Name: extracellular vesicle uptake assay via confocal microscope imaging analysis
Uploaded: 2022-02-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis at JoVE.com

Bu çalışma NCI grant nos tarafından desteklendi. U54CA143803, CA163124, CA093900 ve CA143055 için K. J. P. Bu araştırma, Kore Sağlık Ve Refah Bakanlığı, Kore Cumhuriyeti (hibe numarası: HI19C1122) tarafından finanse edilen Kore Sağlık Endüstrisi Geliştirme Enstitüsü (KHIDI) aracılığıyla Kore Sağlık Teknolojisi Ar-Ge Projesi'nin hibesi ile desteklenmiştir. J. Kim ve Y.-K. tarafından çalışılarak. Cho, Kore Hükümeti tarafından finanse edilen Temel Bilimler Enstitüsü (IBS-R020-D1) tarafından desteklendi. Yazarlar, brady üroloji enstitüsünün mevcut ve geçmiş üyelerine, özellikle Pienta-Amend laboratuvarı üyelerine, makalenin eleştirel okumaları için teşekkür eder.

1. EV izolasyonu ve çip üzerinde immün floresan EV etiketleme
<ol><li>Hücre kültürü medyasının (CCM) toplanması ve EV yalıtımı için CCM'nin ön işlenmesi<ol>
<li>75 cm2 hücre kültürü şişesinde %30 izdiahta tohum PC3 hücreleri. Kontrol hücrelerinin standart ortamda ve hücre hattına özgü takviyelerde %90 izdiah (~48 h) büyümesine izin verin. NOT: EV içeren bileşenlerin hücresel alımı (yani fetal sığır serumu) etkilemesini önlemek için eksozom tükenmiş ortam ve takviy...

<ol>
	<li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+Ectosomes+in+Intercellular+Communication.">Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication.</a> Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).</li><li>Sunkara, V., Woo, H. -. K., Cho, Y. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+techniques+in+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles+and+their+roles+in+cancer+diagnostics+and+prognostics.">Emerging techniques in the isolation and characterization of extracellular vesicles and their roles in cancer diagnostics and prognostics.</a> The Analyst. 141 (2), 371-381 (2016).</li><li>Kalluri, R., Lebleu, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology,+function,+and+biomedical+applications+of+exosomes.">The biology, function, and biomedical applications of exosomes.</a> Science. 367 (6478), (2020).</li><li>Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificities+of+secretion+and+uptake+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+cell-to-cell+communication.">Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).</li><li>Bonsergent, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+characterization+of+extracellular+vesicle+uptake+and+content+delivery+within+mammalian+cells.">Quantitative characterization of extracellular vesicle uptake and content delivery within mammalian cells.</a> Nature Communications. 12, 1864 (2021).</li><li>Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routes+and+mechanisms+of+extracellular+vesicle+uptake.">Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).</li><li>Dehghani, M., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+extracellular+vesicles.">Fluorescent labeling of extracellular vesicles.</a> Methods Enzymology. 645, 15-42 (2020).</li><li>Ragni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovative+Visualization+and+Quantification+of+Extracellular+Vesicles+Interaction+with+and+Incorporation+in+Target+Cells+in+3D+Microenvironments.">Innovative Visualization and Quantification of Extracellular Vesicles Interaction with and Incorporation in Target Cells in 3D Microenvironments.</a> Cells. 9 (5), 1180 (2020).</li><li>Saari, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLIM+reveals+alternative+EV-mediated+cellular+up-take+pathways+of+paclitaxel.">FLIM reveals alternative EV-mediated cellular up-take pathways of paclitaxel.</a> Journal of Controlled Release. 284, 133-143 (2018).</li><li>Franzen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Uptake+and+Internalization+of+Exosomes+by+Bladder+Cancer+Cells.">Characterization of Uptake and Internalization of Exosomes by Bladder Cancer Cells.</a> BioMed Research International. 2014, 619829 (2014).</li><li>Feng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Internalization+of+Exosomes+Occurs+Through+Phagocytosis.">Cellular Internalization of Exosomes Occurs Through Phagocytosis.</a> Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).</li><li>Hoen, E. N. M. N. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+qualitative+flow+cytometric+analysis+of+nanosized+cell-derived+membrane+vesicles.">Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).</li><li>Van Der Vlist, E. J., Nolte-'T Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry.">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).</li><li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+Exosome+Isolation+Techniques.">Progress in Exosome Isolation Techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+perspective+on+exosome+isolation+-+efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics.">and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li><li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+distinct+exosome+subpopulations:+isolation+and+characterization+approaches+and+their+associated+challenges.">Separation of distinct exosome subpopulations: isolation and characterization approaches and their associated challenges.</a> The Analyst. 146 (12), 3731-3749 (2021).</li><li>Woo, H. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exodisc+for+Rapid,+Size-Selective,+and+Efficient+Isolation+and+Analysis+of+Nanoscale+Extracellular+Vesicles+from+Biological+Samples.">Exodisc for Rapid, Size-Selective, and Efficient Isolation and Analysis of Nanoscale Extracellular Vesicles from Biological Samples.</a> ACS Nano. 11 (2), 1360-1370 (2017).</li><li>Kim, T. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAST:+Size-Selective,+Clog-Free+Isolation+of+Rare+Cancer+Cells+from+Whole+Blood+at+a+Liquid-Liquid+Interface.">FAST: Size-Selective, Clog-Free Isolation of Rare Cancer Cells from Whole Blood at a Liquid-Liquid Interface.</a> Analytical Chemistry. 89 (2), 1155-1162 (2017).</li><li>Joshi, B. S., De Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+of+Extracellular+Vesicles+and+Release+of+Their+Cargo+from+Endosomes.">Endocytosis of Extracellular Vesicles and Release of Their Cargo from Endosomes.</a> ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).</li><li>Sung, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+live+cell+reporter+of+exosome+secretion+and+uptake+reveals+pathfinding+behavior+of+migrating+cells.">A live cell reporter of exosome secretion and uptake reveals pathfinding behavior of migrating cells.</a> Nature Communications. 11, 2092 (2020).</li><li>Heusermann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+surf+on+filopodia+to+enter+cells+at+endocytic+hot+spots,+traffic+within+endosomes,+and+are+targeted+to+the+ER.">Exosomes surf on filopodia to enter cells at endocytic hot spots, traffic within endosomes, and are targeted to the ER.</a> Journal of Cell Biology. 213 (2), 173-184 (2016).</li><li>Reclusa, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+extracellular+vesicles+visualization:+From+static+to+motion.">Improving extracellular vesicles visualization: From static to motion.</a> Scientific Reports. 10, 6494 (2020).</li><li>Verweij, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Tracking+of+Inter-organ+Communication+by+Endogenous+Exosomes+In+Vivo.">Live Tracking of Inter-organ Communication by Endogenous Exosomes In Vivo.</a> Developmental Cell. 48 (4), 573-589 (2019).</li><li>Lai, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+tracking+of+tumour+extracellular+vesicle+delivery+and+RNA+translation+using+multiplexed+reporters.">Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters.</a> Nature Communications. 6, 7029 (2015).</li><li>Durak-Kozica, M., Baster, Z., Kubat, K., St&#281;pie&#324;, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+visualization+of+extracellular+vesicle+uptake+by+endothelial+cells.">3D visualization of extracellular vesicle uptake by endothelial cells.</a> Cellular &amp; Molecular Biology Letters. 23, 57 (2018).</li><li>Sunkara, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+Automated,+Label-Free+Isolation+of+Extracellular+Vesicles+from+Whole+Blood+for+Cancer+Diagnosis+and+Monitoring.">Fully Automated, Label-Free Isolation of Extracellular Vesicles from Whole Blood for Cancer Diagnosis and Monitoring.</a> Theranostics. 9 (7), 1851-1863 (2019).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+trophoblastic+small+extracellular+vesicles+and+detection+of+their+miRNA+cargo+in+P-bodies.">Internalization of trophoblastic small extracellular vesicles and detection of their miRNA cargo in P-bodies.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1812261 (2020).</li><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+evaluation+of+methods+for+small+extracellular+vesicles+separation+from+human+plasma,+urine+and+cell+culture+medium.">Comprehensive evaluation of methods for small extracellular vesicles separation from human plasma, urine and cell culture medium.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10, 12044 (2020).</li></ol>

Konfokal mikroskopi ile 3D floresan görüntülemeye dayalı bir EV alma analizi, etkili bir metodoloji ve hassas analiz sağlar. Bu floresan EV etiketlemesi, EV'lerin görselleştirilmesini kolaylaştırır ve hassas bir EV alma testini başarıyla gerçekleştirir. EV'leri etiketlemek ve artık boyayı çıkarmak için önceki yöntemler, ultracentrifugation (UC) kullanarak yağışı kaldırarak bildirilmiştir; bununla birlikte, UC EV'leri birlikte çökeltebilir ve hareketsiz boya yanlış-pozitif sinyale y...

Hücre dışı veziklinler (EV'ler), boyutlarına göre kategorize edilen nano boyutlu, lipid zara bağlı parçacıklardır: ektozomlar (100-500 nm) ve ekzozomlar (50-150 nm)1. EV'ler proteinler, nükleik asitler ve lipitler gibi çeşitli biyomoleküller içerir. Bu biyomoleküller, kargo olarak kapsüllenmeden önce hücrelerden kaynaklanır ve EV'ler aracılığıyla hücre dışı alana salınır1,2,3.
Kargolarının çeşitliliği nedeniyle, EV'lerin hücreler arası iletişimde aktif bir rol oynadığına inanılmaktadır. EV'lerin hücreler tarafından salınması ve alınması, hücreler arasında biyomoleküllerin aktarılmasına izin verir4,5. EV kargosunun bir hücreye girişi alıcı hücrenin işlevlerini ve homeostatik durumunu değiştirebilir4,5,6. EV'ler birden fazla yoldan içselleştirilir; ancak, kesin mekanizmalar doğru bir şekilde gösterilmemiştir.
Ev alma testlerinin çoğunluğu, genetik etiketleme gibi, floresan olarak bireysel EV'leri etiketler7. Elde edilen sinyal mikro plaka fotometresi, akış sitometrisi veya mikroskopi ile ölçülebilir ve her teknolojinin önemli sınırlamaları vardır. Mikro plaka fotometreleri, akış sitometrisi veya standart iki boyutlu (2B) mikroskopi, içselleştirilmiş ve yüzeysel olarak bağlı EV'leri ayırt edemez8,9. Ayrıca, bu tekniklerin her biri için gerekli örnek hazırlama, EV alım değerlendirmesine ek sorunlar getirebilir. Örneğin, EV alım analizinden önce yapışık hücreleri tripsin ile kaldırmak, hücrenin yüzeyinde yüzeysel olarak bağlı bazı EV'leri ayırabilir10,11. Tripsin hücre yüzeyi ile de etkileşime girerek hücre ve EV fenotipini etkileyebilir. Ek olarak, tripsin yüzeysel EV'leri tamamen ayıramayabilir, yalıtılmış popülasyonları eğriltebilir.
EV'leri floresan boyalarla doğru bir şekilde etiketlemek için, artık boyayı çıkarmak için ek yıkama adımları gereklidir7. Kabul edilen izolasyon teknikleri, EV izolasyonu sırasında ortaya çıkan pıhtılaşma nedeniyle yanlış-pozitif sinyallere de katkıda bulunabilir. Örneğin, seri ultrasantrifüjleme (UC), EV'leri izole etmek ve hareketsiz boyayı çıkarmak için yaygın olarak kullanılır. Bununla birlikte, UC EV'leri birlikte çökeltebilir ve artık boya yanlış-pozitif sinyale yol açabilir12,13. Sütun bazlı filtrasyon gibi diğer nano filtrasyon yöntemleri de hareketsiz boya giderme için yaygın olarak kullanılmaktadır. Sütun matrisi içinde etkileşime giren EV'lerin ve boyanın karmaşık doğası, karmaşık giriş14,15,16 tarafından değiştirilen sütunun moleküler kesilmesi nedeniyle artık boyanın eksik çıkarılmasına neden olabilir.
Mevcut protokol, floresan etiketli izole EV'leri izole etmek ve yıkamak için nano filtrasyon tabanlı bir mikroakışkan cihaz önermektedir. Nano filtrasyon tabanlı mikroakışkan cihaz, sıvı destekli ayırma teknolojisi (FAST)17,18 ile verimli filtrasyon sağlayabilir. FAST, filtredeki basınç düşüşünü azaltarak EV'ler ve boyalar arasındaki olası toplamayı azaltır. Artık boyayı verimli bir şekilde kaldırarak, floresan etiketli EV'lerin kalitesini ve testlerin özgüllüğünü artırmak mümkündür.
Konfokal mikroskopi, hücre yüzeyindeki içselleştirilmiş ve yüzeysel olarak bağlı EV'leri ayırt edebilir ve mekansal çözünürlükte EV alımının hücresel mekanizmalarını kapsamlı bir şekilde araştırabilir19,20,21,22,23,24,25. Örneğin, Sung ve arkadaşları, gelişmiş canlı hücre muhabirlerini kullanarak eksozom yaşam döngüsünün görselleştirilmesini tanımladı. İçselleştirilmiş EV'lerin konumu, üç boyutlu (3D) ve görüntü sonrası işleme araçlarında bir konfokal mikroskop kullanılarak tespit edildi ve analiz edildi20. Küçük EV'lerin boyutu (40-200 nm) optik mikroskobun çözünürlük sınırının altında olmasına rağmen, fotodetektör gelişmiş floresan emisyonu tespit edebildiğinden, floresan etiketli EV'ler konfokal mikroskopi ile tespit edilebilir. Bu nedenle, bir hücre içindeki floresan etiketli EV'lerin hücre altı lokalizasyonu, EV'lerin ve çevresindeki hücresel organellerin birden fazla z yığılmış görüntüsü alınarak tam olarak belirlenebilir.
Ayrıca, 3D rekonstrüksiyon ve veri sonrası işleme, içselleştirilmiş, yüzeysel ve serbest yüzen EV'lerin konumlandırılması hakkında daha fazla bilgi sağlayabilir. Bu süreçler konfokal mikroskopinin sunduğu hızlandırılmış canlı hücre görüntülemesi ile birlikte kullanılarak, EV alımı seviyesi tam olarak değerlendirilebilir ve EV alımının gerçek zamanlı takibi de mümkündür. Ayrıca, EV kaçakçılık analizi, EV'lerin hücre içi işlevde nasıl içselleştirildiğini belirlemek için ilk adım olan organellerle birlikte lokalizasyonu değerlendirilerek konfokal mikroskopi kullanılarak yapılabilir. Bu protokol, nano filtrasyon tabanlı mikroakışkan cihaz17,26, konfokal mikroskopi ve görüntü sonrası analiz kullanarak ev alma tahlili yapmak için metodolojiyi açıklar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>353038</td>
			<td>Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Orange CMTMR Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C2927</td>
			<td>Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Apo Lambda S 40XC WI</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77400</td>
			<td>Objective for confocal imaging, NA=1.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo VC 20X</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD70200</td>
			<td>Objective for confocal imaging, NA=0.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exodisc</td>
			<td>Labspinner Inc.</td>
			<td>EX-D1001</td>
			<td>A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoDiscovery</td>
			<td>Labspinner Inc.</td>
			<td>EX-R1001</td>
			<td>Operation device for Exodisc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-depleted FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2720801</td>
			<td>Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1500-500</td>
			<td>Nutrient for cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L preadsorbed</td>
			<td>abcam</td>
			<td>&#160;ab7063</td>
			<td>Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi USA&#160;U DISH &#956;-Dish 35 mm</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td>Culture dish for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 9.7.1</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>9.7.1</td>
			<td>Post-image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer</td>
			<td>Live Cell Instrument</td>
			<td>TU-O-20</td>
			<td>Incubator system for live cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Camera for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Inverted microscope for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 4.50.00</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>4.50.00</td>
			<td>Image processing software for Nikon microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA, NanoSight NS500</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>NS500</td>
			<td>Measurement device for EV concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 2020</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td>9.7.0.185</td>
			<td>Graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Antibiotics for cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21875034</td>
			<td>Cell culture media for PC3 cell line cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solution in DMSO</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S32703</td>
			<td>RNA staining fluorescent dye for the EV labeling</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extracellular vesicle uptake assay via confocal microscope imaging analysis

Hücrelerin hücre dışı veziklin (EV) alımını görselleştirmek ve ölçmek için pratik tahlillere ihtiyaç vardır. EV alımı, çeşitli araştırma alanlarında hücreler arası iletişimde rol oynar; kanser biyolojisi, sinirbilim ve ilaç dağıtımı. Literatürde birçok EV alım tahlilleri bildirilmiştir; ancak pratik, detaylı deneysel metodoloji eksikliği vardır. EV alımı, hücrelerdeki konumlarını tespit etmek için EV'leri floresan olarak etiketlenerek değerlendirilebilir. Hücrelerdeki içselleştirilmiş EV'ler ile hücrelerdeki yüzeysel EV'ler arasında ayrım yapmak, EV alımını doğru bir şekilde belirlemek zor, ancak kritiktir. Bu nedenle, bu çalışmada üç boyutlu (3D) floresan konfokal mikroskopi ile EV alımını verimli bir şekilde ölçen bir test önermektedir. Floresan etiketli EV'ler nano filtrasyon tabanlı bir mikroakışkan cihaz kullanılarak hazırlandı, 3D konfokal mikroskopi ile görselleştirildi ve daha sonra gelişmiş görüntü işleme yazılımı ile analiz edildi. Protokol, EV'leri hücresel düzeyde analiz etmek için sağlam bir metodoloji ve verimli analiz için pratik bir yaklaşım sağlar.

Nano filtrasyon tabanlı bir mikroakışkan cihaz kullanılarak, EV'ler PC3 CCM'den izole edildi ve florofor konjuge EV'ye özgü (CD63) antikor ile etiketlendi (Şekil 1). Etiketli EV'ler 3D konfokal mikroskopi ile başarıyla görselleştirildi (Şekil 2). Etiketli EV'ler, eksozom tükenmiş ortamlarda birkaç saat boyunca hücrelerle inkübe edildi. Kuluçkadan sonra, hücreler ekzoms tükenmiş ortamla yıkandı. Kalan EV'ler inkübasyon sırasında içselle...

Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis at JoVE.com

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Hücre dışı veziklinler (EV' ler) hücresel biyolojiye ve hücreler arası iletişime katkıda bulunur. Hücrelerin ALDıĞı EV'leri görselleştirmek ve ölçmek için pratik tahlillere ihtiyaç vardır. Mevcut protokol, nano filtrasyon tabanlı bir mikroakışkan cihaz tarafından EV izolasyonunu takiben konfokal mikroskopi yoluyla üç boyutlu floresan görüntüleme kullanarak EV alma testini önermektedir.

Konfokal Mikroskop Görüntüleme Analizi ile Hücre Dışı Veziklin Alımı Analizi

There is a need for practical assays to visualize and quantify the cells' extracellular vesicle (EV) uptake. EV uptake plays a role in intercellular ...

Bu protokol, EV'leri hücresel düzeyde analiz etmek için sağlam bir metodoloji ve verimli EV alımı ve EV izleme analizi için pratik bir yaklaşım sağlar. Bu EV etiketleme yöntemi, EV'lerin ve boyaların birlikte çökeltilmesini ortadan kaldırır, böylece EV sinyallerini geliştirir. EV alımı, içselleştirilmiş EV'leri yüzeysel EV'lerden ayırt etmek için hacimsel analizle ölçülür.EV'ler aktif kargodur, bu nedenle alımları biyokimyasal moleküllerin transferine izin verir. EV tabanlı ilaç dağıtımı ve kanser tedavisi üzerine araştırmalar için bu teknik bir değerlendirme aracı olabilir. EV alımı hücreler arası iletişimde rol oynar ve kanser biyolojisi, sinirbilim ve ilaç dağıtımı gibi çeşitli araştırma alanlarında araştırılır.Bu protokol potansiyel olarak verimli EV alım testlerini kolaylaştırır. Hücre dışı veziküllerin veya EV'lerin izolasyonu için, nanofiltrasyon bazlı mikroakışkan cihazın örnek odasına bir mililitre önceden işlenmiş hücre kültürü ortamı enjekte edin. Cihazı çalıştırmak için, cihazı tezgah üstü iplik makinesinde 3000 RPM'de 10 dakika döndürün.Döndükten sonra, sıvıyı pipetleme veya aspirasyon yaparak atık odasından çıkarın, ardından hücre kültürü medyasının ek iki mililitresini işlemek için bu prosedürü iki kez tekrarlayın. Daha sonra, izole edilmiş EV'leri yıkamak için, numune odasına bir mililitre PBS enjekte edin ve cihazı tezgah üstü iplik makinesinde döndürün. EV'lerin immünofluoresan etiketlemesi için, 100 mikrolitre izole EV içeren cihazın elüsyon deliğine EV'ye özgü antikorun mililitresi başına bir mikrogram enjekte edin.Daha sonra antikorun numune boyunca eşit dağılımını sağlamak için bir plaka çalkalayıcı üzerinde karanlıkta bir saat kuluçkaya yatırın. Ardından, elution deliğine yapışkan bir bant takın. Kalan antikorları yıkamak için numune odasına bir mililitre PBS enjekte edin, ardından numune odası boşalana kadar cihazı döndürün.Numune odasına başka bir mililitre PBS enjekte ederek ve cihazı daha önce gösterildiği gibi döndürerek yıkamayı tekrarlayın. Artık sıvıyı odadan çıkardıktan sonra, floresan etiketli EV'leri membran odasından bir kehribar tüpüne veya mikro tüpe pipetle atın. Kullanıma kadar tüpü ışıktan koruyun.Dördüncü PC3 hücrelerine dört kez 10 kez bir mililitre ortam ile 35 mililitrelik bir tabağa tohumlayın. Hücrelerin en uygun hücre kültürü koşullarında gece boyunca yapışmasını sağlar. Ertesi gün, yapışkan hücreleri ekzozom tükenmiş ortamla iki kez yıkayın.Floresan etiketli EV'leri ekzozom tükenmiş ortam kullanarak uygun konsantrasyona seyreltdikten sonra, seyreltilmiş EV'leri yapışık hedef hücrelere ekleyin ve istenen deneysel süre boyunca kuluçkaya yatırın. Hücrelerin ekzozom içermeyen ortamla üç kez yıkanarak içselleştirilmemiş EV'leri çıkardıktan sonra, yapışık hücrelerin sitoplazmını mililitre başına bir mikrogram CMTMR ile etiketlenin ve optimal hücre kültürü koşullarında kuluçkaya yatırın. Canlı hücre görüntüleme için, hazırlanan hücreleri sahnedeki inkübatöre yerleştirin.Görüntüleme parametrelerini kontrol örneklerine göre ayarladıktan sonra, 3D konfokal görüntüler elde etmek için hedef hücrelerin derinliğini ve Z yönünde istifleme boyutu aralığını belirleyin, ardından görüntü alımını aynı anda hem hücreye özgü boyanın hem de EV'ye özgü boyanın birden fazla Z yığılmış görüntüsüne ayarlayın. Görüntü işleme için otomatik görüntü işleme yazılımı kullanın. Hücrelerin sanal yüzeylerini oluşturmak için Yeni Yüzeyler Ekle'yi tıklatın.Sanal hücre yüzeylerini yapılandırmak için Ekle düğmesini tıklatın ve filtre türü olarak Kalite'yi seçin. Görsel inceleme ile düşük sınır için uygun değeri eşikleyin, üst sınır için maksimum değeri ayarlayın ve SON düğmesini tıklatın sonra, EV'lerin sanal noktalarını oluşturmak için Yeni Noktalar Ekle düğmesini tıklatın. Algoritma Ayarları'nın altında Farklı Spot Boyutları ve En Kısa Mesafe Hesaplaması'nı seçin, ardından İleri'yi tıklatın ve kaynak kanal olarak Kanal 1 Alexa Fluor 488'i seçin.Spot Algılama'nın altına tahmini XY çapı için uygun değeri girin ve İleri'yi tıklatın. Sanal EV noktalarını yapılandırmak için Ekle düğmesini tıklatın ve filtre türü olarak Kalite'yi seçin. Görsel bir incelemeyle alt eşiği ayarlayın ve Spot Bölgeler Türü için İleri'yi tıklatın, Mutlak Yoğunluk'u seçin ve İleri'yi tıklatın.EV noktalarının bölgesini eşik için, görsel incelemeyle Bölge Eşiği için uygun değeri girin. Bölge Birimi altında çap'ı seçin ve Son'u tıklatın. Gruplanmış noktaları yerleşik yüzeyin içine bölmek için Yapı Noktaları'nı tıklatın ve Filtreler'e gidin.Ardından Ekle düğmesini tıklatın ve filtre türü olarak Yüzeylere En Kısa Mesafe, Yüzeyler Yüzey 1'i seçin. Alt sınır için en düşük eşiği ve üst sınır için uygun değeri ayarladıktan sonra, Bölümü yeni Noktalara Çoğalt düğmesini tıklatın. Hücrelerin içindeki EV'lerin otomatik sayımı için Yerleşik Noktalar 1 seçimini tıklatın, İstatistikler'e gidin ve değeri Toplam Nokta Sayısı'ndan dışa aktarın.Hücre sayısını elde etmek için, Yerleşik Yüzeyler 1'i tıklatın, sonra İstatistikler'e gidin ve Toplam Yüzey Sayısı değerini Genel'den dışa aktarın. Son olarak, birimi vermek için İstatistikler altındaki Ayrıntılı sekmesine gidin. Nanofiltrasyon tabanlı mikroakışkan bir cihaz kullanılarak PC3 hücre kültürü medyasından izole edilen EV'ler floro-4 konjuge EV'ye özgü antikor ile etiketlendi ve 3D konfokal mikroskopi kullanılarak görselleştirildi.İçselleştirilmiş EV'ler puncta olarak görselleştirildi ve bu görüntülerin bireysel EV.Post işlenmesi, EV içselleştirmesinin hücrelere görselleştirilmesini ve nicelleştirilmesini sağlar. EV alma tahlil sonuçları, EV alım seviyesinin kuluçka süresinin uzunluğuna bağlı olduğunu gösterir. İçselleştirilmiş EV sayısı, belirtilen hücre için GERÇEK EV alma oranını belirlemek için alıcı hücre hacmine normalleştirilebilir.Bu prosedür, içselleştirilmemiş EV'lerin sistematik olarak dışlanmasını ve içselleştirilmiş EV sayısının tam olarak ölçülmesine olanak tanır. İçselleştirilmiş EV noktalarının boyut dağılımı burada gösterilmiştir. Bu nedenle, temel adımlar EV etiketlemesi için mikroakışkan cihazın kullanılması, floresan EV'leri görselleştirirken arka plan floresanlarının en aza indirilmesi ve ardından içselleştirilmiş ve yüzeysel EV'leri belirlemek için görüntüleme sonrası analizdir.Böylece hücre içi EV takibi 3D düzlemde gerçek zamanlı olarak gerçekleştirilebilir ve ayrıca mekansal/zamansal çözünürlüklerde EV kaçakçılığı analizi ve evlerin hücre altı organellerle birlikte lokalizasyonu sağlanabilir. Bu nedenle, bu tekniğin EV'ler için hücresel iletişim alanındaki araştırmacılar için hücre içi ve hücre dışı matrislerdeki EV'leri araştırmak için daha kolay ve daha verimli bir yol sağladığına inanıyoruz.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Unit 1

Endocytosis and Exocytosis

SCIENTISTS IN ACTION

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Mikroskop Uygun Bakım ve Temizlik

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Major Components of the Light Microscope

Işık Mikroskobu Binbaşı Bileşenleri

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Nörotoksisite Yüksek İçerik Analizi Nöronal ve Astrosit Hücre Co-Kültür Testi

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Canlı hücreler Mağaza çalışan Kalsiyum Giriş Floresans tabanlı Ölçümü: Kültür Kanseri Hücre gelen İskelet Kası Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

LDL kolesterol alımını tahlil canlı hücre analizi ile hücre Imaging kullanarak sistem durumu izleme

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...

Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization by Nano-Flow Cytometry

Nano-Flow Sitometri ile Tek Hücre Dışı Vezikül Transmembran Protein Karakterizasyonu

Single particle characterization has become increasingly relevant for research into extracellular vesicles, progressing from bulk analysis techniques and ...

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

Hücre Dışı Vezikül Aracılı Vasküler Kalsifikasyonun In Vitro ve In Vivo Modeller Kullanılarak Analizi

Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world, and vascular calcification is the most significant predictor of cardiovascular events; ...

Multimodal Analytical Platform on a Multiplexed Surface Plasmon Resonance Imaging Chip for the Analysis of Extracellular Vesicle Subsets

Hücre Dışı Vezikül Alt Kümelerinin Analizi için Çok Katlı Yüzey Plazmon Rezonans Görüntüleme Çipi Üzerinde Multimodal Analitik Platform

Extracellular vesicles (EVs) are membrane-derived, tiny vesicles produced by all cells that range from 50 to several hundreds of nanometers in diameter ...

Imaging of Mitochondrial Peroxide in Living Yeast Cells Using mtHyper7

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Advancing Mitochondrial Research Â– mtHyper7 Biosensor for Subcellular Analysis (Video) | JoVE

Mitokondriyal Peroksit için Oransal Bir Biyosensör olan mtHyPer7'nin Canlı Maya Hücrelerinde Görüntülenmesi

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...

Intravital Imaging Using an Inverted Microscope to Track Skin Cell Dynamics

Streamlined Intravital Imaging Approach for Long-Term Monitoring of Epithelial Tissue Dynamics on an Inverted Confocal Microscope

Developing a Tool for Using Inverted Confocal Microscopes for In Vivo Intravital Imaging (Video) | JoVE

Epitel Doku Dinamiğinin İnverted Konfokal Mikroskopta Uzun Süreli İzlenmesi için Kolaylaştırılmış İntravital Görüntüleme Yaklaşımı

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It ...