Name: extracellular vesicle uptake assay via confocal microscope imaging analysis
Uploaded: 2022-02-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами NCI nos. U54CA143803, CA163124, CA093900 и CA143055 к K. J. P. Это исследование было поддержано грантом Корейского проекта исследований и разработок в области технологий здравоохранения через Корейский институт развития индустрии здравоохранения (KHIDI), финансируемый Министерством здравоохранения и социального обеспечения Республики Корея (номер гранта: HI19C1122). Работы Д. Кима и Ю.-К. Чо был поддержан Институтом фундаментальных наук (IBS-R020-D1), финансируемым корейским правительством. Авторы благодарят нынешних и бывших членов Урологического института Брейди, особенно сотрудников лаборатории Pienta-Amend, за критическое прочтение рукописи.

1. Изоляция электромобилей и встроенная иммунофлуоресцентная маркировка электромобилей
<ol><li>Сбор сред клеточных культур (CCM) и предварительная обработка CCM для изоляции EV<ol>
<li>Семена клеток PC3 при 30% слиянии в колбу для культивирования клеток объемом 75 см2 . Позвольте контрольным к...

<ol>
	<li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+Ectosomes+in+Intercellular+Communication.">Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication.</a> Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).</li><li>Sunkara, V., Woo, H. -. K., Cho, Y. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+techniques+in+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles+and+their+roles+in+cancer+diagnostics+and+prognostics.">Emerging techniques in the isolation and characterization of extracellular vesicles and their roles in cancer diagnostics and prognostics.</a> The Analyst. 141 (2), 371-381 (2016).</li><li>Kalluri, R., Lebleu, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology,+function,+and+biomedical+applications+of+exosomes.">The biology, function, and biomedical applications of exosomes.</a> Science. 367 (6478), (2020).</li><li>Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificities+of+secretion+and+uptake+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+cell-to-cell+communication.">Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).</li><li>Bonsergent, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+characterization+of+extracellular+vesicle+uptake+and+content+delivery+within+mammalian+cells.">Quantitative characterization of extracellular vesicle uptake and content delivery within mammalian cells.</a> Nature Communications. 12, 1864 (2021).</li><li>Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routes+and+mechanisms+of+extracellular+vesicle+uptake.">Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).</li><li>Dehghani, M., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+extracellular+vesicles.">Fluorescent labeling of extracellular vesicles.</a> Methods Enzymology. 645, 15-42 (2020).</li><li>Ragni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovative+Visualization+and+Quantification+of+Extracellular+Vesicles+Interaction+with+and+Incorporation+in+Target+Cells+in+3D+Microenvironments.">Innovative Visualization and Quantification of Extracellular Vesicles Interaction with and Incorporation in Target Cells in 3D Microenvironments.</a> Cells. 9 (5), 1180 (2020).</li><li>Saari, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLIM+reveals+alternative+EV-mediated+cellular+up-take+pathways+of+paclitaxel.">FLIM reveals alternative EV-mediated cellular up-take pathways of paclitaxel.</a> Journal of Controlled Release. 284, 133-143 (2018).</li><li>Franzen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Uptake+and+Internalization+of+Exosomes+by+Bladder+Cancer+Cells.">Characterization of Uptake and Internalization of Exosomes by Bladder Cancer Cells.</a> BioMed Research International. 2014, 619829 (2014).</li><li>Feng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Internalization+of+Exosomes+Occurs+Through+Phagocytosis.">Cellular Internalization of Exosomes Occurs Through Phagocytosis.</a> Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).</li><li>Hoen, E. N. M. N. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+qualitative+flow+cytometric+analysis+of+nanosized+cell-derived+membrane+vesicles.">Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).</li><li>Van Der Vlist, E. J., Nolte-'T Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry.">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).</li><li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+Exosome+Isolation+Techniques.">Progress in Exosome Isolation Techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+perspective+on+exosome+isolation+-+efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics.">and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li><li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+distinct+exosome+subpopulations:+isolation+and+characterization+approaches+and+their+associated+challenges.">Separation of distinct exosome subpopulations: isolation and characterization approaches and their associated challenges.</a> The Analyst. 146 (12), 3731-3749 (2021).</li><li>Woo, H. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exodisc+for+Rapid,+Size-Selective,+and+Efficient+Isolation+and+Analysis+of+Nanoscale+Extracellular+Vesicles+from+Biological+Samples.">Exodisc for Rapid, Size-Selective, and Efficient Isolation and Analysis of Nanoscale Extracellular Vesicles from Biological Samples.</a> ACS Nano. 11 (2), 1360-1370 (2017).</li><li>Kim, T. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAST:+Size-Selective,+Clog-Free+Isolation+of+Rare+Cancer+Cells+from+Whole+Blood+at+a+Liquid-Liquid+Interface.">FAST: Size-Selective, Clog-Free Isolation of Rare Cancer Cells from Whole Blood at a Liquid-Liquid Interface.</a> Analytical Chemistry. 89 (2), 1155-1162 (2017).</li><li>Joshi, B. S., De Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+of+Extracellular+Vesicles+and+Release+of+Their+Cargo+from+Endosomes.">Endocytosis of Extracellular Vesicles and Release of Their Cargo from Endosomes.</a> ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).</li><li>Sung, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+live+cell+reporter+of+exosome+secretion+and+uptake+reveals+pathfinding+behavior+of+migrating+cells.">A live cell reporter of exosome secretion and uptake reveals pathfinding behavior of migrating cells.</a> Nature Communications. 11, 2092 (2020).</li><li>Heusermann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+surf+on+filopodia+to+enter+cells+at+endocytic+hot+spots,+traffic+within+endosomes,+and+are+targeted+to+the+ER.">Exosomes surf on filopodia to enter cells at endocytic hot spots, traffic within endosomes, and are targeted to the ER.</a> Journal of Cell Biology. 213 (2), 173-184 (2016).</li><li>Reclusa, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+extracellular+vesicles+visualization:+From+static+to+motion.">Improving extracellular vesicles visualization: From static to motion.</a> Scientific Reports. 10, 6494 (2020).</li><li>Verweij, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Tracking+of+Inter-organ+Communication+by+Endogenous+Exosomes+In+Vivo.">Live Tracking of Inter-organ Communication by Endogenous Exosomes In Vivo.</a> Developmental Cell. 48 (4), 573-589 (2019).</li><li>Lai, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+tracking+of+tumour+extracellular+vesicle+delivery+and+RNA+translation+using+multiplexed+reporters.">Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters.</a> Nature Communications. 6, 7029 (2015).</li><li>Durak-Kozica, M., Baster, Z., Kubat, K., St&#281;pie&#324;, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+visualization+of+extracellular+vesicle+uptake+by+endothelial+cells.">3D visualization of extracellular vesicle uptake by endothelial cells.</a> Cellular &amp; Molecular Biology Letters. 23, 57 (2018).</li><li>Sunkara, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+Automated,+Label-Free+Isolation+of+Extracellular+Vesicles+from+Whole+Blood+for+Cancer+Diagnosis+and+Monitoring.">Fully Automated, Label-Free Isolation of Extracellular Vesicles from Whole Blood for Cancer Diagnosis and Monitoring.</a> Theranostics. 9 (7), 1851-1863 (2019).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+trophoblastic+small+extracellular+vesicles+and+detection+of+their+miRNA+cargo+in+P-bodies.">Internalization of trophoblastic small extracellular vesicles and detection of their miRNA cargo in P-bodies.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1812261 (2020).</li><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+evaluation+of+methods+for+small+extracellular+vesicles+separation+from+human+plasma,+urine+and+cell+culture+medium.">Comprehensive evaluation of methods for small extracellular vesicles separation from human plasma, urine and cell culture medium.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10, 12044 (2020).</li></ol>

Анализ поглощения электромобилей, основанный на 3D-флуоресцентной визуализации с помощью конфокальной микроскопии, обеспечивает эффективную методологию и чувствительный анализ. Эта флуоресцентная маркировка EV облегчает визуализацию электромобилей и успешно выполняет точный а?...

Внеклеточные везикулы (EV) представляют собой наноразмерные, связанные с липидной мембраной частицы, которые классифицируются по их размерам: эктосомы (100-500 нм) и экзосомы (50-150 нм)1. ЭЛЕКТРОМОБИЛИ содержат различные биомолекулы, такие как белки, нуклеиновые кислоты и липиды. Эти биомолекулы происходят из клеток, прежде чем быть инкапсулированными в качестве груза и выпущены во внеклеточное пространство через EV1,2,3.
Из-за разнообразия их груза электромобили, как полагают, играют активную роль в межклеточной связи. Высвобождение и поглощение ЭВ клетками позволяет передавать биомолекулы между клетками4,5. Введение EV-груза в клетку может изменить функции клетки-реципиента и гомеостатическое состояние4,5,6. Электромобили интернализуются несколькими путями; однако точные механизмы не были точно продемонстрированы.
Большинство анализов поглощения электромобилей, таких как генетическая маркировка, флуоресцентно маркируют отдельные EV7. Результирующий сигнал может быть измерен с помощью микропластинчатого фотометра, проточной цитометрии или микроскопии, причем каждая технология имеет существенные ограничения. Микропластинчатые фотометры, проточная цитометрия или стандартная двумерная (2D) микроскопия не могут различать интернализованные и поверхностно прикрепленные EV8,9. Кроме того, необходимая пробоподготовка для каждого из этих методов может внести дополнительные проблемы в оценку поглощения EV. Например, подъем прилипших клеток трипсином перед анализом поглощения EV может расщеплять некоторые поверхностно прикрепленные EV на поверхности клетки10,11. Трипсин может также взаимодействовать с поверхностью клетки, влияя на клетку и фенотип EV. Кроме того, трипсин может не отделять поверхностные EV полностью, искажая изолированные популяции.
Чтобы точно маркировать электромобили флуоресцентными красителями, для удаления остаточного красителя7 требуются дополнительные этапы промывки. Принятые методы изоляции также могут способствовать ложноположительным сигналам из-за коагуляции, которая происходит во время изоляции EV. Например, последовательное ультрацентрифугирование (UC) широко используется для изоляции электромобилей и удаления обездвиженного красителя. Однако UC может со-осаждение EV, а остаточный краситель может привести к ложноположительному сигналу12,13. Другие методы нанофильтрации, такие как колонная фильтрация, также широко используются для удаления неиммобилизованных красителей. Сложный характер взаимодействия EV и красителя в матрице колонны может привести к неполному удалению остаточного красителя из-за изменения молекулярной отсечки колонны комплексным входом14,15,16.
Текущий протокол предлагает микрофлюидное устройство на основе нанофильтрации для выделения и промывки флуоресцентно меченых изолированных электромобилей. Микрофлюидное устройство на основе нанофильтрации может обеспечить эффективную фильтрацию с помощью технологии разделения с помощью жидкости (FAST)17,18. FAST уменьшает падение давления в фильтре, тем самым уменьшая потенциальную агрегацию между электромобилями и красителями. Эффективно удаляя остаточный краситель, можно повысить качество флуоресцентно маркированных электромобилей и специфичность анализа.
Конфокальная микроскопия может различать интернализованные и поверхностно прикрепленные EV на поверхности клетки и всесторонне исследовать клеточные механизмы поглощения EV в пространственно-временном разрешении19,20,21,22,23,24,25. Например, Sung et al. описали визуализацию жизненного цикла экзосом с использованием своего разработанного репортера живых клеток. Местоположение интернализованных электромобилей было обнаружено и проанализировано с помощью конфокального микроскопа в трехмерных (3D) и пост-изображениях20. Хотя размер небольших электромобилей (40-200 нм) ниже предела разрешения оптического микроскопа, флуоресцентно меченые электромобили могут быть обнаружены с помощью конфокальной микроскопии, поскольку фотоприемник может обнаруживать усиленное флуоресцентное излучение. Таким образом, субклеточная локализация флуоресцентно меченых EV внутри клетки может быть точно определена путем получения нескольких z-образных изображений EV и окружающих клеточных органелл.
Кроме того, 3D-реконструкция и пост-обработка данных могут обеспечить дальнейшее понимание позиционирования интернализованных, поверхностных и свободно плавающих электромобилей. Используя эти процессы в сочетании с покадровой визуализацией живых клеток, предлагаемой конфокальной микроскопией, уровень поглощения EV может быть точно оценен, а также возможно отслеживание поглощения EV в режиме реального времени. Кроме того, анализ трафика ЭЛЕКТРОМОБИЛей может быть выполнен с использованием конфокальной микроскопии путем оценки совместной локализации EV с органеллами, что является первым шагом для определения того, как интернализованные EV участвуют во внутриклеточной функции. Этот протокол описывает методологию выполнения анализа поглощения EV с использованием микрофлюидного устройства на основе нанофильтрации17,26, конфокальной микроскопии и анализа после изображения.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>353038</td>
			<td>Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Orange CMTMR Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C2927</td>
			<td>Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Apo Lambda S 40XC WI</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77400</td>
			<td>Objective for confocal imaging, NA=1.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo VC 20X</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD70200</td>
			<td>Objective for confocal imaging, NA=0.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exodisc</td>
			<td>Labspinner Inc.</td>
			<td>EX-D1001</td>
			<td>A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoDiscovery</td>
			<td>Labspinner Inc.</td>
			<td>EX-R1001</td>
			<td>Operation device for Exodisc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-depleted FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2720801</td>
			<td>Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1500-500</td>
			<td>Nutrient for cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L preadsorbed</td>
			<td>abcam</td>
			<td>&#160;ab7063</td>
			<td>Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi USA&#160;U DISH &#956;-Dish 35 mm</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td>Culture dish for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 9.7.1</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>9.7.1</td>
			<td>Post-image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer</td>
			<td>Live Cell Instrument</td>
			<td>TU-O-20</td>
			<td>Incubator system for live cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Camera for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Inverted microscope for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 4.50.00</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>4.50.00</td>
			<td>Image processing software for Nikon microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA, NanoSight NS500</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>NS500</td>
			<td>Measurement device for EV concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 2020</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td>9.7.0.185</td>
			<td>Graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Antibiotics for cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21875034</td>
			<td>Cell culture media for PC3 cell line cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solution in DMSO</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S32703</td>
			<td>RNA staining fluorescent dye for the EV labeling</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extracellular vesicle uptake assay via confocal microscope imaging analysis

Существует необходимость в практических анализах для визуализации и количественной оценки поглощения внеклеточных везикул (EV) клетками. Поглощение электромобилей играет роль в межклеточной коммуникации в различных областях исследований; биология рака, неврология и доставка лекарств. В литературе сообщалось о многих анализах поглощения электромобилей; однако отсутствует практическая, подробная экспериментальная методология. Поглощение ЭЛЕКТРОМОБИЛей может быть оценено путем флуоресцентной маркировки электромобилей для определения их местоположения в клетках. Различение интернализованных EV в клетках и поверхностных EV на клетках трудно, но важно точно определить поглощение EV. Поэтому в этой работе предлагается анализ, который эффективно количественно определяет поглощение электромобилей с помощью трехмерной (3D) флуоресцентной конфокальной микроскопии. Флуоресцентно меченые электромобили были подготовлены с использованием микрофлюидного устройства на основе нанофильтрации, визуализированного с помощью 3D-конфокальной микроскопии, а затем проанализированного с помощью передового программного обеспечения для обработки изображений. Протокол обеспечивает надежную методологию анализа электромобилей на клеточном уровне и практический подход для эффективного анализа.

Используя микрофлюидное устройство на основе нанофильтрации, EV были выделены из PC3 CCM и помечены флуорофор-конъюгированным EV-специфическим (CD63) антителом (рисунок 1). Меченые электромобили были успешно визуализированы с помощью 3D-конфокальной микроскопии (ри?...

Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis at JoVE.com

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Внеклеточные везикулы (EV) способствуют клеточной биологии и межклеточной связи. Существует необходимость в практических анализах для визуализации и количественной оценки поглощения EV клетками. Текущий протокол предлагает анализ поглощения EV с использованием трехмерной флуоресцентной визуализации с помощью конфокальной микроскопии после изоляции EV микрофлюидным устройством на основе нанофильтрации.

Анализ поглощения внеклеточных везикул с помощью конфокального микроскопического анализа изображений

There is a need for practical assays to visualize and quantify the cells' extracellular vesicle (EV) uptake. EV uptake plays a role in intercellular ...

Этот протокол обеспечивает надежную методологию анализа электромобилей на клеточном уровне и практический подход к эффективному поглощению электромобилей и анализу отслеживания электромобилей. Этот метод маркировки ЭЛЕКТРОМОБИЛей исключает совместное осаждение электромобилей и красителя, тем самым усиливая сигналы EV. Поглощение электромобилей измеряется объемным анализом, чтобы отличить интернализованные электромобили от поверхностных электромобилей.Электромобили являются активным грузом, таким образом, их поглощение позволяет переносить биохимические молекулы. Для исследований по доставке лекарств на основе EV и терапии рака этот метод может быть инструментом оценки. Поглощение электромобилей играет роль в межклеточной коммуникации и исследуется в различных областях исследований, таких как биология рака, неврология и доставка лекарств.Этот протокол потенциально облегчает эффективный анализ поглощения EV. Для выделения внеклеточных везикул, или EV, вводят один миллилитр предварительно обработанной клеточной культуральной среды в камеру образца микрофлюидного устройства на основе нанофильтрации. Для работы устройства вращайте устройство в настольной прядильной машине со скоростью вращения 3000 об/мин в течение 10 минут.После прядения удалите жидкость из камеры отходов путем пипетки или аспирации, затем повторите эту процедуру дважды для обработки дополнительных двух миллилитров клеточной культуральной среды. Затем, чтобы промыть изолированные электромобили, введите один миллилитр PBS в камеру для образцов и вращайте устройство в настольной прядильной машине. Для иммунофлуоресцентной маркировки EV вводят один микрограмм на миллилитр EV-специфического антитела в элюционное отверстие устройства, содержащее 100 микролитров изолированных EV.Затем инкубируют в течение одного часа в темноте на пластинчатом шейкере, чтобы обеспечить равномерное распределение антитела по образцу. Далее прикрепите клейкую ленту к отверстию для элюирования. Введите один миллилитр PBS в камеру для отбора проб, чтобы вымыть остаточные антитела, затем вращайте устройство до тех пор, пока камера для отбора проб не опустеет.Повторите промывку, введя еще один миллилитр PBS в камеру для отбора проб и вращая устройство, как показано ранее. После удаления остаточной жидкости из камеры пипетка флуоресцентно меченых электромобилей из мембранной камеры в янтарную трубку или микротрубку. Защитите трубку от света до использования.Посейте четыре раза от 10 до четвертой ячейки PC3 в 35-миллилитровую чашку с одной миллилитровой средой. Позвольте клеткам прилипнуть в течение ночи в оптимальных условиях клеточной культуры. На следующий день дважды промыть прилипшие клетки экзосомной средой.После разбавления флуоресцентно меченых EV до соответствующей концентрации с использованием сред, обедненных экзосомами, добавляют разбавленные EV к прилипшим клеткам-мишеням и инкубируют в течение желаемого экспериментального времени. После удаления неинтернализованных EV путем трижды промывки клеток средой, свободной от экзосом, маркируют цитоплазму прилипших клеток одним микрограммом на миллилитр CMTMR и инкубируют в оптимальных условиях клеточной культуры. Для визуализации живых клеток поместите подготовленные клетки в инкубатор на сцене.После установки параметров визуализации на основе контрольных образцов определите глубину клеток-мишеней и диапазон размеров укладки в направлении Z для получения 3D-конфокальных изображений, затем установите получение изображения на несколько Z-образных изображений как клеточного красителя, так и EV-специфического красителя одновременно. Для обработки изображений используйте программное обеспечение для автоматической обработки изображений. Чтобы создать виртуальные поверхности ячеек, нажмите кнопку Добавить новые поверхности.Чтобы настроить виртуальные поверхности ячеек, нажмите кнопку Добавить и выберите Качество в качестве типа фильтра. Пороговое значение соответствующего нижнего предела путем визуального осмотра, установите максимальное значение для верхнего предела и нажмите кнопку Готово Далее, чтобы построить виртуальные точки электромобилей, нажмите кнопку Добавить новые пятна. В разделе Параметры алгоритма выберите Различные размеры пятна и Расчет кратчайшего расстояния, затем нажмите кнопку Далее и выберите Канал 1 Alexa Fluor 488 в качестве исходного канала.Введите соответствующее значение для предполагаемого диаметра XY в разделе Обнаружение пятен и нажмите кнопку Далее. Чтобы настроить виртуальные точки EV, нажмите кнопку Добавить и выберите Качество в качестве типа фильтра. Установите нижнее пороговое значение с помощью визуального осмотра и нажмите кнопку Далее Для типа областей пятна выберите Абсолютная интенсивность, затем нажмите кнопку Далее.Чтобы установить пороговое значение для области точек EV, введите соответствующее значение для поля Region Threshold при визуальном осмотре. Выберите Диаметр из в разделе Объем области и нажмите кнопку Готово. Чтобы разделить сгруппированные пятна внутри построенной поверхности, нажмите на Точки сборки и перейдите в Фильтры.Затем нажмите кнопку Добавить и выберите Кратчайшее расстояние до поверхностей, Surfaces Surface 1 в качестве типа фильтра. После установки нижнего порогового значения для нижнего предела и соответствующего значения для верхнего предела нажмите кнопку Дублировать раздел, чтобы перейти на новую кнопку Места. Для автоматического подсчета электромобилей внутри ячеек щелкните выбор Построенные места 1, перейдите в раздел Статистика и экспортируйте значение из общего числа мест.Чтобы получить количество ячеек, щелкните Встроенные поверхности 1, затем перейдите в раздел Статистика и экспортируйте значение Общее количество поверхностей из общего. Наконец, перейдите на вкладку Подробные сведения в разделе Статистика, чтобы экспортировать том. Ev, выделенные из среды клеточной культуры PC3 с использованием микрофлюидного устройства на основе нанофильтрации, были помечены фтор-4-конъюгированным EV-специфическим антителом и визуализированы с использованием 3D-конфокальной микроскопии.Интернализованные электромобили были визуализированы как пункта, и индивидуальная EV.Post обработки этих изображений позволяет визуализировать и количественно оценить интернализацию EV в клетки. Результаты анализа поглощения EV показывают, что уровень поглощения EV зависит от продолжительности инкубационного периода. Количество интернализованных EV может быть нормализовано до объема ячейки реципиента для определения фактической скорости поглощения EV для указанной ячейки.Эта процедура позволяет систематически исключать неинтернализованные электромобили для точного измерения количества интернализованных электромобилей. Распределение размеров интернализованных точек EV показано здесь. Таким образом, ключевыми шагами являются использование микрофлюидного устройства для маркировки электромобилей, минимизация фоновой флуоресценции при визуализации флуоресцентных электромобилей, а затем анализ после визуализации для определения интернализованных и поверхностных электромобилей.Таким образом, внутриклеточное отслеживание EV может быть выполнено в режиме реального времени на 3D-плоскости, и, кроме того, может быть достигнут анализ трафика EV на пространственных / временных разрешениях и колокализация EV с субклеточными органеллами. Таким образом, мы считаем, что этот метод обеспечивает более простой и эффективный способ исследования EV во внутри- и внеклеточных матрицах для исследователей в области сотовой связи для электромобилей.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Unit 1

Endocytosis and Exocytosis

SCIENTISTS IN ACTION

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Правильный уход и очистка микроскоп

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Major Components of the Light Microscope

Основные компоненты светового микроскопа

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Нейронов и астроцитов сотрудничеству культуры Пробирной высоких Анализ содержания Нейротоксичность

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Флуоресценции на основе измерения магазин управлением поступления кальция в живых клетках: от искусственного раковых клеток в скелетных мышечных волокон

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

LDL холестерина поглощения Assay с использованием живой клетки изображений анализ с ячейкой мониторинг состояния

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...

Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization by Nano-Flow Cytometry

Характеристика одноклеточного везикулярного трансмембранного белка с помощью нанопоточной цитометрии

Single particle characterization has become increasingly relevant for research into extracellular vesicles, progressing from bulk analysis techniques and ...

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

Анализ внеклеточной везикуло-опосредованной кальцификации сосудов с использованием моделей in vitro и in vivo

Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world, and vascular calcification is the most significant predictor of cardiovascular events; ...

Multimodal Analytical Platform on a Multiplexed Surface Plasmon Resonance Imaging Chip for the Analysis of Extracellular Vesicle Subsets

Мультимодальная аналитическая платформа на мультиплексированном чипе поверхностной плазмонно-резонансной томографии для анализа подмножеств внеклеточных везикул

Extracellular vesicles (EVs) are membrane-derived, tiny vesicles produced by all cells that range from 50 to several hundreds of nanometers in diameter ...

Imaging of Mitochondrial Peroxide in Living Yeast Cells Using mtHyper7

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Advancing Mitochondrial Research Â– mtHyper7 Biosensor for Subcellular Analysis (Video) | JoVE

Визуализация mtHyPer7, ратиометрического биосенсора для митохондриальной перекиси, в живых клетках дрожжей

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...

Intravital Imaging Using an Inverted Microscope to Track Skin Cell Dynamics

Streamlined Intravital Imaging Approach for Long-Term Monitoring of Epithelial Tissue Dynamics on an Inverted Confocal Microscope

Developing a Tool for Using Inverted Confocal Microscopes for In Vivo Intravital Imaging (Video) | JoVE

Оптимизированный подход к прижизненной визуализации для долгосрочного мониторинга динамики эпителиальных тканей на инвертированном конфокальном микроскопе

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It ...