Name: extracellular vesicle uptake assay via confocal microscope imaging analysis
Uploaded: 2022-02-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo NCI Grant Nos. U54CA143803, CA163124, CA093900 e CA143055 a K. J. P. Esta pesquisa foi apoiada por uma bolsa do Korea Health Technology P&D Project através do Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), financiado pelo Ministério da Saúde & Bem-Estar, República da Coreia (número de subvenção: HI19C1122). Trabalho de J. Kim e Y.-K. Cho foi apoiado pelo Institute for Basic Science (IBS-R020-D1), financiado pelo Governo coreano. Os autores agradecem aos atuais e antigos membros do Instituto Urológico Brady, especialmente membros do laboratório Pienta-Amend, pela leitura crítica do manuscrito.

1. Isolamento de EV e rotulagem EV imuno-fluorescente on-chip
<ol><li>Coleta de mídia de cultura celular (CCM) e pré-processamento de CCM para isolamento de EV<ol>
<li>Células de semente PC3 a 30% de confluência em um frasco de cultura celular de 75 cm2 . Permitir que as células de controle cresçam até 90% de confluência (~48 h) em mídia padrão e suplementos específicos de linha celular. NOTA: Para evitar que os componentes contendo EV afetem a captação celular (ou seja, soro bovino fetal), u...

<ol>
	<li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+Ectosomes+in+Intercellular+Communication.">Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication.</a> Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).</li><li>Sunkara, V., Woo, H. -. K., Cho, Y. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+techniques+in+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles+and+their+roles+in+cancer+diagnostics+and+prognostics.">Emerging techniques in the isolation and characterization of extracellular vesicles and their roles in cancer diagnostics and prognostics.</a> The Analyst. 141 (2), 371-381 (2016).</li><li>Kalluri, R., Lebleu, V. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exodisc+for+Rapid,+Size-Selective,+and+Efficient+Isolation+and+Analysis+of+Nanoscale+Extracellular+Vesicles+from+Biological+Samples.">Exodisc for Rapid, Size-Selective, and Efficient Isolation and Analysis of Nanoscale Extracellular Vesicles from Biological Samples.</a> ACS Nano. 11 (2), 1360-1370 (2017).</li><li>Kim, T. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAST:+Size-Selective,+Clog-Free+Isolation+of+Rare+Cancer+Cells+from+Whole+Blood+at+a+Liquid-Liquid+Interface.">FAST: Size-Selective, Clog-Free Isolation of Rare Cancer Cells from Whole Blood at a Liquid-Liquid Interface.</a> Analytical Chemistry. 89 (2), 1155-1162 (2017).</li><li>Joshi, B. S., De Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+live+cell+reporter+of+exosome+secretion+and+uptake+reveals+pathfinding+behavior+of+migrating+cells.">A live cell reporter of exosome secretion and uptake reveals pathfinding behavior of migrating cells.</a> Nature Communications. 11, 2092 (2020).</li><li>Heusermann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+surf+on+filopodia+to+enter+cells+at+endocytic+hot+spots,+traffic+within+endosomes,+and+are+targeted+to+the+ER.">Exosomes surf on filopodia to enter cells at endocytic hot spots, traffic within endosomes, and are targeted to the ER.</a> Journal of Cell Biology. 213 (2), 173-184 (2016).</li><li>Reclusa, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+extracellular+vesicles+visualization:+From+static+to+motion.">Improving extracellular vesicles visualization: From static to motion.</a> Scientific Reports. 10, 6494 (2020).</li><li>Verweij, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Tracking+of+Inter-organ+Communication+by+Endogenous+Exosomes+In+Vivo.">Live Tracking of Inter-organ Communication by Endogenous Exosomes In Vivo.</a> Developmental Cell. 48 (4), 573-589 (2019).</li><li>Lai, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+tracking+of+tumour+extracellular+vesicle+delivery+and+RNA+translation+using+multiplexed+reporters.">Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters.</a> Nature Communications. 6, 7029 (2015).</li><li>Durak-Kozica, M., Baster, Z., Kubat, K., St&#281;pie&#324;, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+visualization+of+extracellular+vesicle+uptake+by+endothelial+cells.">3D visualization of extracellular vesicle uptake by endothelial cells.</a> Cellular &amp; Molecular Biology Letters. 23, 57 (2018).</li><li>Sunkara, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+Automated,+Label-Free+Isolation+of+Extracellular+Vesicles+from+Whole+Blood+for+Cancer+Diagnosis+and+Monitoring.">Fully Automated, Label-Free Isolation of Extracellular Vesicles from Whole Blood for Cancer Diagnosis and Monitoring.</a> Theranostics. 9 (7), 1851-1863 (2019).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+trophoblastic+small+extracellular+vesicles+and+detection+of+their+miRNA+cargo+in+P-bodies.">Internalization of trophoblastic small extracellular vesicles and detection of their miRNA cargo in P-bodies.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1812261 (2020).</li><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+evaluation+of+methods+for+small+extracellular+vesicles+separation+from+human+plasma,+urine+and+cell+culture+medium.">Comprehensive evaluation of methods for small extracellular vesicles separation from human plasma, urine and cell culture medium.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10, 12044 (2020).</li></ol>

Um ensaio de absorção de EV baseado em imagens de fluorescência 3D via microscopia confocal fornece uma metodologia eficiente e uma análise sensível. Esta rotulagem fluorescente de EV facilita a visualização de EVs e executa com sucesso um ensaio preciso de absorção de EV. Métodos anteriores para rotular EVs e remover o corante residual foram relatados removendo a precipitação usando ultracentrifugação (UC); no entanto, a UC pode co-precipitar EVs, e o corante imobilizado pode levar a um sinal <sup...

Vesículas extracelulares (EVs) são partículas nano-dimensionadas e ligadas à membrana lipídica que são categorizadas por seus tamanhos: ectosomos (100-500 nm) e exosósmos (50-150 nm)1. Os EVs contêm várias biomoléculas, como proteínas, ácidos nucleicos e lipídios. Essas biomoléculas originam-se das células antes de serem encapsuladas como carga e liberadas no espaço extracelular via EVs1,2,3.
Devido à variedade de sua carga, acredita-se que os EVs desempenham um papel ativo na comunicação intercelular. A liberação e absorção de EVs por células permitem a transferência de biomoléculas entre as células4,5. A introdução da carga EV em uma célula pode alterar as funções da célula receptora e o estado homeostático4,5,6. Os EVs são internalizados através de múltiplas vias; no entanto, os mecanismos exatos não foram demonstrados com precisão.
A maioria dos ensaios de absorção de EV, como a marcação genética, rotulam fluorescentemente EVs7 individuais. O sinal resultante pode ser medido por fotômetro de microplatograma, citometria de fluxo ou microscopia, com cada tecnologia tendo limitações substanciais. Os fotômetros de microplape, a citometria de fluxo ou a microscopia bidimensional padrão (2D) não podem distinguir entre EVs8,9 internalizados e superficialmente ligados. Além disso, a preparação necessária da amostra para cada uma dessas técnicas pode introduzir problemas adicionais à avaliação de absorção de EV. Por exemplo, o levantamento de células aderidas com trippsina antes da análise de absorção do EV pode cortar alguns EVs superficialmente ligados na superfície da célula10,11. A trippsina também pode interagir com a superfície celular, afetando o fenótipo celular e EV. Além disso, a trippsina pode não desaprender eVs superficiais inteiramente, distorcendo populações isoladas.
Para rotular com precisão os EVs com corantes fluorescentes, são necessárias etapas adicionais de lavagem para remover o corante residual7. Técnicas de isolamento aceitas também podem contribuir para sinais falso-positivos devido à coagulação que ocorre durante o isolamento do EV. Por exemplo, a ultracentrifugação serial (UC) é amplamente usada para isolar EVs e remover o corante imobilizado. No entanto, a UC pode co-precipitar EVs, e o corante residual pode levar a um sinal falso-positivo12,13. Outros métodos de nano-filtração, como filtração baseada em coluna, também são amplamente utilizados para a remoção de corantes não imobilizados. A natureza complexa dos EVs e da interação de corantes dentro da matriz da coluna pode levar à remoção incompleta do corante residual devido ao corte molecular da coluna ser alterado pelo complexo insumo14,15,16.
O protocolo atual propõe um dispositivo microfluido à base de nano-filtração para isolar e lavar EVs isolados fluorescentes. O dispositivo microfluido baseado em nano-filtração pode fornecer filtração eficiente através da tecnologia de separação assistida por fluidos (FAST)17,18. O FAST reduz a queda de pressão através do filtro, reduzindo assim a agregação potencial entre EVs e corantes. Ao remover eficientemente o corante residual, é possível melhorar a qualidade dos EVs rotulados fluorescentes e a especificidade do ensaio.
A microscopia confocal pode distinguir entre EVs internalizados e superficialmente ligados na superfície celular e investigar de forma abrangente os mecanismos celulares de absorção de EV em uma resolução espacial19,20,21,22,23,24,25. Por exemplo, Sung et al. descreveram a visualização do ciclo de vida exossomo usando seu repórter desenvolvido ao vivo. A localização dos EVs internalizados foi detectada e analisada utilizando um microscópio confocal em ferramentas de processamento de três dimensões (3D) e pós-imagem20. Embora o tamanho dos pequenos EVs (40-200 nm) esteja abaixo do limite de resolução do microscópio óptico, os EVs rotulados fluorescentemente podem ser detectados por microscopia confocal, uma vez que o fotodetetor pode detectar a emissão de fluorescência aprimorada. Portanto, a localização subcelular dos EVs fluorescentes rotulados dentro de uma célula pode ser precisamente determinada adquirindo múltiplas imagens empilhadas de z dos EVs e das organelas celulares circundantes.
Além disso, a reconstrução 3D e o processamento pós-dados podem fornecer mais informações sobre o posicionamento dos EVs internalizados, superficiais e flutuantes. Ao utilizar esses processos em conjunto com as imagens de células vivas de lapso de tempo oferecidas pela microscopia confocal, o nível de absorção de EV pode ser avaliado com precisão, e o rastreamento em tempo real da captação de EV também é possível. Além disso, a análise do tráfico de EV pode ser realizada por meio de microscopia confocal, avaliando a co-localização de EVs com organelas, um primeiro passo para determinar como os EVs internalizados estão envolvidos na função intracelular. Este protocolo descreve a metodologia para a realização de um ensaio de absorção de EV usando o dispositivo microfluido baseado em nanofiliação17,26, microscopia confocal e análise pós-imagem.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>353038</td>
			<td>Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Orange CMTMR Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C2927</td>
			<td>Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Apo Lambda S 40XC WI</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77400</td>
			<td>Objective for confocal imaging, NA=1.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo VC 20X</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD70200</td>
			<td>Objective for confocal imaging, NA=0.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exodisc</td>
			<td>Labspinner Inc.</td>
			<td>EX-D1001</td>
			<td>A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoDiscovery</td>
			<td>Labspinner Inc.</td>
			<td>EX-R1001</td>
			<td>Operation device for Exodisc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-depleted FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2720801</td>
			<td>Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1500-500</td>
			<td>Nutrient for cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L preadsorbed</td>
			<td>abcam</td>
			<td>&#160;ab7063</td>
			<td>Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi USA&#160;U DISH &#956;-Dish 35 mm</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td>Culture dish for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 9.7.1</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>9.7.1</td>
			<td>Post-image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer</td>
			<td>Live Cell Instrument</td>
			<td>TU-O-20</td>
			<td>Incubator system for live cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Camera for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Inverted microscope for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 4.50.00</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>4.50.00</td>
			<td>Image processing software for Nikon microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA, NanoSight NS500</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>NS500</td>
			<td>Measurement device for EV concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 2020</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td>9.7.0.185</td>
			<td>Graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Antibiotics for cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21875034</td>
			<td>Cell culture media for PC3 cell line cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solution in DMSO</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S32703</td>
			<td>RNA staining fluorescent dye for the EV labeling</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extracellular vesicle uptake assay via confocal microscope imaging analysis

Há necessidade de ensaios práticos para visualizar e quantificar a absorção de vesícula extracelular (EV) das células. A captação de EV desempenha um papel na comunicação intercelular em diversas áreas de pesquisa; biologia do câncer, neurociência e entrega de drogas. Muitos ensaios de absorção de EV foram relatados na literatura; no entanto, há uma falta de metodologia experimental prática e detalhada. A absorção de EV pode ser avaliada rotulando fluorescentemente EVs para detectar sua localização dentro das células. A distinção entre EVs internalizados nas células e os EVs superficiais nas células é difícil, mas crítica, determinar com precisão a absorção de EV. Portanto, um ensaio que quantifica eficientemente a absorção de EV através de microscopia de fluorescência tridimensional (3D) é proposto neste trabalho. Os EVs fluorescentes foram preparados usando um dispositivo microfluido baseado em nanofiliação, visualizado por microscopia confocal 3D e, em seguida, analisados através de software avançado de processamento de imagem. O protocolo fornece uma metodologia robusta para a análise de EVs em nível celular e uma abordagem prática para uma análise eficiente.

Utilizando um dispositivo microfluido à base de nano-filtração, os EVs foram isolados do PC3 CCM e rotulados com um anticorpo ev específico (CD63) conjugado por fluoroforeiro (Figura 1). Os EVs rotulados foram visualizados com sucesso pela microscopia confocal 3D (Figura 2). Os EVs rotulados foram incubados com células por várias horas em mídia exosome-esgotada. Após a incubação, as células foram lavadas com mídia exósia esgotada. Os EVs restantes f...

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Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Vesículos extracelulares (EVs) contribuem para a biologia celular e comunicações intercelulares. Há necessidade de ensaios práticos para visualizar e quantificar a absorção de EVs pelas células. O protocolo atual propõe o ensaio de absorção de EV utilizando imagens de fluorescência tridimensional através de microscopia confocal, após o isolamento do EV por um dispositivo microfluido baseado em nanofilição.

Ensaio de absorção de vesícula extracelular via análise de imagens de microscópio confocal

There is a need for practical assays to visualize and quantify the cells' extracellular vesicle (EV) uptake. EV uptake plays a role in intercellular ...

Este protocolo fornece uma metodologia robusta para analisar EVs a nível celular, e uma abordagem prática para uma absorção eficiente de EV e análise de rastreamento de EV. Este método de rotulagem EV elimina a co-precipitação de EVs e corante, melhorando assim os sinais de EV. A captação de EV é medida pela análise volumétrica para distinguir os EVs internalizados dos EVs superficiais.Os EVs são carga ativa, assim, sua captação permite a transferência de moléculas bioquímicas. Para pesquisas sobre a entrega de medicamentos à base de EV e terapia contra o câncer, essa técnica pode ser uma ferramenta de avaliação. A absorção de EV desempenha um papel na comunicação intercelular e é investigada em diversas áreas de pesquisa, como biologia do câncer, neurociência e entrega de medicamentos.Este protocolo potencialmente facilita um ensaio eficiente de absorção de EV. Para o isolamento de vesículas extracelulares, ou EVs, injete um mililitro de mídia de cultura celular pré-processada na câmara amostral do dispositivo microfluido baseado em nanofiltração. Para operar o dispositivo, gire o dispositivo na máquina giratória benchtop a 3000 RPM por 10 minutos.Após girar, remova o fluido da câmara de resíduos por pipetação ou aspiração, em seguida, repita este procedimento duas vezes para o processamento de mais dois mililitros da mídia de cultura celular. Em seguida, para lavar os EVs isolados, injete um mililitro de PBS na câmara de amostra e gire o dispositivo na máquina giratória benchtop. Para rotulagem imunofluorescente dos EVs, injete um micrograma por mililitro do anticorpo específico do EV no orifício de eluição do dispositivo contendo 100 microliters de EVs isolados.Em seguida, incubar por uma hora no escuro em um agitador de placas para garantir a distribuição uniforme do anticorpo através da amostra. Em seguida, conecte uma fita adesiva ao orifício de eluição. Injete um mililitro de PBS na câmara de amostra para lavar anticorpos residuais e gire o dispositivo até que a câmara de amostra esteja vazia.Repita a lavagem injetando outro mililitro de PBS na câmara de amostra, e girando o dispositivo como demonstrado anteriormente. Depois de remover o fluido residual da câmara, pipeta os EVs fluorescentes rotulados da câmara de membrana em um tubo âmbar ou micro tubo. Proteja o tubo da luz até usar.Semente quatro vezes 10 para a quarta células PC3 em um prato de 35 mililitros com uma mídia mililitro. Permita que as células aderam durante a noite em condições ideais de cultura celular. No dia seguinte, lave as células aderidas duas vezes com mídia exososome-esgotada.Depois de diluir os EVs fluorescentes rotulados para a concentração apropriada usando mídia exosome-esgotada, adicione os EVs diluídos às células-alvo aderidas e incubar para o tempo experimental desejado. Depois de remover EVs não internalizados lavando as células três vezes com mídia livre de exosome, rotule o citoplasma das células aderidas com um micrograma por mililitro de CMTMR e incuba em condições ideais de cultura celular. Para imagens de células vivas, coloque as células preparadas na incubadora do palco.Depois de definir os parâmetros de imagem baseados em amostras de controle, determine a profundidade das células-alvo e a faixa de tamanho de empilhamento na direção Z para adquirir imagens confocal 3D e, em seguida, defina a aquisição de imagem para múltiplas imagens empilhadas em Z de corante específico de células e corante específico do EV simultaneamente. Para processamento de imagens, utilize o software automático de processamento de imagens. Para construir superfícies virtuais das células, clique em Adicionar novas superfícies.Para configurar as superfícies de células virtuais, clique no botão Adicionar e selecione Qualidade como o tipo de filtro. Limite o valor apropriado para o limite baixo por inspeção visual, defina o valor máximo para o limite superior e clique no botão Concluir em seguida, para construir os pontos virtuais dos EVs, clique no botão Adicionar novos pontos. Em Configurações de algoritmo, selecione Diferentes tamanhos de ponto e cálculo de distância mais curto, em seguida, clique em Próximo e selecione Canal 1 Alexa Fluor 488 como o canal de origem.Digite o valor apropriado para o diâmetro XY estimado em Detecção de Ponto e clique em Next. Para configurar os pontos EV virtuais, clique no botão Adicionar e selecione Qualidade como o tipo de filtro. Defina o limiar inferior por uma inspeção visual e clique em "Seguintes para as regiões spot", selecione Intensidade Absoluta e clique em Seguir.Para limiar da região de pontos EV, digite o valor adequado para Limiar da Região por inspeção visual. Selecione Diâmetro Em volume de região e clique em Concluir. Para dividir os pontos agrupados dentro da superfície construída, clique nas manchas de compilação e entre em Filtros.Em seguida clique no botão Adicionar e selecione A distância mais curta para superfícies, superfícies surface 1 como o tipo de filtro. Depois de definir o limite mais baixo para o limite baixo e o valor apropriado para o limite superior, clique na Seção Duplicada para o novo botão Pontos. Para a contagem automática de EVs dentro das células, clique na seleção Built Spots 1, vá para Estatísticas e exporte o valor do Número Total de Pontos.Para obter o número de células, clique nas Superfícies Construídas 1, em seguida, vá para Estatísticas e exporte o valor do número total de superfícies de geral. Por fim, vá para a guia Detalhado em Estatísticas para exportar o volume. Os EVs isolados da mídia de cultura celular PC3 usando um dispositivo microfluido baseado em nanofiltração foram rotulados com um anticorpo específico ev fluoro-4 conjugado, e visualizados usando microscopia confocal 3D.Os EVs internalizados foram visualizados como puncta e um processamento individual EV.Post dessas imagens permite a visualização e quantificação da internalização do EV nas células. Os resultados do ensaio de absorção de EV indicam que o nível de absorção de EV depende da duração do período de incubação. O número de EVs internalizados pode ser normalizado para o volume da célula receptora para determinar a taxa real de absorção de EV para a célula especificada.Este procedimento permite a exclusão sistemática de EVs não internalizados para medir precisamente o número de EVs internalizados. A distribuição de tamanho dos pontos EV internalizados é mostrada aqui. Assim, os principais passos são a utilização do dispositivo microfluido para rotulagem EV, a minimização da fluorescência de fundo ao visualizar EVs fluorescentes e, em seguida, a análise pós-imagem para determinar EVs internalizados versus superficiais.Assim, o rastreamento intracelular de EV pode ser realizado em tempo real em um plano 3D e, além disso, a análise de tráfico de EV sobre resoluções espaciais/temporais e a co-localização de EVs com organelas subcelulares podem ser alcançadas. Por isso, acreditamos que essa técnica fornece uma maneira mais fácil e eficiente de investigar EVs dentro das matrizes intra e extracelulares para pesquisadores dentro do campo de comunicação celular para EVs.

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Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

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