Name: extracellular vesicle uptake assay via confocal microscope imaging analysis
Uploaded: 2022-02-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por los números de subvención del NCI. U54CA143803, CA163124, CA093900 y CA143055 a K. J. P. Esta investigación fue apoyada por una subvención del Proyecto de I + D de Tecnología de la Salud de Corea a través del Instituto de Desarrollo de la Industria de la Salud de Corea (KHIDI), financiado por el Ministerio de Salud y Bienestar de la República de Corea (número de subvención: HI19C1122). Obra de J. Kim y Y.-K. Cho fue apoyado por el Instituto de Ciencias Básicas (IBS-R020-D1), financiado por el Gobierno de Corea. Los autores agradecen a los miembros actuales y pasados del Instituto Urológico Brady, especialmente a los miembros del laboratorio Pienta-Amend, por la lectura crítica del manuscrito.

1. Aislamiento ev y etiquetado EV inmunofluorente en chip
<ol><li>Recolección de medios de cultivo celular (MCC) y preprocesamiento de MCP para aislamiento de EV<ol>
<li>Semilla de células PC3 al 30% de confluencia en un matraz de cultivo celular de 75 cm2 . Permita que las células de control crezcan hasta un 90% de confluencia (~ 48 h) en medios estándar y suplementos específicos de la línea celular. NOTA: Para evitar que los componentes que contienen EV afecten la absorción celular (es decir, sue...

<ol>
	<li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+Ectosomes+in+Intercellular+Communication.">Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication.</a> Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).</li><li>Sunkara, V., Woo, H. -. K., Cho, Y. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+techniques+in+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles+and+their+roles+in+cancer+diagnostics+and+prognostics.">Emerging techniques in the isolation and characterization of extracellular vesicles and their roles in cancer diagnostics and prognostics.</a> The Analyst. 141 (2), 371-381 (2016).</li><li>Kalluri, R., Lebleu, V. 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A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routes+and+mechanisms+of+extracellular+vesicle+uptake.">Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).</li><li>Dehghani, M., Gaborski, T. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exodisc+for+Rapid,+Size-Selective,+and+Efficient+Isolation+and+Analysis+of+Nanoscale+Extracellular+Vesicles+from+Biological+Samples.">Exodisc for Rapid, Size-Selective, and Efficient Isolation and Analysis of Nanoscale Extracellular Vesicles from Biological Samples.</a> ACS Nano. 11 (2), 1360-1370 (2017).</li><li>Kim, T. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAST:+Size-Selective,+Clog-Free+Isolation+of+Rare+Cancer+Cells+from+Whole+Blood+at+a+Liquid-Liquid+Interface.">FAST: Size-Selective, Clog-Free Isolation of Rare Cancer Cells from Whole Blood at a Liquid-Liquid Interface.</a> Analytical Chemistry. 89 (2), 1155-1162 (2017).</li><li>Joshi, B. S., De Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+live+cell+reporter+of+exosome+secretion+and+uptake+reveals+pathfinding+behavior+of+migrating+cells.">A live cell reporter of exosome secretion and uptake reveals pathfinding behavior of migrating cells.</a> Nature Communications. 11, 2092 (2020).</li><li>Heusermann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+surf+on+filopodia+to+enter+cells+at+endocytic+hot+spots,+traffic+within+endosomes,+and+are+targeted+to+the+ER.">Exosomes surf on filopodia to enter cells at endocytic hot spots, traffic within endosomes, and are targeted to the ER.</a> Journal of Cell Biology. 213 (2), 173-184 (2016).</li><li>Reclusa, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+extracellular+vesicles+visualization:+From+static+to+motion.">Improving extracellular vesicles visualization: From static to motion.</a> Scientific Reports. 10, 6494 (2020).</li><li>Verweij, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Tracking+of+Inter-organ+Communication+by+Endogenous+Exosomes+In+Vivo.">Live Tracking of Inter-organ Communication by Endogenous Exosomes In Vivo.</a> Developmental Cell. 48 (4), 573-589 (2019).</li><li>Lai, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+tracking+of+tumour+extracellular+vesicle+delivery+and+RNA+translation+using+multiplexed+reporters.">Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters.</a> Nature Communications. 6, 7029 (2015).</li><li>Durak-Kozica, M., Baster, Z., Kubat, K., St&#281;pie&#324;, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+visualization+of+extracellular+vesicle+uptake+by+endothelial+cells.">3D visualization of extracellular vesicle uptake by endothelial cells.</a> Cellular &amp; Molecular Biology Letters. 23, 57 (2018).</li><li>Sunkara, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+Automated,+Label-Free+Isolation+of+Extracellular+Vesicles+from+Whole+Blood+for+Cancer+Diagnosis+and+Monitoring.">Fully Automated, Label-Free Isolation of Extracellular Vesicles from Whole Blood for Cancer Diagnosis and Monitoring.</a> Theranostics. 9 (7), 1851-1863 (2019).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+trophoblastic+small+extracellular+vesicles+and+detection+of+their+miRNA+cargo+in+P-bodies.">Internalization of trophoblastic small extracellular vesicles and detection of their miRNA cargo in P-bodies.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1812261 (2020).</li><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+evaluation+of+methods+for+small+extracellular+vesicles+separation+from+human+plasma,+urine+and+cell+culture+medium.">Comprehensive evaluation of methods for small extracellular vesicles separation from human plasma, urine and cell culture medium.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10, 12044 (2020).</li></ol>

Un ensayo de captación de EV basado en imágenes de fluorescencia 3D a través de microscopía confocal proporciona una metodología eficiente y un análisis sensible. Este etiquetado fluorescente EV facilita la visualización de evs y realiza con éxito un ensayo preciso de captación de EV. Se han notificado métodos anteriores para etiquetar los EV y eliminar el colorante residual mediante la eliminación de la precipitación mediante ultracentrifugación (CU); sin embargo, la CU puede co-precipitar los EV, ...

Las vesículas extracelulares (EV) son partículas de tamaño nanométrico unidas a la membrana lipídica que se clasifican por sus tamaños: ectosomas (100-500 nm) y exosomas (50-150 nm)1. Los EV contienen varias biomoléculas, como proteínas, ácidos nucleicos y lípidos. Estas biomoléculas se originan en las células antes de ser encapsuladas como carga y liberadas en el espacio extracelular a través de EV1,2,3.
Debido a la variedad de su carga, se cree que los vehículos eléctricos desempeñan un papel activo en la comunicación intercelular. La liberación y captación de EV por las células permite la transferencia de biomoléculas entre las células4,5. La introducción de carga EV en una celda puede alterar las funciones y el estado homeostático de la célula receptora4,5,6. Los evs se internalizan a través de múltiples vías; sin embargo, los mecanismos exactos no se han demostrado con precisión.
La mayoría de los ensayos de captación de EV, como el etiquetado genético, etiquetan fluorescentemente los EV individuales7. La señal resultante se puede medir mediante fotómetro de microplacas, citometría de flujo o microscopía, y cada tecnología tiene limitaciones sustanciales. Los fotómetros de microplacas, la citometría de flujo o la microscopía bidimensional estándar (2D) no pueden distinguir entre EV internalizados y conectados superficialmente8,9. Además, la preparación de muestras necesaria para cada una de estas técnicas puede introducir problemas adicionales a la evaluación de la absorción de EV. Por ejemplo, levantar células adheridas con tripsina antes del análisis de captación de EV puede escindir algunos EV adheridos superficialmente en la superficie de la célula10,11. La tripsina también puede interactuar con la superficie celular, afectando el fenotipo celular y EV. Además, la tripsina puede no separar por completo los EV superficiales, sesgando las poblaciones aisladas.
Para etiquetar con precisión los EV con tintes fluorescentes, se requieren pasos de lavado adicionales para eliminar el tinte residual7. Las técnicas de aislamiento aceptadas también pueden contribuir a las señales falsas positivas debido a la coagulación que ocurre durante el aislamiento de EV. Por ejemplo, la ultracentrifugación en serie (UC) se usa ampliamente para aislar los vehículos eléctricos y eliminar el tinte inmovilizado. Sin embargo, la CU puede co-precipitar los EV, y el tinte residual puede conducir a una señal falsa positiva12,13. Otros métodos de nanofiltración, como la filtración basada en columnas, también se utilizan ampliamente para la eliminación de colorantes no inmovilizados. La naturaleza compleja de los EV y el tinte que interactúan dentro de la matriz de la columna puede conducir a la eliminación incompleta del tinte residual debido a que el corte molecular de la columna se altera por la entrada compleja14,15,16.
El protocolo actual propone un dispositivo microfluídico basado en nanofiltración para aislar y lavar vehículos eléctricos aislados marcados con fluorescencia. El dispositivo microfluídico basado en nanofiltración puede proporcionar una filtración eficiente a través de la tecnología de separación asistida por fluidos (FAST)17,18. FAST reduce la caída de presión a través del filtro, reduciendo así la agregación potencial entre los vehículos eléctricos y los tintes. Al eliminar eficientemente el colorante residual, es posible mejorar la calidad de los EV marcados fluorescentemente y la especificidad del ensayo.
La microscopía confocal puede distinguir entre EV internalizados y unidos superficialmente en la superficie celular e investigar exhaustivamente los mecanismos celulares de la absorción de EV en una resolución espaciotemporal19,20,21,22,23,24,25. Por ejemplo, Sung et al. describieron la visualización del ciclo de vida del exosoma utilizando su reportero de células vivas desarrollado. La localización de los EVs internalizados fue detectada y analizada mediante un microscopio confocal en herramientas tridimensionales (3D) y de procesamiento post-imagen20. Aunque el tamaño de los EV pequeños (40-200 nm) está por debajo del límite de resolución del microscopio óptico, los EV marcados fluorescentemente se pueden detectar mediante microscopía confocal, ya que el fotodetector puede detectar la emisión de fluorescencia mejorada. Por lo tanto, la localización subcelular de los EV marcados fluorescentemente dentro de una célula se puede determinar con precisión mediante la adquisición de múltiples imágenes apiladas en z de los EV y los orgánulos celulares circundantes.
Además, la reconstrucción 3D y el procesamiento posterior a los datos pueden proporcionar más información sobre el posicionamiento de los vehículos eléctricos internalizados, superficiales y flotantes. Al utilizar estos procesos junto con las imágenes de células vivas de lapso de tiempo ofrecidas por la microscopía confocal, el nivel de absorción de EV se puede evaluar con precisión, y también es posible el seguimiento en tiempo real de la captación de EV. Además, el análisis del tráfico de EV se puede realizar utilizando microscopía confocal mediante la evaluación de la colocalización de evs con orgánulos, un primer paso para determinar cómo los EV internalizados están involucrados en la función intracelular. Este protocolo describe la metodología para realizar un ensayo de captación de EV utilizando el dispositivo microfluídico basado en nanofiltración17,26, microscopía confocal y análisis post-imagen.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>353038</td>
			<td>Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Orange CMTMR Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C2927</td>
			<td>Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Apo Lambda S 40XC WI</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77400</td>
			<td>Objective for confocal imaging, NA=1.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo VC 20X</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD70200</td>
			<td>Objective for confocal imaging, NA=0.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exodisc</td>
			<td>Labspinner Inc.</td>
			<td>EX-D1001</td>
			<td>A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoDiscovery</td>
			<td>Labspinner Inc.</td>
			<td>EX-R1001</td>
			<td>Operation device for Exodisc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-depleted FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2720801</td>
			<td>Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1500-500</td>
			<td>Nutrient for cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L preadsorbed</td>
			<td>abcam</td>
			<td>&#160;ab7063</td>
			<td>Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi USA&#160;U DISH &#956;-Dish 35 mm</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td>Culture dish for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 9.7.1</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>9.7.1</td>
			<td>Post-image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer</td>
			<td>Live Cell Instrument</td>
			<td>TU-O-20</td>
			<td>Incubator system for live cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Camera for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Inverted microscope for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 4.50.00</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>4.50.00</td>
			<td>Image processing software for Nikon microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA, NanoSight NS500</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>NS500</td>
			<td>Measurement device for EV concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 2020</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td>9.7.0.185</td>
			<td>Graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Antibiotics for cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21875034</td>
			<td>Cell culture media for PC3 cell line cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solution in DMSO</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S32703</td>
			<td>RNA staining fluorescent dye for the EV labeling</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extracellular vesicle uptake assay via confocal microscope imaging analysis

Existe la necesidad de ensayos prácticos para visualizar y cuantificar la absorción de vesículas extracelulares (EV) de las células. La absorción de EV juega un papel en la comunicación intercelular en varios campos de investigación; biología del cáncer, neurociencia y administración de fármacos. Muchos ensayos de captación de EV han sido reportados en la literatura; sin embargo, hay una falta de metodología experimental práctica y detallada. La absorción de EV se puede evaluar mediante el etiquetado fluorescente de EV para detectar su ubicación dentro de las células. Distinguir entre los EV internalizados en las células y los EV superficiales en las células es difícil, pero crítico, para determinar con precisión la absorción de EV. Por lo tanto, en este trabajo se propone un ensayo que cuantifica eficientemente la absorción de EV a través de la microscopía confocal de fluorescencia tridimensional (3D). Los EV marcados fluorescentemente se prepararon utilizando un dispositivo microfluídico basado en nanofiltración, visualizados por microscopía confocal 3D y luego analizados a través de un software avanzado de procesamiento de imágenes. El protocolo proporciona una metodología robusta para analizar los vehículos eléctricos a nivel celular y un enfoque práctico para un análisis eficiente.

Utilizando un dispositivo microfluídico basado en nanofiltración, los EV se aislaron de PC3 CCM y se etiquetaron con un anticuerpo ev específico conjugado con fluoróforos (CD63) (Figura 1). Los EV etiquetados fueron visualizados con éxito por la microscopía confocal 3D (Figura 2). Los EV marcados se incubaron con células durante varias horas en medios agotados por exosomas. Después de la incubación, las células se lavaron con medios agotados de exosoma...

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Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Las vesículas extracelulares (EV) contribuyen a la biología celular y las comunicaciones intercelulares. Existe la necesidad de ensayos prácticos para visualizar y cuantificar la absorción de EV por las células. El protocolo actual propone el ensayo de captación de EV mediante la utilización de imágenes de fluorescencia tridimensional a través de microscopía confocal, después del aislamiento de EV por un dispositivo microfluídico basado en nanofiltración.

Ensayo de captación de vesículas extracelulares mediante análisis de imágenes con microscopio confocal

There is a need for practical assays to visualize and quantify the cells' extracellular vesicle (EV) uptake. EV uptake plays a role in intercellular ...

Este protocolo proporciona una metodología robusta para analizar los evs a nivel celular, y un enfoque práctico para la absorción eficiente de EV y el análisis de seguimiento de EV. Este método de etiquetado ev elimina la coprecipitación de EV y tinte, mejorando así las señales EV. La absorción de EV se mide mediante análisis volumétrico para distinguir los EV internalizados de los EV superficiales.Los vehículos eléctricos son carga activa, por lo tanto, su absorción permite la transferencia de moléculas bioquímicas. Para la investigación sobre la administración de medicamentos basados en EV y la terapia contra el cáncer, esta técnica puede ser una herramienta de evaluación. La absorción de EV desempeña un papel en la comunicación intercelular y se investiga en varios campos de investigación, como la biología del cáncer, la neurociencia y la administración de medicamentos.Este protocolo facilita potencialmente el ensayo eficiente de absorción de EV. Para el aislamiento de vesículas extracelulares, o EV, inyecte un mililitro de medios de cultivo celular preprocesados en la cámara de muestra del dispositivo microfluídico basado en nanofiltración. Para operar el dispositivo, gire el dispositivo en la máquina de hilado de sobremesa a 3000 RPM durante 10 minutos.Después de girar, retire el líquido de la cámara de desechos mediante pipeteo o aspiración, luego repita este procedimiento dos veces para procesar dos mililitros adicionales del medio de cultivo celular. A continuación, para lavar los vehículos eléctricos aislados, inyecte un mililitro de PBS en la cámara de muestra y haga girar el dispositivo en la máquina de hilado de sobremesa. Para el etiquetado inmunofluorescente de los EV, inyecte un microgramo por mililitro del anticuerpo específico ev en el orificio de elución del dispositivo que contiene 100 microlitros de EV aislados.Luego incube durante una hora en la oscuridad en un agitador de placas para garantizar la distribución uniforme del anticuerpo a través de la muestra. A continuación, coloque una cinta adhesiva en el orificio de elución. Inyecte un mililitro de PBS en la cámara de muestra para eliminar los anticuerpos residuales, luego haga girar el dispositivo hasta que la cámara de muestra esté vacía.Repita el lavado inyectando otro mililitro de PBS en la cámara de muestra y haciendo girar el dispositivo como se demostró anteriormente. Después de extraer el fluido residual de la cámara, pipetee los EV marcados fluorescentemente de la cámara de membrana en un tubo ámbar o microtubo. Proteja el tubo de la luz hasta su uso.Sembra cuatro veces 10 a la cuarta célula PC3 en un plato de 35 mililitros con un medio de mililitros. Permita que las células se adhieran durante la noche en condiciones óptimas de cultivo celular. Al día siguiente, lave las células adheridas dos veces con medios agotados de exosomas.Después de diluir los EV marcados fluorescentemente a la concentración apropiada utilizando medios agotados por exosomas, agregue los EV diluidos a las células diana adheridas e incube durante el tiempo experimental deseado. Después de eliminar los EV no internalizados lavando las células tres veces con medios libres de exosomas, etiquete el citoplasma de las células adheridas con un microgramo por mililitro de CMTMR e incube en condiciones óptimas de cultivo celular. Para obtener imágenes de células vivas, coloque las células preparadas en la incubadora en el escenario.Después de establecer los parámetros de imagen basados en muestras de control, determine la profundidad de las celdas objetivo y el rango de tamaño de apilamiento en la dirección Z para adquirir imágenes confocales 3D, luego configure la adquisición de imágenes en múltiples imágenes apiladas en Z de tinte específico de la celda y tinte específico ev simultáneamente. Para el procesamiento de imágenes, utilice un software de procesamiento automático de imágenes. Para crear superficies virtuales de las celdas, haga clic en Agregar nuevas superficies.Para configurar las superficies de celda virtual, haga clic en el botón Agregar y seleccione Calidad como tipo de filtro. Umbral del valor apropiado para el límite bajo mediante inspección visual, establezca el valor máximo para el límite superior y haga clic en el botón Finalizar Siguiente, para crear los puntos virtuales de los vehículos eléctricos, haga clic en el botón Agregar nuevos puntos. En Configuración del algoritmo, seleccione Diferentes tamaños de punto y Cálculo de la distancia más corta, luego haga clic en Siguiente y seleccione Canal 1 Alexa Fluor 488 como canal de origen.Introduzca el valor adecuado para el diámetro XY estimado en Detección de puntos y haga clic en Siguiente. Para configurar los puntos EV virtuales, haga clic en el botón Agregar y seleccione Calidad como tipo de filtro. Establezca el umbral inferior mediante una inspección visual y haga clic en Siguiente para el tipo de regiones de spot, seleccione Intensidad absoluta y, a continuación, haga clic en Siguiente.Para calcular el umbral de la región de los puntos EV, introduzca el valor apropiado para Umbral de región mediante inspección visual. Seleccione Diámetro desde en Volumen de región y haga clic en Finalizar. Para dividir los puntos agrupados dentro de la superficie construida, haga clic en Puntos de construcción y vaya a Filtros.A continuación, haga clic en el botón Agregar y seleccione Distancia más corta a las superficies, Superficies 1 como tipo de filtro. Después de establecer el umbral más bajo para el límite bajo y el valor apropiado para el límite superior, haga clic en el botón Duplicar sección en el nuevo Puntos. Para el recuento automático de vehículos eléctricos dentro de las celdas, haga clic en la selección Puntos construidos 1, vaya a Estadísticas y exporte el valor del Número total de puntos.Para obtener el número de celdas, haga clic en Superficies construidas 1 y, a continuación, vaya a Estadísticas y exporte el valor de Número total de superficies desde Total. Finalmente, vaya a la pestaña Detallado en Estadísticas para exportar el volumen. Los EV aislados de medios de cultivo celular PC3 utilizando un dispositivo microfluídico basado en nanofiltración se etiquetaron con un anticuerpo específico EV conjugado con fluoro-4 y se visualizaron mediante microscopía confocal 3D.Los EV internalizados se visualizaron como puntcta y un procesamiento individual EV.Post de estas imágenes permite la visualización y cuantificación de la internalización ev en las células. Los resultados del ensayo de captación de EV indican que el nivel de absorción de EV depende de la duración del período de incubación. El número de EV internalizados se puede normalizar al volumen de la célula receptora para determinar la tasa real de absorción de EV para la celda especificada.Este procedimiento permite la exclusión sistemática de vehículos eléctricos no internalizados para medir con precisión el número de vehículos eléctricos internalizados. La distribución de tamaño de los puntos EV internalizados se muestra aquí. Por lo tanto, los pasos clave son la utilización del dispositivo microfluídico para el etiquetado de EV, la minimización de la fluorescencia de fondo al visualizar EV fluorescentes y luego el análisis posterior a la imagen para determinar EV internalizados versus superficiales.Por lo tanto, el seguimiento intracelular de EV se puede realizar en tiempo real en un plano 3D, y además, se puede lograr el análisis de tráfico de EV en resoluciones espaciales / temporales y la colocalización de EV con orgánulos subcelulares. Por lo tanto, creemos que esta técnica proporciona una forma más fácil y eficiente de investigar los EV dentro de las matrices intra y extracelulares para los investigadores dentro del campo de la comunicación celular para los EV.

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Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

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Proper Care and Cleaning of the Microscope

Limpieza y cuidado apropiado del microscopio

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Investigación

Biología

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Los componentes principales del microscopio de luz

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Enfoque simplificado de imágenes intravitales para la monitorización a largo plazo de la dinámica del tejido epitelial en un microscopio confocal invertido

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