Name: isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats
Uploaded: 2021-09-17T14:30:00
Duration: 8 min 12 s
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Este proyecto fue apoyado por P01HL095489. A.Y.H fue apoyado por T32HL066987.

NOTA: Los neutrófilos humanos se aislaron de sangre venosa de filtros de glóbulos blancos desechados obtenidos del Laboratorio del Banco de Sangre en el Hospital De Niños de Boston. Los donantes de sangre no eran identificables, y no había interacción con individuos vivos o conocimiento de información personal identificable. Por lo tanto, este trabajo no está clasificado como investigación de sujetos humanos bajo las regulaciones de sujetos humanos del HHS (45 CFR Parte 46). La Junta de Revisión Institucional del Hospital Pediátrico de Boston (IRB) aprobó el protocolo.
1. Estratificación del degradado
<ol><li>Después de esterilizar la capa buffy o el empaque de sangre entera y la capucha laminar, divida la sangre en tubos de 50 ml con 10 ml de sangre en cada tubo.</li>
	<li>Lleve el volumen hasta 35 ml con suero fetal bovino al 5% (FBS) / Solución de sal equilibrada de Hank (HBSS) para diluir la sangre para un gradiente más limpio. NOTA: Cuando se utiliza una membrana de leucoféresis, las células se pueden eliminar con una jeringa de 60 ml y 30 ml de FBS / HBSS al 5% por filtro. La dilución es innecesaria cuando se trabaja con sangre entera recién extraída.</li>
	<li>Cierre la tapa del tubo de 50 ml, mézclela varias veces por inversión y manténgala boca abajo para tener la parte inferior desprovista de glóbulos rojos.</li>
	<li>Agregue 10 ml de medio de gradiente de densidad (consulte la Tabla de materiales)directamente debajo de la sangre. Asegúrese de que el medio y la sangre no se mezclen y que la interfaz sea nítida (Figura 1A). NOTA: Este paso es crucial. Asegúrese de que la solución de gradiente de densidad esté a temperatura ambiente (RT) y bien mezclada antes de cada gradiente. El primer mililitro del medio de gradiente de densidad debe colocarse en capas cuidadosa y constantemente lo más lentamente posible. Se recomienda tener la velocidad de la pipeta electrónica establecida en baja.</li>
	<li>Coloque suavemente el tubo en una centrífuga sin alterar el gradiente y gire a 400 × g durante 30 minutos en RT, asegurándose de desactivar el freno. Observe cómo el gradiente hilado se separa en una capa superior de suero / plasma, un anillo blanco medio de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), una capa media de gradiente de densidad turbia y una bolita inferior que consiste en una banda blanca y delgada de neutrófilos en la parte superior de los glóbulos rojos(Figura 1B). NOTA: Un lado turbio u opaco del tubo después de la centrifugación puede sugerir que las células (neutrófilos) están activadas y pueden no ser adecuadas para su uso.</li>
	<li>Retire primero los PBMC emergiendo la pipeta de succión directamente en la capa de PBMC. Asegúrese de aspirarlo por completo mientras la capa de suero / plasma disminuye a medida que se retira el anillo. Raspe el lado del tubo donde las células se peletizaron con la pipeta de succión para maximizar la eliminación del PMBC. Retire con cuidado la capa media del gradiente de densidad turbia entre el anillo PBMC y el pellet de neutrófilos/glóbulos rojos. NOTA: Raspar las células peletadas en el lado del tubo aumenta considerablemente la pureza del aislamiento. Tenga cuidado de no aspirar el pellet, ya que la mayoría de los neutrófilos están sentados directamente encima de los glóbulos rojos.</li>
</ol>2. Sedimentación de eritrocitos (glóbulos rojos)
<ol><li>Usando una pipeta de 10 ml, transfiera el pellet de neutrófilos/glóbulos rojos a un tubo limpio. No pipetee hacia arriba y hacia abajo. Agregue 5% FBS / HBSS a un volumen final de 25 ml. Mezclar suavemente por inversión. NOTA: La realización de la sedimentación de rbc después de la eliminación de PBMC mejora el rendimiento y disminuye la activación10.</li>
	<li>Añadir directamente 25 ml de Dextrano al 3%/0,9% NaCl/H2O precalentado (37 °C) al 3% y mezclar suavemente por inversión. Coloque el tubo sobre una superficie nivelada y no vibratoria durante 15 minutos(Figura 1C). NOTA: Una sedimentación más larga reduce la contaminación por glóbulos rojos, pero también disminuye el rendimiento. Además, la exposición prolongada al dextrano puede conducir a la activación de neutrófilos o a la muerte celular11.</li>
	<li>Lleve suavemente el tubo de vuelta a la campana (para aislamiento estéril). Sumergiendo solo ligeramente la pipeta en el líquido, recoja la capa superior (~ 30 ml) siguiendo la superficie del líquido hacia abajo. NOTA: Si la sedimentación produce una interfaz nítida entre el medio y los glóbulos rojos, el pellet de glóbulos rojos es más pequeño, o si se desea un mayor rendimiento, recolectar hasta 35 ml.</li>
	<li>Gire el tubo (400 × g,10 min, RT, usando freno bajo (3)), dando como resultado un pellet rojo sin partículas flotando en el medio.</li>
</ol>3. Lisis de los glóbulos rojos residuales
<ol><li>Aspire suavemente el sobrenadante sin interrumpir el pellet.</li>
	<li>Agregue 25 ml de agua ultrapura estéril directamente en el tubo y mezcle suavemente invirtiendo durante 28 s para lisar los glóbulos rojos. No use una pipeta para resuspendir el pellet. NOTA: No exceda los 30 s ya que las condiciones hipotónicas prolongadas pueden activarse y conducir a la muerte de neutrófilos12.</li>
	<li>Agregue inmediatamente 25 ml de NaCl/H 2 O estéril al1,8%en el tubo y mezcle suavemente invirtiendo para devolver la solución a condiciones isotónicas. NOTA: La solución debe ser roja pero sin turbidez.</li>
	<li>Girar hacia abajo a 200 × g durante 3-5 min con freno bajo (nivel 3) para minimizar los glóbulos rojos y la sedimentación plaquetaria junto con los neutrófilos(Figura 1D y Figura 2)13,14. NOTA: El pellet debe ser blanco con una capa mínima de glóbulos rojos en la parte superior, que se puede quitar suavemente mientras se aspira el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspenda los neutrófilos pipeteando el medio de cultivo (10% FBS/RPMI1640) directamente sobre el pellet, pero no pipete hacia arriba y hacia abajo. Balancee el tubo horizontalmente de lado a lado para minimizar la activación celular. NOTA: Las células deben mantenerse en una concentración de ~ 2 × 106 células / ml, ya que una mayor densidad conducirá a una mayor activación / muerte celular15. Por la misma razón, el pellet celular debe resuspendse lo antes posible.</li>
	<li>Si se observa agregación o aglutinamiento celular, filtre la suspensión celular utilizando una malla de 70 μm para descartar neutrófilos agrupados.</li>
</ol>4. Determinación de la calidad del aislamiento de neutrófilos
<ol><li>Teñir las células con marcadores específicos para neutrófilos (CD66b, CD11b), eosinófilos (CD193)(Figura 3),y un marcador de activación como CD62L(Figura 4). Adquirir 20.000 células por citometría de flujo. Analizar la pureza y activación celular utilizando las estrategias de gating propuestas en la Figura 3 y la Figura 4. NOTA: La calidad de la preparación de neutrófilos se puede evaluar utilizando una solución de ácido acético-azul de metileno al 3% para visualizar el núcleo lobulado único de neutrófilos.</li>
	<li>Determinar la viabilidad celular utilizando Annexin V/propidium iodide (PI) (Figura 5). NOTA: La tinción azul tripano se puede utilizar para evaluar la viabilidad celular.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil:+A+cell+with+many+roles+in+inflammation+or+several+cell+types.">Neutrophil: A cell with many roles in inflammation or several cell types.</a> Frontiers in Physiology. 9, 113 (2018).</li><li>Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+function:+from+mechanisms+to+disease.">Neutrophil function: from mechanisms to disease.</a> Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).</li><li>Stoller, J. 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Immunology. 14 (5), 302-314 (2014).</li><li>Summers, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+kinetics+in+health+and+disease.">Neutrophil kinetics in health and disease.</a> Trends in Immunology. 31 (8), 318-324 (2010).</li><li>Pedruzzi, E., Fay, M., Elbim, C., Gaudry, M., Gougerot-Pocidalo, M. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+neutrophils+from+venous+blood.">Isolation of human neutrophils from venous blood.</a> Methods in Molecular Biology. 2087, 33-42 (2020).</li><li>Quach, A., Ferrante, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+dextran+sedimentation+as+an+initial+step+in+neutrophil+purification+promotes+their+stimulation,+due+to+the+presence+of+monocytes.">The application of dextran sedimentation as an initial step in neutrophil purification promotes their stimulation, due to the presence of monocytes.</a> Journal of Immunological Research. 2017, 1254792 (2017).</li><li>Thorson, L. M., Turkalj, A., Hung, J. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+isolation+from+nonhuman+species.">Neutrophil isolation from nonhuman species.</a> Methods in Molecular Biology. 1124, 19-37 (2014).</li><li>Hasenberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+immunomagnetic+negative+enrichment+of+neutrophil+granulocytes+from+murine+bone+marrow+for+functional+studies+in+vitro+and+in+vivo.">Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo.</a> PLoS One. 6 (2), 17314 (2011).</li><li>Calzetti, F., Tamassia, N., Arruda-Silva, F., Gasperini, S., Cassatella, M. 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Los autores declaran que la investigación se realizó en ausencia de cualquier conflicto de intereses.

Debido a la corta vida útil, el estado de diferenciación terminal y el contenido lítico de los neutrófilos, el estudio de estas células siempre ha sido un desafío. Además de utilizar modelos de ratón o células de cohortes de pacientes, las líneas celulares son herramientas útiles para ayudar a estudiar la biología de los neutrófilos16. Sin embargo, las líneas celulares similares a los neutrófilos no pueden reiterar completamente todos los aspectos de la biología de los neutrófilos, lo que agrega una capa adicional de dificultad para estudiar estas células. El modelo in vitro más utilizado es la línea celular HL-60, que se puede diferenciar en células similares a los neutrófilos mediante el tratamiento con dimetilsulfóxido o ácido retinoico17,18. Aunque estas células son útiles en el estudio de la migración y el estallido respiratorio, no son adecuadas para estudiar la actividad microbiocida de los neutrófilos. Existen otras líneas celulares (PLB-98, NB4), y también están asociadas a su conjunto de limitaciones19.
Es fundamental validar con neutrófilos humanos primarios las observaciones realizadas con modelos de enfermedades de ratones y líneas celulares. Los neutrófilos no se pueden criopreservar de manera eficiente y, por lo tanto, a menudo se aíslan recientemente de la sangre total o de las capas buffy obtenidas de los donantes y procesadas de inmediato. Una vez aisladas, las células comienzan a sufrir una forma compleja de muerte espontánea, regulada por oxidación, caspasas citoplasmáticas y proteasas que se encuentran en los gránulos de neutrófilos20,21. Los métodos o técnicas de aislamiento inadecuados pueden conducir a la activación de neutrófilos, lo que solo acelera la desaparición celular. Es imperativo tener un método confiable y consistente para obtener neutrófilos puros y de alta calidad de los donantes. 
Se han publicado muchos métodos sobre el aislamiento de neutrófilos humanos10,22. Se dividen principalmente en dos categorías, con algunas estrategias compartidas. La primera categoría se basa en anticuerpos, ya sea a través de la selección positiva o negativa. La selección positiva marcaría directamente a los neutrófilos, proporcionando así una población celular altamente pura, aunque también conduce a una rápida activación celular, muerte celular, así como al etiquetado no deseado de neutrófilos23. La selección negativa, aunque dejando las células sin etiquetar y dando una población muy pura, aceleró la muerte de neutrófilos, aunque se desconoce el mecanismo preciso(Figura 5). Si la expresión de genes o proteínas también se altera después de una selección positiva o negativa debe investigarse más a fondo. Además, debido a la cantidad de anticuerpos necesarios para agotar los otros tipos de células, estos métodos no pueden producir grandes cantidades de neutrófilos. Sin embargo, los ensayos basados en anticuerpos todavía se pueden utilizar para cultivos y experimentos a corto plazo a menor escala y son métodos de elección para experimentos que requieren una pureza celular muy alta, como los estudios de expresión de genes y proteínas. 
El segundo tipo de método de aislamiento se basa en gradientes y densidades. Por lo general, involucra Percoll, Ficoll-Paque u otros componentes de polisacárido / polivinilpirrolidona y utiliza la fuerza de centrifugación para separar diferentes tipos de células sanguíneas según la densidad celular. Estos métodos a menudo se complementan con la sedimentación de glóbulos rojos por dextrano. Estos métodos pueden manejar escalas más grandes de material de partida y también pueden lograr una alta pureza. Una advertencia del aislamiento basado en la densidad es la separación ineficiente de otros granulocitos mucho menos abundantes (en su mayoría eosinófilos) de los neutrófilos, y es, por lo tanto, la principal limitación del protocolo presentado, ya que incluso la presencia de contaminación de células pequeñas puede afectar la respuesta de neutrófilos24.
Aquí se presenta un método resumido basado en el aislamiento de gradiente, refinando los métodosanteriores10,22. Utilizamos la subestimación actual de las especificidades de los neutrófilos para aislar de manera confiable los neutrófilos humanos puros con plaquetas residuales limitadas y glóbulos rojos, evitando la activación de neutrófilos y la muerte acelerada. El paso más crucial es la estratificación del gradiente, que se obtiene de manera mucho más efectiva al agregar el medio de gradiente de densidad debajo de la sangre para obtener una interfaz nítida. Un examen rápido del anillo PBMC y el gradiente después de la centrifugación puede revelar una posible contaminación, activación y bajos rendimientos. Cuando se trabaja con una membrana de leucoféresis o una capa buffy, diluir la sangre es importante ya que la densidad celular excesiva conduciría a la agregación celular, lo que llevaría a impurezas y activación celular.
Este protocolo debe completarse dentro de las 2 h para garantizar la frescura celular, y los pasos que involucran el medio de gradiente de densidad, el dextrano y la lisis deben realizarse de inmediato, ya que la exposición a estas soluciones puede alterar los neutrófilos. Con este protocolo, el rendimiento esperado de los neutrófilos es de al menos ~ 10 millones / 10 ml de sangre total y al menos ~ 60 millones / 10 ml de pelaje buffy. La evaluación de la calidad del aislamiento debe hacerse de la siguiente manera: los neutrófilos activados deben ser inferiores al 10%, la contaminación de linfocitos inferior al 5%, el eosinófilo mínimo (misma dispersión lateral pero menor población de dispersión hacia adelante) y la viabilidad celular debe ser superior al 90%. La menor pureza puede ser el resultado de capas o almacenamiento inadecuados del medio de gradiente de densidad o debido a la calidad y frescura del producto sanguíneo inicial.

El sistema inmune innato se compone de muchos tipos de células que mantienen la homeostasis inmune y la eliminación de patógenos junto con muchas otras funciones fisiológicas. Los neutrófilos comprenden el mayor grupo de glóbulos blancos en la circulación humana1. La mayoría de los neutrófilos maduros se almacenan en la médula ósea, que es el sitio de generación de nuevos neutrófilos, también llamados granulopoyesis. En la médula ósea, los progenitores de granulocitos salen del ciclo celular y se diferencian terminalmente, adquiriendo sus característicos núcleos y gránulos segmentados2. En condiciones inflamatorias, en respuesta a las quimiocinas, citoquinas y patrones moleculares asociados al daño y a los patógenos, los neutrófilos se movilizan desde el torrente sanguíneo y fuera de la médula ósea para realizar una amplia gama de funciones. Estos incluyen la secreción de citoquinas, la fagocitosis directa del patógeno, la liberación de especies reactivas de oxígeno, la degranulación de proteínas antimicrobianas y la formación de trampas extracelulares de neutrófilos.
Las moléculas utilizadas por los neutrófilos para combatir las infecciones son tóxicas para los microbios y el huésped. Por lo tanto, la vida útil y la eliminación adecuada de los neutrófilos envejecidos / moribundos están altamente regulados, y tienen una vida útil limitada en circulación (<48 h)3. Debido a esta corta supervivencia, el cuerpo humano produce en promedio 100 mil millones de nuevos neutrófilos cada día para mantener la homeostasis de la población4. La granulopoyesis de emergencia puede aumentar aún más la liberación de neutrófilos, tanto maduros como inmaduros, en la sangre durante la inflamación y la infección5. La importancia de los neutrófilos en la respuesta inmune innata es destacada por pacientes con neutropenia adquirida o congénita, que son susceptibles a infecciones bacterianas y fúngicas6.
Muchos desafíos surgen al estudiar la biología de los neutrófilos y su papel en la respuesta inmune debido a su naturaleza, incluida su corta supervivencia y contenido citotóxico. Las líneas celulares similares a los neutrófilos se han diferenciado comúnmente de las células HL-60 de leucemia promielocítica humana y las células PLB-9857,8. Aunque pueden mostrar una morfología similar a la de los neutrófilos y realizar quimiotaxis, estas líneas celulares no pueden recapitular completamente la biología de los neutrófilos. Los ensayos in vitro que utilizan estas líneas celulares tampoco pueden recapitular experimentos in vivo. Además, la diferenciación de estas células necesita ser inducida y podría verse afectada negativamente por la manipulación de genes antes de la diferenciación.
Recientemente, se han desarrollado métodos para eludir estos problemas mediante el uso de promotores inducibles para modular la expresión génica después de la diferenciación en células HL-609. Incluso con tales herramientas, se requieren PMN humanas primarias para validar los objetivos utilizando enfoques farmacológicos. Por lo tanto, es imperativo obtener neutrófilos puros e inactivados aislados de la sangre para validar los hallazgos de la línea celular y los modelos animales. Este trabajo presenta un protocolo de aislamiento de PMN revisado en el que se evaluaron los pros y los contras de los métodos actuales10. Se ideó una combinación que consistía en centrifugación por gradiente para separar las PMN de otras células inmunes, sedimentación corta a base de dextrano para eliminar la mayor parte de los glóbulos rojos, lisis rápida residual de glóbulos rojos a través de la presión osmótica y centrifugación de baja velocidad para eliminar la contaminación plaquetaria.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3% Acetic Acid with Methylene Blue</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#07060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A24858</td>
			<td>FACS analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cd11b-PE</td>
			<td>biolegend</td>
			<td>301305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14-BV421</td>
			<td>biolegend</td>
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			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD193-BV605</td>
			<td>biolegend</td>
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			<td></td>
		</tr>
		<tr>
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			<td>biolegend</td>
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			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3-PerCP</td>
			<td>biolegend</td>
			<td>300326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD41-APC</td>
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			<td>303710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cd45-APC</td>
			<td>biolegend</td>
			<td>103111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD62L-PE</td>
			<td>biolegend</td>
			<td>304802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD66b-FITC</td>
			<td>biolegend</td>
			<td>305103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625101</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>S11150H</td>
			<td>complement inactivation of FBS is recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I</td>
			<td>BD</td>
			<td>556547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks balanced salt solution (-CaCl2), (-MgCl2) (-MgSO4)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td>HBSS without Ca2+/Mg2+ is advised&#160; as they have been shown to lead to neutrohpil activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>#07801</td>
			<td>density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSxpress Whole Blood Neutrophil Isolation Kit, human</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-104-434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>sigma</td>
			<td>71376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure water</td>
			<td>KD medical</td>
			<td>RGF-3410</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats

Los neutrófilos (PMN) son los leucocitos más abundantes en la circulación humana, que oscilan entre el 40 y el 70% del total de leucocitos sanguíneos. Son las primeras células reclutadas en el sitio de la inflamación a través de la extravasación rápida a través de los vasos. Allí, los neutrófilos realizan una serie de funciones para matar patógenos invasores y mediar la señalización inmune. Los neutrófilos recién purificados de la sangre humana son el modelo de elección para el estudio, ya que ninguna línea celular replica completamente las funciones y la biología de la PMN. Sin embargo, los neutrófilos son células de corta duración, diferenciadas terminalmente y son altamente susceptibles a la activación en respuesta a estímulos físicos (temperatura, velocidad de centrifugación) y biológicos (endotoxina, quimioterapia y citoquinas). Por lo tanto, es crucial seguir un método estandarizado, confiable y rápido para obtener células puras y no activadas. Este protocolo presenta un protocolo actualizado que combina la centrifugación por gradiente de densidad, la sedimentación de glóbulos rojos (RBC) y la lisis de RBC para obtener una alta pureza de PMN y minimizar la activación celular. Además, también se discuten los métodos para evaluar la calidad, viabilidad y pureza del aislamiento de neutrófilos.

Cuando se utiliza el gradiente de densidad para purificar neutrófilos, es fundamental que la interfaz entre la sangre y el medio de gradiente de densidad sea lo más nítida posible, y que quede una separación de capas distinta después de la centrifugación (paso 1.4). Después de la lisis de los glóbulos rojos, el tampón debe ser de un rojo claro y no turbio (paso 3.3). Si la preparación está turbia, se puede requerir una segunda ronda de lisis (paso 3), aunque esto puede afectar la supervivencia de los neutrófilos(Figura 1). Después de la lisis, se recomienda la centrifugación a baja velocidad (200 × g)cuando se prioriza la pureza, ya que reduce considerablemente la contaminación plaquetaria. Sin embargo, la centrifugación de alta velocidad (400 × g)aumenta el rendimiento a expensas de la pureza (paso 3.4, Figura 2). Después del aislamiento de neutrófilos, la clasificación celular activada por fluorescencia se puede utilizar para evaluar la pureza del aislamiento (paso 4.1) y debe elegirse sobre microscopía. Aunque la distribución FSC/SSC de las células por sí sola proporciona una estimación de la calidad del aislamiento celular(Figura 3A),se debe preferir el uso de marcadores celulares específicos. En este caso, las poblaciones celulares contaminantes más comunes se tiñen con anticuerpos específicos junto con CD66b, expresados específicamente en granulocitos. La tinción de CD45 se utiliza para distinguir leucocitos (CD45+) y glóbulos rojos y plaquetas (CD45-).
Otros contaminantes incluyen linfocitos (CD3+ o CD19+, Figura 3F),monocitos (CD14+, Figura 3D)y eosinófilos (CD193+, Figura 3G). CD11b es una integrina expresada en el linaje mieloide; los neutrófilos y monocitos son CD11b+, mientras que los linfocitos son CD11b- (Figura 3C). Como la activación de neutrófilos puede afectar a los experimentos posteriores, se debe evaluar la expresión de CD62L; los neutrófilos se convierten en CD62L- una vez activados (paso 4.1). El péptido fMLP se puede utilizar como control positivo para el desprendimiento de CD62L(Figura 4). También es importante evaluar la salud de los neutrófilos antes de realizar ensayos; los neutrófilos tienen una vida media relativamente corta, y la activación puede acortarla aún más (paso 4.2). Una tinción estándar de Annexina V y PI puede dar información sobre el estado vivo/muerto del cultivo de neutrófilos en momentos designados (Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62837/62837fig01.jpg"> Figura 1: Gradiente de densidad de separación basada en medio de granulocitos. (A) Antes y (B) después de la centrifugación. Tenga en cuenta la interfaz nítida entre la sangre y las capas medias de gradiente de densidad. (C) Sedimentación del pellet en B resuspendido (1:1) en 5% FBS/HBSS y 3% Dextran-0.9% NaCl. (D) Gránulo de PMN después de la lisis de los glóbulos rojos residuales en el sobrenadante de (C) con H2O. Abreviaturas: PBMC = célula mononuclear de sangre periférica; PMN = neutrófilo; RBC = glóbulos rojos; FBS = suero fetal bovino; HBSS = Solución de sal equilibrada de Hank. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62837/62837fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62837/62837fig02.jpg"> Figura 2: Girar a velocidades más bajas después de la lisis de glóbulos rojos disminuyó la contaminación plaquetaria. Después de la lisis de los glóbulos rojos con H2O, las células se hicieron girar hacia abajo a 200 × g (A)o 400 × g (B). Se tiñeron neutrófilos y se realizó un análisis de citometría de flujo, como se describe en la Figura 3,con la adición de anti-CD41 para etiquetar las plaquetas. Abreviaturas: RBC = glóbulo rojo; CD41 = grupo de diferenciación 41; SSC-A = área de dispersión lateral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62837/62837fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62837/62837fig03.jpg"> Figura 3: Evaluación de neutrófilos aislados de la capa buffy. Los neutrófilos aislados se tiñeron con anti-CD66b, anti-CD11b, anti-CD14 y anti-CD193 siguiendo un protocolo estándar. Las células individuales (B) fueron cerradas de las celdas totales (A). (C) Las células CD11b+ fueron cerradas de células individuales. (D) Diagrama de puntos que muestra neutrófilos (CD66b+,CD14 bajo/-) y una contaminación por monocitos muy baja (CD66b-, CD14+, Q1). (E) Las células CD66b- y CD66b+ fueron cerradas. (F) CD66b- las células fueron positivas para marcadores de linfocitos (CD3, CD19). (G) Expresión de CD11b y CD193 en células CD66b+, mostrando distintas poblaciones de neutrófilos (CD66b+, CD11b+, CD193-) y eosinófilos (CD66b+, CD11b-, CD193+). En el resultado representativo que se muestra aquí, la pureza de neutrófilos es de ~ 93% con ~ 3.7% de linfocitos y ~ 3.7% de contaminación de eosinófilos. (H) Cuantificación de la pureza de los neutrófilos después de la purificación. Los datos se compilan a partir de 5 ensayos individuales y se presentan como media ± SD. Abreviaturas: CD = grupo de diferenciación; SSC-A = SSC-A = área de dispersión lateral; FSC-A = área de dispersión hacia adelante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62837/62837fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62837/62837fig04.jpg"> Figura 4: La purificación por gradiente no causó desprendimiento de CD62L. (A-B) Los neutrófilos controlados (A) o estimulados por fMLP (B) (1 mM fMLP durante 15 min a 37 °C) se tiñeron con marcadores de neutrófilos y CD62L. (C) La intensidad media fluorescente para CD62L disminuye en las células tratadas con fMLP, lo que indica desprendimiento de CD62L y activación de neutrófilos. Abreviaturas: CD26L = L-selectina; fMLP = N-Formilmetionil-leucil-fenilalanina; SSC-A = SSC-A = área de dispersión lateral; FSC-A = área de dispersión hacia adelante; PE = ficoeristrina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62837/62837fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62837/62837fig05.jpg"> Figura 5: Muerte espontánea de neutrófilos purificados por gradiente de densidad o kit de aislamiento de neutrófilos. Los neutrófilos fueron purificados con gradiente de densidad (A y B) o microperlas comerciales (C y D) y cultivados durante 0 h (A y C) o 24 h (B y D) en RPMI-10% FCS. Las células se tiñeron utilizando la anexina V y pi en los puntos de tiempo respectivos siguiendo un protocolo estándar. (E) Cuantificación de la muerte espontánea de neutrófilos purificados. n=5, media ± SD. Abreviaturas: SSC-A = SSC-A = área de dispersión lateral; FSC-A = área de dispersión hacia adelante; PI = yoduro de propidio; FCS = suero fetal de ternero; FITC = isotiocianato de fluoresceína; AV5 = Anexo V. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62837/62837fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Isolation of Human Neutrophils from Whole Blood and Buffy Coats

Este protocolo detalla un método para el aislamiento de neutrófilos de sangre total, capas buffy o membranas de leucoféresis, logrando un buen rendimiento, alta pureza y mínima activación celular. Utilizamos la purificación por gradiente, la sedimentación de glóbulos rojos (RBC) y la lisis de RBC para obtener una preparación de neutrófilos de alta calidad / pureza.

Aislamiento de neutrófilos humanos de sangre entera y buffy coats

Neutrophils (PMNs) are the most abundant leukocytes in human circulation, ranging from 40 to 70% of total blood leukocytes. They are the first cells ...

Los neutrófilos son células diferenciadas terminalmente, y actualmente no hay líneas celulares para recapitular completamente la biología de los neutrófilos. Por lo tanto, es necesario obtener neutrófilos puros, inactivados, sanos y frescos para estudiar su biología. Este método de actualización combina gradiente de densidad, sedimentación, lisis suave para obtener una preparación neutrofílica pura.Es fácil de configurar, requiere un equipo simple y poca práctica. El aspecto técnico, como las capas de gradiente, de este método requerirá algo de práctica para dominar, pero una vez que el gradiente se perfecciona, los otros pasos deberían ser muy fáciles. Comience por esterilizar la capa buffy, el embalaje y la campana laminar.Luego agregue 10 mililitros de sangre en un tubo de 50 mililitros. Para diluir la sangre para un limpiador de gradiente, agregue 5% FBS / HBSS y maquille el volumen hasta 35 mililitros. Después de cerrar la tapa, invierta el tubo varias veces para mezclarlo y luego mantenga el tubo boca abajo para obtener el fondo desprovisto de glóbulos rojos.Agregue 10 mililitros del medio de gradiente de densidad directamente debajo de la sangre, asegurando que el medio y la sangre no se mezclen y la interfaz permanezca nítida. Gire el tubo a 400 veces g durante 30 minutos a temperatura ambiente, asegurándose de desactivar el freno. Después de girar, observe el gradiente separado en una capa superior de plasma sérico, un anillo blanco medio de células mononucleares de sangre periférica, una capa media de gradiente de densidad turbia y un gránulo inferior que consiste en una banda de neutrófilos delgada blanca en la parte superior de los glóbulos rojos.Para eliminar el PBMC, emerja la pipeta de succión directamente en la capa de PBMC y aspira por completo mientras la capa de plasma sérico disminuye a medida que se retira el anillo. Raspe el lado del tubo con la pipeta de succión para maximizar la eliminación del PBMC. Retire con cuidado la capa media del gradiente de densidad turbia entre el anillo PBMC y el pellet de neutrófilos/glóbulos rojos.Para la sedimentación de eritrocitos, use una pipeta de 10 mililitros para transferir el pellet de neutrófilos /glóbulos rojos a un tubo limpio. Luego agregue 5% FBS / HBSS a un volumen final de 25 mililitros. Agregue directamente 25 mililitros de la solución precalenada que contiene 3% de dextrano / 0.9% NaCl en agua en el tubo y mezcle suavemente por inversión.Coloque el tubo sobre una superficie nivelada y no vibratoria durante 15 minutos. Después de colocar el tubo de nuevo en la campana, sumerja ligeramente la pipeta en el líquido y recoja aproximadamente 30 mililitros de la capa superior siguiendo la superficie del líquido hacia abajo. Gire el tubo para obtener un pellet rojo sin partículas flotantes en el medio.Para la lisis del rbC residual, aspire suavemente el sobrenadante sin interrumpir el pellet. Agregue 25 milímetros de agua ultrapura estéril directamente en el tubo y mezcle suavemente invirtiendo el tubo durante 28 segundos para lisar el rbC. Luego, agregue inmediatamente 25 mililitros de solución estéril de NaCl al 1.8% preparada en agua en el tubo y devuelva la solución a las condiciones isotónicas mediante una mezcla suave.Gire el tubo a 200 veces g durante tres a cinco minutos con un freno bajo para minimizar la sedimentación de glóbulos rojos y plaquetas con neutrófilos. Para resuspedar el pellet de neutrófilos blancos, agregue directamente el medio de cultivo sobre el pellet, pero no pipete hacia arriba y hacia abajo. A continuación, balancee el tubo horizontalmente de lado a lado para minimizar la activación celular.Si se observa agregación o aglutinamiento celular, filtre la suspensión celular a través de una malla de 70 micrómetros para descartar los neutrófilos agrupados. Para evaluar la calidad de la preparación aislada de neutrófilos, tiñe las células con marcadores específicos para neutrófilos, eosinófilos y un marcador de activación. Después de adquirir 20, 000 células por citometría de flujo, analice la pureza y activación celular utilizando las estrategias de cierre y determine la viabilidad celular utilizando yoduro de anexina V / propidio como se describe en el manuscrito de texto.El gradiente de densidad con una baja velocidad produjo neutrófilos con más pureza, mientras que una alta velocidad resultó en un mayor rendimiento a expensas de la pureza. Utilizando la clasificación celular activada por fluorescencia, la distribución celular por sí sola proporcionó una estimación de la calidad del aislamiento celular, pero se debe preferir el uso de marcadores celulares específicos. Las poblaciones celulares contaminantes identificadas fueron monocitos, linfocitos y eosinófilos.El enorme rendimiento de neutrófilos se logró utilizando este protocolo. Se evaluó la expresión de CD62L. La intensidad fluorescente media para CD62L disminuyó en las células de control positivas, lo que indica desprendimiento de CD62L y activación de neutrófilos.La salud de los neutrófilos debe evaluarse antes de realizar el ensayo, ya que los neutrófilos tienen una vida media relativamente corta y la activación acorta aún más la vida. Después de la purificación de neutrófilos utilizando el gradiente de densidad y microperlas comerciales, las células se cultivaron durante 24 horas y la supervivencia celular se analizó mediante citometría de flujo. La cuantificación de células viables indicó que la purificación del gradiente de densidad resultó en más células viables después de 24 horas que la purificación utilizando un kit.Es importante que los pasos de estratificación y centrifugación del gradiente se realicen lo mejor posible, ya que tendrá un gran impacto en la calidad de la preparación. Se pueden realizar experimentos in vitro y ensayos bioquímicos después de este procedimiento. Además, la selección negativa podría realizarse si se requieren células ultrapuras como en los experimentos de expresión de citoquinas y proteínas.

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