li><li>Kalluri, R., Lebleu, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology,+function,+and+biomedical+applications+of+exosomes.">The biology, function, and biomedical applications of exosomes.</a> Science. 367 (6478), (2020).</li><li>Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificities+of+secretion+and+uptake+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+cell-to-cell+communication.">Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).</li><li>Bonsergent, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+characterization+of+extracellular+vesicle+uptake+and+content+delivery+within+mammalian+cells.">Quantitative characterization of extracellular vesicle uptake and content delivery within mammalian cells.</a> Nature Communications. 12, 1864 (2021).</li><li>Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routes+and+mechanisms+of+extracellular+vesicle+uptake.">Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).</li><li>Dehghani, M., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+extracellular+vesicles.">Fluorescent labeling of extracellular vesicles.</a> Methods Enzymology. 645, 15-42 (2020).</li><li>Ragni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovative+Visualization+and+Quantification+of+Extracellular+Vesicles+Interaction+with+and+Incorporation+in+Target+Cells+in+3D+Microenvironments.">Innovative Visualization and Quantification of Extracellular Vesicles Interaction with and Incorporation in Target Cells in 3D Microenvironments.</a> Cells. 9 (5), 1180 (2020).</li><li>Saari, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLIM+reveals+alternative+EV-mediated+cellular+up-take+pathways+of+paclitaxel.">FLIM reveals alternative EV-mediated cellular up-take pathways of paclitaxel.</a> Journal of Controlled Release. 284, 133-143 (2018).</li><li>Franzen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Uptake+and+Internalization+of+Exosomes+by+Bladder+Cancer+Cells.">Characterization of Uptake and Internalization of Exosomes by Bladder Cancer Cells.</a> BioMed Research International. 2014, 619829 (2014).</li><li>Feng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Internalization+of+Exosomes+Occurs+Through+Phagocytosis.">Cellular Internalization of Exosomes Occurs Through Phagocytosis.</a> Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).</li><li>Hoen, E. N. M. N. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+qualitative+flow+cytometric+analysis+of+nanosized+cell-derived+membrane+vesicles.">Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).</li><li>Van Der Vlist, E. J., Nolte-'T Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry.">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).</li><li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+Exosome+Isolation+Techniques.">Progress in Exosome Isolation Techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+perspective+on+exosome+isolation+-+efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics.">and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li><li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+distinct+exosome+subpopulations:+isolation+and+characterization+approaches+and+their+associated+challenges.">Separation of distinct exosome subpopulations: isolation and characterization approaches and their associated challenges.</a> The Analyst. 146 (12), 3731-3749 (2021).</li><li>Woo, H. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exodisc+for+Rapid,+Size-Selective,+and+Efficient+Isolation+and+Analysis+of+Nanoscale+Extracellular+Vesicles+from+Biological+Samples.">Exodisc for Rapid, Size-Selective, and Efficient Isolation and Analysis of Nanoscale Extracellular Vesicles from Biological Samples.</a> ACS Nano. 11 (2), 1360-1370 (2017).</li><li>Kim, T. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAST:+Size-Selective,+Clog-Free+Isolation+of+Rare+Cancer+Cells+from+Whole+Blood+at+a+Liquid-Liquid+Interface.">FAST: Size-Selective, Clog-Free Isolation of Rare Cancer Cells from Whole Blood at a Liquid-Liquid Interface.</a> Analytical Chemistry. 89 (2), 1155-1162 (2017).</li><li>Joshi, B. S., De Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+of+Extracellular+Vesicles+and+Release+of+Their+Cargo+from+Endosomes.">Endocytosis of Extracellular Vesicles and Release of Their Cargo from Endosomes.</a> ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).</li><li>Sung, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+live+cell+reporter+of+exosome+secretion+and+uptake+reveals+pathfinding+behavior+of+migrating+cells.">A live cell reporter of exosome secretion and uptake reveals pathfinding behavior of migrating cells.</a> Nature Communications. 11, 2092 (2020).</li><li>Heusermann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+surf+on+filopodia+to+enter+cells+at+endocytic+hot+spots,+traffic+within+endosomes,+and+are+targeted+to+the+ER.">Exosomes surf on filopodia to enter cells at endocytic hot spots, traffic within endosomes, and are targeted to the ER.</a> Journal of Cell Biology. 213 (2), 173-184 (2016).</li><li>Reclusa, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+extracellular+vesicles+visualization:+From+static+to+motion.">Improving extracellular vesicles visualization: From static to motion.</a> Scientific Reports. 10, 6494 (2020).</li><li>Verweij, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Tracking+of+Inter-organ+Communication+by+Endogenous+Exosomes+In+Vivo.">Live Tracking of Inter-organ Communication by Endogenous Exosomes In Vivo.</a> Developmental Cell. 48 (4), 573-589 (2019).</li><li>Lai, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+tracking+of+tumour+extracellular+vesicle+delivery+and+RNA+translation+using+multiplexed+reporters.">Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters.</a> Nature Communications. 6, 7029 (2015).</li><li>Durak-Kozica, M., Baster, Z., Kubat, K., St&#281;pie&#324;, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+visualization+of+extracellular+vesicle+uptake+by+endothelial+cells.">3D visualization of extracellular vesicle uptake by endothelial cells.</a> Cellular &amp; Molecular Biology Letters. 23, 57 (2018).</li><li>Sunkara, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+Automated,+Label-Free+Isolation+of+Extracellular+Vesicles+from+Whole+Blood+for+Cancer+Diagnosis+and+Monitoring.">Fully Automated, Label-Free Isolation of Extracellular Vesicles from Whole Blood for Cancer Diagnosis and Monitoring.</a> Theranostics. 9 (7), 1851-1863 (2019).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+trophoblastic+small+extracellular+vesicles+and+detection+of+their+miRNA+cargo+in+P-bodies.">Internalization of trophoblastic small extracellular vesicles and detection of their miRNA cargo in P-bodies.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1812261 (2020).</li><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+evaluation+of+methods+for+small+extracellular+vesicles+separation+from+human+plasma,+urine+and+cell+culture+medium.">Comprehensive evaluation of methods for small extracellular vesicles separation from human plasma, urine and cell culture medium.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10, 12044 (2020).</li></ol>

En EV-opptaksanalyse basert på 3D-fluorescensavbildning via konfikal mikroskopi gir en effektiv metodikk og sensitiv analyse. Denne fluorescerende EV-merkingen letter visualiseringen av elbiler og utfører vellykket en presis EV-opptaksanalyse. Tidligere metoder for merking av elbiler og fjerning av restfargestoffet er rapportert ved å fjerne nedbør ved hjelp av ultracentrifugation (UC); UC kan imidlertid samtidig utfelle elbiler, og det immobiliserte fargestoffet kan føre til et falskt positivt <sup class="...

Ekstracellulære vesicles (ELBILER) er nano-størrelse, lipid membranbundne partikler som er kategorisert etter deres størrelser: ektosomer (100-500 nm) og eksosomer (50-150 nm)1. Elbiler inneholder ulike biomolekyler, som proteiner, nukleinsyrer og lipider. Disse biomolekylene stammer fra cellene før de blir innkapslet som last og sluppet ut i det ekstracellulære rommet via elbiler1,2,3.
På grunn av mangfoldet av lasten antas elbiler å spille en aktiv rolle i intercellulær kommunikasjon. Frigjøring og opptak av elbiler etter celler tillater overføring av biomolekyler mellom cellene4,5. Innføringen av EV-last til en celle kan endre mottakercellens funksjoner og homeostatisk tilstand4,5,6. Elbiler internaliseres gjennom flere veier; De eksakte mekanismene er imidlertid ikke nøyaktig demonstrert.
Flertallet av EV-opptaksanalysene, som genetisk merking, merker fluorescerende individuelle elbiler7. Det resulterende signalet kan måles ved mikroplatefotometer, strømningscytometri eller mikroskopi, der hver teknologi har betydelige begrensninger. Mikroplatefotometre, strømningscytometri eller standard todimensjonal (2D) mikroskopi kan ikke skille mellom internalisert og overfladisk festet ELBILER8,9. I tillegg kan den nødvendige prøveforberedelsen for hver av disse teknikkene introdusere ytterligere problemer for EV-opptaksevaluering. For eksempel kan løfting av tilkoblede celler med trypsin før EV-opptaksanalysen spalte noen overfladisk festet elbiler på cellens overflate10,11. Trypsin kan også samhandle med celleoverflaten, som påvirker celle- og EV-fenotypen. I tillegg kan trypsin ikke løsne overfladiske elbiler helt, og forskyve isolerte populasjoner.
For å nøyaktig merke elbiler med fluorescerende fargestoffer, er det nødvendig med ytterligere vasketrinn for å fjerne gjenværende fargestoff7. Aksepterte isolasjonsteknikker kan også bidra til falske positive signaler på grunn av koagulasjon som oppstår under EV-isolasjon. For eksempel er seriell ultracentrifugation (UC) mye brukt til å isolere elbiler og fjerne det immobiliserte fargestoffet. UC kan imidlertid samtidig utfelle elbiler, og restfargen kan føre til et falskt positivt signal12,13. Andre nanofiltreringsmetoder, for eksempel kolonnebasert filtrering, er også mye brukt til ikke-immobilisert fargefjerning. Den komplekse naturen til elbiler og fargestoffer som samhandler innenfor kolonnematrisen, kan føre til ufullstendig fjerning av gjenværende fargestoff på grunn av molekylær avskjæring av kolonnen som endres av den komplekse inngangen14,15,16.
Den nåværende protokollen foreslår en nanofiltreringsbasert mikrofluidisk enhet for å isolere og vaske fluorescerende merkede isolerte elbiler. Den nanofiltreringsbaserte mikrofluidiske enheten kan gi effektiv filtrering via væskeassistert separasjonsteknologi (FAST)17,18. FAST reduserer trykkfallet over filteret, og reduserer dermed potensiell aggregering mellom elbiler og fargestoffer. Ved å effektivt fjerne gjenværende fargestoff, er det mulig å forbedre kvaliteten på fluorescerende merkede elbiler og analysens spesifisitet.
Konfokal mikroskopi kan skille mellom internaliserte og overfladisk tilkoblede elbiler på celleoverflaten og undersøke de cellulære mekanismene for EV-opptak i en romlig oppløsning19,20,21,22,23,24,25. For eksempel beskrev Sung et al. visualiseringen av eksosomets livssyklus ved hjelp av deres utviklede live-celle reporter. Plasseringen av de internaliserte ELBIL-ene ble oppdaget og analysert ved hjelp av et konfokalt mikroskop i tredimensjonale (3D) og etterbildebehandlingsverktøy20. Selv om størrelsen på små elbiler (40-200 nm) er under oppløsningsgrensen for det optiske mikroskopet, kan de fluorescerende merkede ELBIL-ene oppdages ved konfektmikroskopi siden fotodetektoren kan oppdage det forbedrede fluorescensutslippet. Derfor kan den subcellulære lokaliseringen av fluorescerende merkede elbiler i en celle bestemmes nøyaktig ved å skaffe flere z-stablede bilder av ELBIL-ene og de omkringliggende cellulære organellene.
I tillegg kan 3D-rekonstruksjon og etterdatabehandling gi ytterligere innsikt i plasseringen av de internaliserte, overfladiske og frittflytende ELBIL-ene. Ved å bruke disse prosessene i forbindelse med tidsforløpet live-celle bildebehandling som tilbys av konfektmikroskopi, kan nivået av EV-opptak evalueres nøyaktig, og sanntidssporing av EV-opptak er også mulig. Videre kan EV trafficking analyse utføres ved hjelp av konfokal mikroskopi ved å vurdere samlokalisering av elbiler med organeller, et første skritt for å bestemme hvordan internaliserte elbiler er involvert i den intracellulære funksjonen. Denne protokollen beskriver metodikken for å utføre en EV-opptaksanalyse ved hjelp av nanofiltreringsbasert mikrofluidisk enhet17,26, konfikal mikroskopi og analyse etter bilde.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>353038</td>
			<td>Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Orange CMTMR Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C2927</td>
			<td>Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Apo Lambda S 40XC WI</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77400</td>
			<td>Objective for confocal imaging, NA=1.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo VC 20X</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD70200</td>
			<td>Objective for confocal imaging, NA=0.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exodisc</td>
			<td>Labspinner Inc.</td>
			<td>EX-D1001</td>
			<td>A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoDiscovery</td>
			<td>Labspinner Inc.</td>
			<td>EX-R1001</td>
			<td>Operation device for Exodisc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-depleted FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2720801</td>
			<td>Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1500-500</td>
			<td>Nutrient for cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L preadsorbed</td>
			<td>abcam</td>
			<td>&#160;ab7063</td>
			<td>Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi USA&#160;U DISH &#956;-Dish 35 mm</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td>Culture dish for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 9.7.1</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>9.7.1</td>
			<td>Post-image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer</td>
			<td>Live Cell Instrument</td>
			<td>TU-O-20</td>
			<td>Incubator system for live cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Camera for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Inverted microscope for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 4.50.00</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>4.50.00</td>
			<td>Image processing software for Nikon microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA, NanoSight NS500</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>NS500</td>
			<td>Measurement device for EV concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 2020</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td>9.7.0.185</td>
			<td>Graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Antibiotics for cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21875034</td>
			<td>Cell culture media for PC3 cell line cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solution in DMSO</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S32703</td>
			<td>RNA staining fluorescent dye for the EV labeling</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extracellular vesicle uptake assay via confocal microscope imaging analysis

Det er behov for praktiske analyser for å visualisere og kvantifisere cellenes ekstracellulære vesicle (EV) opptak. EV-opptak spiller en rolle i intercellulær kommunikasjon på ulike forskningsfelt; kreftbiologi, nevrovitenskap og legemiddellevering. Mange EV-opptaksanalyser er rapportert i litteraturen; Det er imidlertid mangel på praktisk, detaljert eksperimentell metodikk. EV-opptak kan vurderes ved fluorescerende merking av elbiler for å oppdage deres plassering i celler. Det er vanskelig, men likevel kritisk å skille mellom internaliserte elbiler i celler og overfladiske elbiler på celler, men likevel kritisk, for å nøyaktig bestemme EV-opptaket. Derfor foreslås en analyse som effektivt kvantifiserer EV-opptak gjennom tredimensjonal (3D) fluorescens konfektmikroskopi i dette arbeidet. Fluorescerende merkede elbiler ble tilberedt ved hjelp av en nanofiltreringsbasert mikrofluidisk enhet, visualisert av 3D-konfokal mikroskopi, og deretter analysert gjennom avansert bildebehandlingsprogramvare. Protokollen gir en robust metodikk for å analysere elbiler på cellenivå og en praktisk tilnærming for effektiv analyse.

Ved hjelp av en nanofiltreringsbasert mikrofluidisk enhet ble elbiler isolert fra PC3 CCM og merket med et fluoroforkonjugert EV-spesifikt (CD63) antistoff (figur 1). De merkede ELBIL-ene ble visualisert av 3D-konfokalmikroskopi (figur 2). De merkede ELBIL-ene ble inkubert med celler i flere timer i eksosom-utarmede medier. Etter inkubasjon ble celler vasket med eksosom utarmede medier. De resterende ELBIL-ene ble internalisert eller fulgt til celler under inkub...

Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis at JoVE.com

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Ekstracellulære vesicles (ELBILER) bidrar til cellulær biologi og intercellulær kommunikasjon. Det er behov for praktiske analyser for å visualisere og kvantifisere elbiler opptak av cellene. Den nåværende protokollen foreslår EV-opptaksanalysen ved å bruke tredimensjonal fluorescensavbildning via konfokal mikroskopi, etter EV-isolasjon av en nanofiltreringsbasert mikrofluidisk enhet.

Ekstracellulær vesicle opptak analyse via confocal mikroskop imaging analyse

There is a need for practical assays to visualize and quantify the cells' extracellular vesicle (EV) uptake. EV uptake plays a role in intercellular ...

Denne protokollen gir en robust metodikk for å analysere elbiler på cellenivå, og en praktisk tilnærming for effektiv EV-opptaks- og EV-sporingsanalyse. Denne metoden for EV-merking eliminerer co-nedbør av elbiler og fargestoff, og forbedrer dermed EV-signalene. EV-opptak måles ved volumetrisk analyse for å skille de internaliserte ELBIL-ene fra de overfladiske elbilene.Elbiler er aktiv last, og dermed tillater deres opptak overføring av biokjemiske molekyler. For forskning på EV-basert legemiddellevering og kreftbehandling kan denne teknikken være et vurderingsverktøy. EV-opptak spiller en rolle i intercellulær kommunikasjon og undersøkes på ulike forskningsfelt, for eksempel kreftbiologi, nevrovitenskap og legemiddellevering.Denne protokollen muliggjør potensielt effektiv EV-opptaksanalyse. For isolering av ekstracellulære vesikler, eller elbiler, injiser en milliliter forhåndsbehandlet cellekulturmedier i prøvekammeret til den nanofiltreringsbaserte mikrofluidiske enheten. For å betjene enheten, snurr enheten i den stasjonære spinnemaskinen ved 3000 RPM i 10 minutter.Etter spinning, fjern væsken fra avfallskammeret ved å pipettere eller aspirere, og gjenta deretter denne prosedyren to ganger for behandling av ytterligere to milliliter av cellekulturmediet. Deretter, for å vaske de isolerte ELBIL-ene, injiser en milliliter PBS i prøvekammeret og spinn enheten i spiningmaskinen på benken. For immunfluorescerende merking av elbilene, injiser ett mikrogram per milliliter av det EV-spesifikke antistoffet i elutionhullet til enheten som inneholder 100 mikroliter isolerte elbiler.Inkuber deretter i en time i mørket på en tallerken shaker for å sikre jevn fordeling av antistoffet over prøven. Fest deretter et tape til elutionhullet. Injiser en milliliter PBS i prøvekammeret for å vaske ut gjenværende antistoffer, og spinn deretter enheten til prøvekammeret er tomt.Gjenta vasken ved å injisere en annen milliliter PBS i prøvekammeret, og spinn enheten som vist tidligere. Etter å ha fjernet restvæsken fra kammeret, pipetter du de fluorescerende merkede ELBIL-ene fra membrankammeret til et gult rør eller mikrorør. Beskytt røret mot lys til bruk.Frø fire ganger 10 til de fjerde PC3-cellene i en 35 milliliter tallerken med ett milliliter media. La cellene holde seg over natten under optimale cellekulturforhold. Neste dag vasker du de tillevde cellene to ganger med eksosom-utarmede medier.Etter å ha fortynnet de fluorescerende merkede ELBIL-ene til riktig konsentrasjon ved hjelp av exosome-utarmede medier, legg de fortynnede ELBIL-ene til de festede målcellene og inkuber for ønsket eksperimentell tid. Etter å ha fjernet ikke-internaliserte elbiler ved å vaske cellene tre ganger med eksosolefrie medier, merk cytoplasmaet til de tillevde cellene med ett mikrogram per milliliter CMTMR, og inkuber i optimale cellekulturforhold. For levende celleavbildning, plasser de forberedte cellene i onstage-inkubatoren.Når du har angitt bildeparameterne basert på kontrollprøver, bestemmer du dybden på målcellene og området for stablingsstørrelse i Z-retningen for å skaffe 3D-konfiskeringsbilder, og deretter angir du bildeanskaffelsen til flere Z-stablede bilder av både cellespesifikk fargestoff og EV-spesifikt fargestoff samtidig. For bildebehandling, bruk automatisk bildebehandlingsprogramvare. Hvis du vil bygge virtuelle overflater av cellene, klikker du på Legg til nye overflater.Hvis du vil konfigurere de virtuelle celleoverflatene, klikker du Legg til og velger Kvalitet som filtertype. Terskel for den aktuelle verdien for den lave grensen ved visuell inspeksjon, angi maksimumsverdien for den øvre grensen og klikk Fullfør-knappen Neste for å bygge de virtuelle prikkene på EVene, klikk knappen Legg til nye flekker. Velg Ulike spotstørrelser og Beregning av korteste distanse under Algoritmeinnstillinger, klikk deretter Neste og velg Kanal 1 Alexa Fluor 488 som kildekanal.Angi riktig verdi for den estimerte XY-diameteren under Spotregistrering, og klikk Neste. Hvis du vil konfigurere de virtuelle EV-prikkene, klikker du Legg til og velger Kvalitet som filtertype. Angi den nedre terskelen ved en visuell inspeksjon, og klikk Neste for spotregiontype, velg Absolutt intensitet, og klikk deretter Neste.Hvis du vil terskelverdi for området EV-prikker, angir du den aktuelle verdien for Regionterskel ved visuell inspeksjon. Velg Diameter fra under Regionvolum, og klikk Fullfør. Hvis du vil dele de grupperte flekkene inne i den innebygde overflaten, klikker du byggeplassene og går inn i Filtre.Deretter klikker du legg til-knappen og velger Korteste avstand til overflater, overflater overflate 1 som filtertype. Når du har satt den laveste terskelen for den lave grensen og den aktuelle verdien for den øvre grensen, klikker du Dupliser inndeling til den nye Spots -knappen. Hvis du vil telle elbiler automatisk inne i cellene, klikker du det merkede området Innebygde spot 1, går til Statistikk og eksporterer verdien fra Totalt antall spotplasser.Hvis du vil ha tak i antall celler, klikker du Påbygde overflater 1, går deretter til Statistikk og eksporterer verdien for Totalt antall overflater fra Totalt. Til slutt går du til Detaljert-fanen under Statistikk for å eksportere volumet. Elbiler isolert fra PC3 cellekulturmedier ved hjelp av en nanofiltreringsbasert mikrofluidisk enhet ble merket med en fluor-4-konjugert EV-spesifikt antistoff, og visualisert ved hjelp av 3D konfokal mikroskopi.De internaliserte ELBIL-ene ble visualisert som puncta, og en individuell EV.Post-prosessering av disse bildene gjør det mulig å visualisere og kvantifisere EV-internalisering i cellene. EV-opptaksanalyseresultatene indikerer at nivået på EV-opptaket avhenger av lengden på inkubasjonsperioden. Antall internaliserte elbiler kan normaliseres til mottakercellevolumet for å bestemme den faktiske hastigheten på EV-opptaket for den angitte cellen.Denne prosedyren gjør det mulig for systematisk utelukkelse av ikke-internaliserte elbiler å nøyaktig måle antall internaliserte elbiler. Størrelsesfordelingen for internaliserte EV-prikker vises her. Så de viktigste trinnene er bruken av den mikrofluidiske enheten for EV-merking, minimering av bakgrunnsfluorescens når du visualiserer fluorescerende elbiler, og deretter postavbildningsanalysen for å bestemme internaliserte versus overfladiske elbiler.Så intracellulær EV-sporing kan utføres i sanntid på et 3D-fly, og i tillegg kan EV trafficking-analyse på romlige / temporale oppløsninger og samlokalisering av elbiler med subcellulære organeller oppnås. Så vi mener at denne teknikken gir en enklere og mer effektiv måte å undersøke elbiler innenfor de intra- og ekstracellulære matrisene for forskere innen det cellulære kommunikasjonsfeltet for elbiler.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Unit 1

Endocytosis and Exocytosis

SCIENTISTS IN ACTION

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluorescens-basert Måling av Store-opererte Calcium Entry i levende celler: fra Helstøpt Cancer Cell til Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

LDL Kolesterol opptaksanalyse bruke levende celle Imaging analyse med cellen helseovervåking

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...

Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization by Nano-Flow Cytometry

Enkelt ekstracellulær vesikkel transmembranproteinkarakterisering ved nano-flowcytometri

Single particle characterization has become increasingly relevant for research into extracellular vesicles, progressing from bulk analysis techniques and ...

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

Analyse av ekstracellulær vesikkelmediert vaskulær forkalkning ved bruk av in vitro og in vivo modeller

Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world, and vascular calcification is the most significant predictor of cardiovascular events; ...

Multimodal Analytical Platform on a Multiplexed Surface Plasmon Resonance Imaging Chip for the Analysis of Extracellular Vesicle Subsets

Multimodal analytisk plattform på en multiplekset overflateplasmon resonans imaging chip for analyse av ekstracellulære vesikkelundergrupper

Extracellular vesicles (EVs) are membrane-derived, tiny vesicles produced by all cells that range from 50 to several hundreds of nanometers in diameter ...

Imaging of Mitochondrial Peroxide in Living Yeast Cells Using mtHyper7

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Advancing Mitochondrial Research Â– mtHyper7 Biosensor for Subcellular Analysis (Video) | JoVE

Avbildning av mtHyPer7, en ratiometrisk biosensor for mitokondrielt peroksid, i levende gjærceller

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...

Intravital Imaging Using an Inverted Microscope to Track Skin Cell Dynamics

Streamlined Intravital Imaging Approach for Long-Term Monitoring of Epithelial Tissue Dynamics on an Inverted Confocal Microscope

Developing a Tool for Using Inverted Confocal Microscopes for In Vivo Intravital Imaging (Video) | JoVE

Strømlinjeformet intravital bildebehandlingstilnærming for langsiktig overvåking av epitelvevsdynamikk på et invertert konfokalmikroskop

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It ...