Name: extracellular vesicle uptake assay via confocal microscope imaging analysis
Uploaded: 2022-02-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis at JoVE.com

Detta arbete stöddes av NCI-bidragsnr. U54CA143803, CA163124, CA093900 och CA143055 till K. J. P. Denna forskning stöddes av ett bidrag från Korea Health Technology R&D Project genom Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finansierat av Ministry of Health & Welfare, Republic of Korea (bidragsnummer: HI19C1122). Arbete av J. Kim och Y.-K. Cho stöddes av Institute for Basic Science (IBS-R020-D1), finansierat av den koreanska regeringen. Författarna tackar de nuvarande och tidigare medlemmarna i Brady Urological Institute, särskilt medlemmar av Pienta-Amend-laboratoriet, för den kritiska läsningen av manuskriptet.

1. EV-isolering och immuno fluorescerande EV-märkning på chip
<ol><li>Insamling av cellodlingsmedier (CCM) och förbehandling av CCM för EV-isolering<ol>
<li>Frö PC3-celler vid 30% sammanflöde i en 75 cm2 cellodlingskolv. Låt kontrollceller växa till 90% sammanflöde (~ 48 h) i standard media och celllinjespecifika kosttillskott. OBS: För att förhindra att EV-innehållande komponenter påverkar cellulärt upptag (dvs. fetalt bovinserum), använd exosomfattiga medier och kosttillskott.</li>
		<li>...

<ol>
	<li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+Ectosomes+in+Intercellular+Communication.">Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication.</a> Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).</li><li>Sunkara, V., Woo, H. -. K., Cho, Y. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+techniques+in+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles+and+their+roles+in+cancer+diagnostics+and+prognostics.">Emerging techniques in the isolation and characterization of extracellular vesicles and their roles in cancer diagnostics and prognostics.</a> The Analyst. 141 (2), 371-381 (2016).</li><li>Kalluri, R., Lebleu, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology,+function,+and+biomedical+applications+of+exosomes.">The biology, function, and biomedical applications of exosomes.</a> Science. 367 (6478), (2020).</li><li>Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificities+of+secretion+and+uptake+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+cell-to-cell+communication.">Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).</li><li>Bonsergent, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+characterization+of+extracellular+vesicle+uptake+and+content+delivery+within+mammalian+cells.">Quantitative characterization of extracellular vesicle uptake and content delivery within mammalian cells.</a> Nature Communications. 12, 1864 (2021).</li><li>Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routes+and+mechanisms+of+extracellular+vesicle+uptake.">Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).</li><li>Dehghani, M., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+extracellular+vesicles.">Fluorescent labeling of extracellular vesicles.</a> Methods Enzymology. 645, 15-42 (2020).</li><li>Ragni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovative+Visualization+and+Quantification+of+Extracellular+Vesicles+Interaction+with+and+Incorporation+in+Target+Cells+in+3D+Microenvironments.">Innovative Visualization and Quantification of Extracellular Vesicles Interaction with and Incorporation in Target Cells in 3D Microenvironments.</a> Cells. 9 (5), 1180 (2020).</li><li>Saari, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLIM+reveals+alternative+EV-mediated+cellular+up-take+pathways+of+paclitaxel.">FLIM reveals alternative EV-mediated cellular up-take pathways of paclitaxel.</a> Journal of Controlled Release. 284, 133-143 (2018).</li><li>Franzen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Uptake+and+Internalization+of+Exosomes+by+Bladder+Cancer+Cells.">Characterization of Uptake and Internalization of Exosomes by Bladder Cancer Cells.</a> BioMed Research International. 2014, 619829 (2014).</li><li>Feng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Internalization+of+Exosomes+Occurs+Through+Phagocytosis.">Cellular Internalization of Exosomes Occurs Through Phagocytosis.</a> Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).</li><li>Hoen, E. N. M. N. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+qualitative+flow+cytometric+analysis+of+nanosized+cell-derived+membrane+vesicles.">Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).</li><li>Van Der Vlist, E. J., Nolte-'T Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry.">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).</li><li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+Exosome+Isolation+Techniques.">Progress in Exosome Isolation Techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+perspective+on+exosome+isolation+-+efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics.">and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li><li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+distinct+exosome+subpopulations:+isolation+and+characterization+approaches+and+their+associated+challenges.">Separation of distinct exosome subpopulations: isolation and characterization approaches and their associated challenges.</a> The Analyst. 146 (12), 3731-3749 (2021).</li><li>Woo, H. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exodisc+for+Rapid,+Size-Selective,+and+Efficient+Isolation+and+Analysis+of+Nanoscale+Extracellular+Vesicles+from+Biological+Samples.">Exodisc for Rapid, Size-Selective, and Efficient Isolation and Analysis of Nanoscale Extracellular Vesicles from Biological Samples.</a> ACS Nano. 11 (2), 1360-1370 (2017).</li><li>Kim, T. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAST:+Size-Selective,+Clog-Free+Isolation+of+Rare+Cancer+Cells+from+Whole+Blood+at+a+Liquid-Liquid+Interface.">FAST: Size-Selective, Clog-Free Isolation of Rare Cancer Cells from Whole Blood at a Liquid-Liquid Interface.</a> Analytical Chemistry. 89 (2), 1155-1162 (2017).</li><li>Joshi, B. S., De Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+of+Extracellular+Vesicles+and+Release+of+Their+Cargo+from+Endosomes.">Endocytosis of Extracellular Vesicles and Release of Their Cargo from Endosomes.</a> ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).</li><li>Sung, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+live+cell+reporter+of+exosome+secretion+and+uptake+reveals+pathfinding+behavior+of+migrating+cells.">A live cell reporter of exosome secretion and uptake reveals pathfinding behavior of migrating cells.</a> Nature Communications. 11, 2092 (2020).</li><li>Heusermann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+surf+on+filopodia+to+enter+cells+at+endocytic+hot+spots,+traffic+within+endosomes,+and+are+targeted+to+the+ER.">Exosomes surf on filopodia to enter cells at endocytic hot spots, traffic within endosomes, and are targeted to the ER.</a> Journal of Cell Biology. 213 (2), 173-184 (2016).</li><li>Reclusa, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+extracellular+vesicles+visualization:+From+static+to+motion.">Improving extracellular vesicles visualization: From static to motion.</a> Scientific Reports. 10, 6494 (2020).</li><li>Verweij, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Tracking+of+Inter-organ+Communication+by+Endogenous+Exosomes+In+Vivo.">Live Tracking of Inter-organ Communication by Endogenous Exosomes In Vivo.</a> Developmental Cell. 48 (4), 573-589 (2019).</li><li>Lai, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+tracking+of+tumour+extracellular+vesicle+delivery+and+RNA+translation+using+multiplexed+reporters.">Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters.</a> Nature Communications. 6, 7029 (2015).</li><li>Durak-Kozica, M., Baster, Z., Kubat, K., St&#281;pie&#324;, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+visualization+of+extracellular+vesicle+uptake+by+endothelial+cells.">3D visualization of extracellular vesicle uptake by endothelial cells.</a> Cellular &amp; Molecular Biology Letters. 23, 57 (2018).</li><li>Sunkara, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+Automated,+Label-Free+Isolation+of+Extracellular+Vesicles+from+Whole+Blood+for+Cancer+Diagnosis+and+Monitoring.">Fully Automated, Label-Free Isolation of Extracellular Vesicles from Whole Blood for Cancer Diagnosis and Monitoring.</a> Theranostics. 9 (7), 1851-1863 (2019).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+trophoblastic+small+extracellular+vesicles+and+detection+of+their+miRNA+cargo+in+P-bodies.">Internalization of trophoblastic small extracellular vesicles and detection of their miRNA cargo in P-bodies.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1812261 (2020).</li><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+evaluation+of+methods+for+small+extracellular+vesicles+separation+from+human+plasma,+urine+and+cell+culture+medium.">Comprehensive evaluation of methods for small extracellular vesicles separation from human plasma, urine and cell culture medium.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10, 12044 (2020).</li></ol>

En EV-upptagsanalys baserad på 3D-fluorescensavbildning via konfokal mikroskopi ger en effektiv metodik och känslig analys. Denna fluorescerande EV-märkning underlättar visualiseringen av EVs och utför framgångsrikt en exakt EV-upptagsanalys. Tidigare metoder för märkning av elfordon och avlägsnande av restfärgen har rapporterats genom att nederbörd med hjälp av ultracentrifugation (UC) har avlägsnats. UC kan dock samfällera EVs, och det immobiliserade färgämnet kan leda till en falskt positiv <s...

Extracellulära blåsor (EVs) är nanostora, lipidmembranbundna partiklar som kategoriseras efter deras storlekar: ectosomer (100-500 nm) och exosomer (50-150 nm)1. EVs innehåller olika biomolekyler, såsom proteiner, nukleinsyror och lipider. Dessa biomolekyler härstammar från cellerna innan de kapslas in som last och släpps ut i det extracellulära utrymmet via EVs1,2,3.
På grund av mångfalden av deras last tros EVs spela en aktiv roll i intercellulär kommunikation. Utsättning och användning av EVs av celler möjliggör överföring av biomolekyler mellan cellerna4,5. Införandet av EV-last i en cell kan ändra mottagarcellens funktioner och homeostatiska tillstånd4,5,6. EVs internaliseras genom flera vägar; De exakta mekanismerna har dock inte visats korrekt.
Majoriteten av EV-upptagsanalyser, såsom genetisk märkning, märker fluorescerande enskilda EVs7. Den resulterande signalen kan mätas med mikroplate-fotometer, flödescytometri eller mikroskopi, där varje teknik har betydande begränsningar. Mikroplate-fotometrar, flödescytometri eller standard tvådimensionell (2D) mikroskopi kan inte skilja mellan internaliserad och ytligt fäst EVs8,9. Dessutom kan den nödvändiga provberedningen för var och en av dessa tekniker medföra ytterligare problem i utvärderingen av upptagningen av ev. Till exempel kan lyft av vidhäftade celler med trypsin före EV-upptagsanalys klyva några ytligt fästa EVs på cellens yta10,11. Trypsin kan också interagera med cellytan, vilket påverkar cell- och EV-fenotyp. Dessutom kan trypsin inte lossa ytliga EVs helt och hållet, skeva isolerade populationer.
För att noggrant märka EL med fluorescerande färgämnen krävs ytterligare tvättsteg för att ta bort restfärgen7. Accepterade isoleringstekniker kan också bidra till falskt positiva signaler på grund av koagulering som uppstår under EV-isolering. Till exempel används seriell ultracentrifugation (UC) ofta för att isolera EVs och ta bort det immobiliserade färgämnet. UC kan dock fälla ut EVs tillsammans, och restfärgen kan leda till en falskt positiv signal12,13. Andra nanofiltreringsmetoder, såsom kolumnbaserad filtrering, används också ofta för icke-immobiliserad färgborttagning. Den komplexa karaktären hos EVs och färgämne som interagerar inom kolonnmatrisen kan leda till ofullständigt avlägsnande av restfärg på grund av att kolonnens molekylära avskärning ändras av den komplexa indata14,15,16.
Det nuvarande protokollet föreslår en nanofiltreringsbaserad mikrofluidisk enhet för att isolera och tvätta fluorescerande märkta isolerade EVs. Den nanofiltreringsbaserade mikrofluidiska enheten kan ge effektiv filtrering via vätskeassisterad separationsteknik (FAST)17,18. FAST minskar tryckfallet över filtret, vilket minskar den potentiella aggregeringen mellan EVs och färgämnen. Genom att effektivt avlägsna restfärg är det möjligt att förbättra kvaliteten på fluorescerande märkta EVs och analysens specificitet.
Konfokal mikroskopi kan skilja mellan internaliserade och ytligt fästa EVs på cellytan och grundligt undersöka cellulära mekanismerna för EV-upptag i en spatiotemporal upplösning19,20,21,22,23,24,25. Till exempel beskrev Sung et al. visualiseringen av exosomlivscykeln med hjälp av deras utvecklade live-cell reporter. Platsen för de internaliserade EVs upptäcktes och analyserades med hjälp av ett konfokalt mikroskop i tredimension (3D) och efterbild bearbetningsverktyg20. Även om storleken på små EL (40-200 nm) ligger under upplösningsgränsen för det optiska mikroskopet, kan de fluorescerande märkta EVs detekteras av konfokal mikroskopi eftersom fotodetektorn kan upptäcka det förbättrade fluorescensutsläppet. Därför kan subcellulär lokalisering av fluorescerande märkta EVs i en cell exakt bestämmas genom att förvärva flera z-staplade bilder av EVs och de omgivande cellulära organellerna.
Dessutom kan 3D-rekonstruktion och efterdatabehandling ge ytterligare insikt i positionering av internaliserade, ytliga och fritt flytande EVs. Genom att använda dessa processer i samband med den tidsfördröjning live-cell imaging som erbjuds av konfokal mikroskopi, nivån av EV-upptag kan utvärderas exakt, och realtidsspårning av EV-upptag är också möjligt. Vidare kan ev trafficking analys utföras med hjälp av konfokal mikroskopi genom att bedöma samlokalisering av EVs med organeller, ett första steg för att avgöra hur internaliserade EVs är involverade i den intracellulära funktionen. Detta protokoll beskriver metoden för att utföra en EV-upptagsanalys med hjälp av nanofiltreringsbaserad mikrofluidisk enhet17,26, konfokal mikroskopi och analys efter bilden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>353038</td>
			<td>Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Orange CMTMR Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C2927</td>
			<td>Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Apo Lambda S 40XC WI</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77400</td>
			<td>Objective for confocal imaging, NA=1.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo VC 20X</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD70200</td>
			<td>Objective for confocal imaging, NA=0.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exodisc</td>
			<td>Labspinner Inc.</td>
			<td>EX-D1001</td>
			<td>A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoDiscovery</td>
			<td>Labspinner Inc.</td>
			<td>EX-R1001</td>
			<td>Operation device for Exodisc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-depleted FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2720801</td>
			<td>Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1500-500</td>
			<td>Nutrient for cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L preadsorbed</td>
			<td>abcam</td>
			<td>&#160;ab7063</td>
			<td>Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi USA&#160;U DISH &#956;-Dish 35 mm</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td>Culture dish for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 9.7.1</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>9.7.1</td>
			<td>Post-image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer</td>
			<td>Live Cell Instrument</td>
			<td>TU-O-20</td>
			<td>Incubator system for live cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Camera for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Inverted microscope for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 4.50.00</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>4.50.00</td>
			<td>Image processing software for Nikon microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA, NanoSight NS500</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>NS500</td>
			<td>Measurement device for EV concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 2020</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td>9.7.0.185</td>
			<td>Graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Antibiotics for cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21875034</td>
			<td>Cell culture media for PC3 cell line cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solution in DMSO</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S32703</td>
			<td>RNA staining fluorescent dye for the EV labeling</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extracellular vesicle uptake assay via confocal microscope imaging analysis

Det finns ett behov av praktiska analyser för att visualisera och kvantifiera cellernas extracellulära vesikel (EV) upptag. Ev-upptagning spelar en roll i intercellulär kommunikation inom olika forskningsområden; cancerbiologi, neurovetenskap och läkemedelsleverans. Många EV upptag analyser har rapporterats i litteraturen; Det saknas dock praktisk, detaljerad experimentell metodik. EV-upptag kan bedömas genom att fluorescerande märka EVs för att upptäcka deras plats i celler. Att skilja mellan internaliserade EVs i celler och de ytliga EVs på celler är svårt, men ändå kritiskt, att exakt bestämma EV-upptaget. Därför föreslås en analys som effektivt kvantifierar EV-upptag genom tredimensionell (3D) fluorescenskonfokal mikroskopi i detta arbete. Fluorescerande märkta EVs förbereddes med hjälp av en nanofiltreringsbaserad mikrofluidisk enhet, visualiserad av 3D-konfokal mikroskopi och analyserades sedan genom avancerad bildbehandlingsprogramvara. Protokollet ger en robust metodik för att analysera EVs på cellnivå och ett praktiskt tillvägagångssätt för effektiv analys.

Med hjälp av en nanofiltreringsbaserad mikrofluidisk enhet isolerades EVs från PC3 CCM och märktes med en fluoroforkonjugerad EV-specifik (CD63) antikropp (figur 1). De märkta EVs visualiserades framgångsrikt av 3D confocal mikroskopi (figur 2). De märkta EVs inkuberades med celler i flera timmar i exosom-utarmade medier. Efter inkubation tvättades cellerna med exosom utarmade medier. De återstående EVs internaliserades eller följdes till celler under ...

Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis at JoVE.com

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Extracellulära blåsor (EVs) bidrar till cellulär biologi och intercellulär kommunikation. Det finns ett behov av praktiska analyser för att visualisera och kvantifiera EVs-upptag av cellerna. Det nuvarande protokollet föreslår EV-upptagsanalysen genom att använda tredimensionell fluorescensavbildning via konfokal mikroskopi, efter EV-isolering av en nanofiltreringsbaserad mikrofluidisk enhet.

Extracellulär vesicle uptake assay via confocal mikroskop imaging analys

There is a need for practical assays to visualize and quantify the cells' extracellular vesicle (EV) uptake. EV uptake plays a role in intercellular ...

Detta protokoll ger en robust metodik för att analysera EVs på cellnivå och ett praktiskt tillvägagångssätt för effektiv EV-upptag och EV-spårningsanalys. Denna metod för EV-märkning eliminerar samutfällning av EVs och färgämne, vilket förbättrar EV-signalerna. Ev-upptag mäts genom volymetrisk analys för att skilja de internaliserade EVs från de ytliga EVs.EVs är aktiv last, så deras upptag möjliggör överföring av biokemiska molekyler. För forskning om EV-baserad läkemedelsleverans och cancerterapi kan denna teknik vara ett bedömningsverktyg. EV-upptag spelar en roll i intercellulär kommunikation och undersöks inom olika forskningsområden, såsom cancerbiologi, neurovetenskap och läkemedelsleverans.Detta protokoll kan potentiellt underlätta effektiv EV-upptagsanalys. För isolering av extracellulära blåsor, eller EVs, injicera en milliliter förbehandlade cellodlingsmedier i provkammaren i den nanofiltrationsbaserade mikrofluidiska enheten. För att använda enheten, snurra enheten i bänkskivans spinnmaskin vid 3000 RPM i 10 minuter.Efter spinning, ta bort vätskan från avfallskammaren genom pipettering eller aspiration, upprepa sedan denna procedur två gånger för bearbetning av ytterligare två milliliter av cellodlingsmediet. För att tvätta de isolerade EL:erna, injicera sedan en milliliter PBS i provkammaren och snurra enheten i bänkskivans spinnmaskin. För immunofluorescerande märkning av EVs, injicera ett mikrogram per milliliter av den EV-specifika antikroppen i elutionshålet i enheten som innehåller 100 mikroliter isolerade EVs.Inkubera sedan i en timme i mörkret på en plattskakapparat för att säkerställa en jämn fördelning av antikroppen över provet. Fäst sedan en tejp på elutionshålet. Injicera en milliliter PBS i provkammaren för att tvätta ut kvarvarande antikroppar och snurra sedan enheten tills provkammaren är tom.Upprepa tvätten genom att injicera ytterligare en milliliter PBS i provkammaren och snurra enheten som visats tidigare. Efter att ha avlägsnat restvätskan från kammaren, pipettera de fluorescerande märkta EVs från membrankammaren till ett gult rör eller mikrorör. Skydda röret från ljus tills det används.Frö fyra gånger 10 till de fjärde PC3-cellerna i en 35-milliliter skål med ett milliliter media. Låt cellerna klibba över natten under optimala cellodlingsförhållanden. Följande dag tvätta de vidhäftade cellerna två gånger med exosom-utarmade medier.Efter utspädd de fluorescerande märkta EVs till lämplig koncentration med exosom-utarmade medier, tillsätt de utspädda EVs till de vidhäftade målcellerna och inkubera för önskad experimentell tid. Efter att ha tagit bort icke-internaliserade EVs genom att tvätta cellerna tre gånger med exosomfria medier, märka cytoplasma i de vidhäftade cellerna med ett mikrogram per milliliter CMTMR och inkubera i optimala cellodlingsförhållanden. För levande cellavbildning, placera de förberedda cellerna i inkubatorn på scenen.När du har ställt in bildparametrarna baserat på kontrollprover bestämmer du målcellernas djup och intervallet för staplingsstorlek i Z-riktningen för att hämta 3D-konfokala bilder och ställer sedan in bildförvärvet på flera Z-staplade bilder av både cellspecifikt färgämne och EV-specifikt färgämne samtidigt. För bildbehandling, använd automatisk bildbehandlingsprogramvara. Om du vill skapa virtuella ytor på cellerna klickar du på Lägg till nya ytor.Om du vill konfigurera de virtuella cellytorna klickar du på knappen Lägg till och väljer Kvalitet som filtertyp. Tröskelvärdet för lämpligt värde för den låga gränsen genom visuell inspektion, ange det maximala värdet för den övre gränsen och klicka på knappen Slutför Nästa, klicka på knappen Lägg till nya fläckar för att bygga de virtuella punkterna i EVs. Under Algoritminställningar väljer du Olika dekorstorlekar och kortaste avståndsberäkning, klickar sedan på Nästa och väljer Kanal 1 Alexa Fluor 488 som källkanal.Ange lämpligt värde för den uppskattade XY-diametern under Dekoridentifiering och klicka på Nästa. Om du vill konfigurera de virtuella EV-prickarna klickar du på knappen Lägg till och väljer Kvalitet som filtertyp. Ange det lägre tröskelvärdet med en visuell inspektion och klicka på Nästa för dekorregionertyp, välj Absolut intensitet och klicka sedan på Nästa.Om du vill tröskelvärdera regionen ev-prickar anger du lämpligt värde för regiontröskeln genom visuell inspektion. Välj Diameter från under Regionvolym och klicka på Slutför. Om du vill dela upp de grupperade fläckarna inuti den byggda ytan klickar du på Byggfläckarna och går in i Filter.Klicka sedan på knappen Lägg till och välj Kortaste avstånd till ytor, Surfaces Surface 1 som filtertyp. När du har ställt in det lägsta tröskelvärdet för den låga gränsen och lämpligt värde för den övre gränsen klickar du på knappen Duplicera till knappen Nya fläckar. Om du vill räkna EVs automatiskt i cellerna klickar du på markeringen Byggda fläckar 1, går till Statistik och exporterar värdet från det totala antalet fläckar.Om du vill hämta antalet celler klickar du på De byggda ytorna 1 och går sedan till Statistik och exporterar värdet för totalt antal ytor från Övergripande. Slutligen går du till fliken Detaljerad under Statistik för att exportera volymen. EVs isolerade från PC3 cell kultur media med hjälp av en nanofiltration-baserade mikrofluidic enhet var märkt med en fluor-4-konjugerad EV-specifika antikropp och visualiseras med hjälp av 3D confocal mikroskopi.De internaliserade EVs visualiserades som punkta och en individuell EV.Post-bearbetning av dessa bilder möjliggör visualisering och kvantifiering av EV internalisering i cellerna. Resultaten av ev-upptagningsanalysen indikerar att nivån på EV-upptaget beror på inkubationstidens längd. Antalet internaliserade EVs kan normaliseras till mottagarens cellvolym för att bestämma den faktiska frekvensen av EV-upptag för den angivna cellen.Detta förfarande gör det möjligt att systematiskt utesluta icke-internaliserade elfordon för att exakt mäta antalet internaliserade elfordon. Storleksfördelningen för internaliserade EV-prickar visas här. Så de viktigaste stegen är användningen av den mikrofluidiska enheten för EV-märkning, minimering av bakgrundfluorescens vid visualisering av fluorescerande EVs och sedan analysen efter avbildning för att bestämma internaliserade kontra ytliga EVs.Så intracellulär EV spårning kan utföras i realtid på ett 3D-plan, och dessutom, EV trafficking analys på rumsliga / tidsmässiga resolutioner och samlokalisering av EVs med subcellulära organeller kan uppnås. Så vi tror att denna teknik ger ett enklare och effektivare sätt att undersöka EVs inom de intra- och extracellulära matriserna för forskare inom det cellulära kommunikationsfältet för EVs.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Unit 1

Endocytosis and Exocytosis

SCIENTISTS IN ACTION

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Korrekt vård och rengöring av mikroskopet

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Major Components of the Light Microscope

Viktigaste komponenterna i ljusmikroskop

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

En Neuronal och astrocyternas Co-Kultur-analys för High innehållsanalys av Neurotoxicitet

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluorescens-baserad Mätning av Store-drivs kalcium Entry i levande celler: från odlade Cancer Cell till skelettmuskulatur Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

LDL-kolesterol upptag Assay använder levande Cell Imaging analys med Cell hälsoövervakning

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...

Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization by Nano-Flow Cytometry

Enkel extracellulär vesikeltransmembranproteinkarakterisering genom nanoflödescytometri

Single particle characterization has become increasingly relevant for research into extracellular vesicles, progressing from bulk analysis techniques and ...

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

Analys av extracellulär vesikelmedierad vaskulär förkalkning med användning av in vitro- och in vivo-modeller

Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world, and vascular calcification is the most significant predictor of cardiovascular events; ...

Multimodal Analytical Platform on a Multiplexed Surface Plasmon Resonance Imaging Chip for the Analysis of Extracellular Vesicle Subsets

Multimodal analytisk plattform på ett multiplexerat ytplasmonresonansbildningschip för analys av extracellulära vesikelundergrupper

Extracellular vesicles (EVs) are membrane-derived, tiny vesicles produced by all cells that range from 50 to several hundreds of nanometers in diameter ...

Imaging of Mitochondrial Peroxide in Living Yeast Cells Using mtHyper7

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Advancing Mitochondrial Research Â– mtHyper7 Biosensor for Subcellular Analysis (Video) | JoVE

Avbildning av mtHyPer7, en ratiometrisk biosensor för mitokondriell peroxid, i levande jästceller

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...

Intravital Imaging Using an Inverted Microscope to Track Skin Cell Dynamics

Streamlined Intravital Imaging Approach for Long-Term Monitoring of Epithelial Tissue Dynamics on an Inverted Confocal Microscope

Developing a Tool for Using Inverted Confocal Microscopes for In Vivo Intravital Imaging (Video) | JoVE

Strömlinjeformad intravital avbildningsmetod för långtidsövervakning av epitelvävnadsdynamik på ett inverterat konfokalmikroskop

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It ...