Name: measuring composition of cd95 death-inducing signaling complex and processing of procaspase-8 in this complex
Uploaded: 2021-08-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex at JoVE.com

نعترف بمؤسسة فيلهلم ساندر (2017.008.02)، ومركز الأنظمة الديناميكية (CDS)، الممول من قبل صندوق التنمية الإقليمية الأوروبي (صندوق التنمية الإقليمية الأوروبي) وبرنامج DFG (LA 2386) لدعم عملنا. نشكر كارينا غوتيك لدعمها تجاربنا. نحن نعترف البروفيسور ديرك راينهولد (OvGU، ماغديبورغ) لتوفير لنا الخلايا التائية الأولية.

تم إجراء تجارب الخلايا التائية وفقا للاتفاق الأخلاقي 42502-2-1273 Uni MD.
1. إعداد الخلايا للتجربة
ملاحظة: متوسط عدد الخلايا لهذا التكفير المناعي هو 1 × 107. يجب أن تزرع الخلايا الملتصقة قبل يوم واحد من التجربة بحيث يكون هناك 1 × 107 خلايا في يوم التجربة....

<ol>
	<li>Lavrik, I. N., Krammer, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+CD95/Fas+signaling+at+the+DISC.">Regulation of CD95/Fas signaling at the DISC.</a> Cell Death and Differentiation. 19 (1), 36-41 (2012).</li><li>Krammer, P. H., Arnold, R., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+and+death+in+peripheral+T+cells.">Life and death in peripheral T cells.</a> Nature Reviews Immunology. 7 (7), 532-542 (2007).</li><li>Dickens, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+death+effector+domain+chain+DISC+model+reveals+a+crucial+role+for+caspase-8+chain+assembly+in+mediating+apoptotic+cell+death.">A death effector domain chain DISC model reveals a crucial role for caspase-8 chain assembly in mediating apoptotic cell death.</a> Molecular Cell. 47 (2), 291-305 (2012).</li><li>Fu, T. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+caspase-8+tandem+DED+filament+reveals+assembly+and+regulation+mechanisms+of+the+death-inducing+signaling+complex.">Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex.</a> Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).</li><li>Scaffidi, C., Medema, J. P., Krammer, P. H., Peter, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLICE+is+predominantly+expressed+as+two+functionally+active+isoforms,+caspase-8/a+and+caspase-8/b.">FLICE is predominantly expressed as two functionally active isoforms, caspase-8/a and caspase-8/b.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 26953-26958 (1997).</li><li>Fox, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structural+analysis+of+FADD:Caspase-8+complexes+defines+the+catalytic+dimer+architecture+for+co-ordinated+control+of+cell+fate.">Cryo-EM structural analysis of FADD:Caspase-8 complexes defines the catalytic dimer architecture for co-ordinated control of cell fate.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).</li><li>Schleich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+of+the+CD95+death-inducing+signaling+complex:+experimental+and+modeling+evidence+for+a+death+effector+domain+chain+model.">Stoichiometry of the CD95 death-inducing signaling complex: experimental and modeling evidence for a death effector domain chain model.</a> Molecular Cell. 47 (2), 306-319 (2012).</li><li>Hughes, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+death-inducing+signaling+complex+reveals+a+substrate+switch+that+determines+CD95-mediated+death+or+survival.">Reconstitution of the death-inducing signaling complex reveals a substrate switch that determines CD95-mediated death or survival.</a> Molecular Cell. 35 (3), 265-279 (2009).</li><li>Lavrik, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+active+caspase-8+heterotetramer+is+formed+at+the+CD95+DISC+[2].">The active caspase-8 heterotetramer is formed at the CD95 DISC [2].</a> Cell Death and Differentiation. 10 (1), 144-145 (2003).</li><li>Hoffmann, J. C., Pappa, A., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+C-terminal+cleavage+product+of+procaspase-8,+p30,+defines+an+alternative+pathway+of+procaspase-8+activation.">A new C-terminal cleavage product of procaspase-8, p30, defines an alternative pathway of procaspase-8 activation.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (16), 4431-4440 (2009).</li><li>Golks, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+CAP3+in+CD95+signaling:+New+insights+into+the+mechanism+of+procaspase-8+activation.">The role of CAP3 in CD95 signaling: New insights into the mechanism of procaspase-8 activation.</a> Cell Death and Differentiation. 13 (3), 489-498 (2006).</li><li>Ozt&#252;rk, S., Schleich, K., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+FLICE-like+inhibitory+proteins+(c-FLIPs):+Fine-tuners+of+life+and+death+decisions.">Cellular FLICE-like inhibitory proteins (c-FLIPs): Fine-tuners of life and death decisions.</a> Experimental Cell Research. 318 (11), 1324-1331 (2012).</li><li>Golks, A., Brenner, D., Fritsch, C., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-FLIPR,+a+new+regulator+of+death+receptor-induced+apoptosis.">c-FLIPR, a new regulator of death receptor-induced apoptosis.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 14507-14513 (2005).</li><li>Hughes, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-operative+and+hierarchical+binding+of+c-FLIP+and+caspase-8:+A+unified+model+defines+how+c-FLIP+isoforms+differentially+control+cell+fate.">Co-operative and hierarchical binding of c-FLIP and caspase-8: A unified model defines how c-FLIP isoforms differentially control cell fate.</a> Molecular Cell. 61 (6), 834-849 (2016).</li><li>Hillert, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+and+short+isoforms+of+c-FLIP+act+as+control+checkpoints+of+DED+filament+assembly.">Long and short isoforms of c-FLIP act as control checkpoints of DED filament assembly.</a> Oncogene. 39 (8), 1756-1772 (2020).</li><li>Yu, J. W., Jeffrey, P. D., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+procaspase-8+activation+by+c-FLIPL.">Mechanism of procaspase-8 activation by c-FLIPL.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8169-8174 (2009).</li><li>Micheau, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long+form+of+FLIP+is+an+activator+of+caspase-8+at+the+Fas+death-inducing+signaling+complex.">The long form of FLIP is an activator of caspase-8 at the Fas death-inducing signaling complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 45162-45171 (2002).</li><li>Chang, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-FLIPL+is+a+dual+function+regulator+for+caspase-8+activation+and+CD95-mediated+apoptosis.">C-FLIPL is a dual function regulator for caspase-8 activation and CD95-mediated apoptosis.</a> EMBO Journal. 21 (14), 3704-3714 (2002).</li><li>Hillert, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+DISC+regulation+via+pharmacological+targeting+of+caspase-8/c-FLIPL+heterodimer.">Dissecting DISC regulation via pharmacological targeting of caspase-8/c-FLIPL heterodimer.</a> Cell Death and Differentiation. 27 (7), 2117-2130 (2020).</li><li>Fricker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+dissection+of+CD95+signaling+dynamics+reveals+both+a+pro-+and+antiapoptotic+role+of+c-FLIPL.">Model-based dissection of CD95 signaling dynamics reveals both a pro- and antiapoptotic role of c-FLIPL.</a> Journal of Cell Biology. 190 (3), 377-389 (2010).</li><li>Arndt, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+TCR+activation+kinetics+in+primary+human+T+cells+upon+focal+or+soluble+stimulation.">Analysis of TCR activation kinetics in primary human T cells upon focal or soluble stimulation.</a> Journal of Immunological Methods. 387 (1-2), 276-283 (2013).</li><li>Pietkiewicz, S., Eils, R., Krammer, P. H., Giese, N., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+treatment+of+CD95L+and+gemcitabine+in+pancreatic+cancer+cells+induces+apoptotic+and+RIP1-mediated+necroptotic+cell+death+network.">Combinatorial treatment of CD95L and gemcitabine in pancreatic cancer cells induces apoptotic and RIP1-mediated necroptotic cell death network.</a> Experimental Cell Research. 339 (1), 1-9 (2015).</li><li>Schleich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+DED+chains+at+the+DISC:+regulation+of+procaspase-8+activation+by+short+DED+proteins+c-FLIP+and+procaspase-8+prodomain.">Molecular architecture of the DED chains at the DISC: regulation of procaspase-8 activation by short DED proteins c-FLIP and procaspase-8 prodomain.</a> Cell Death and Differentiation. 23 (4), 681-694 (2016).</li><li>Lavrik, I. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+CD95+threshold+signaling:+Triggering+of+CD95+(FAS/APO-1)+at+low+concentrations+primarily+results+in+survival+signaling.">Analysis of CD95 threshold signaling: Triggering of CD95 (FAS/APO-1) at low concentrations primarily results in survival signaling.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13664-13671 (2007).</li><li>Sprick, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-10+is+recruited+to+and+activated+at+the+native+TRAIL+and+CD95+death-inducing+signalling+complexes+in+a+FADD-dependent+manner+but+can+not+functionally+substitute+caspase-8.">Caspase-10 is recruited to and activated at the native TRAIL and CD95 death-inducing signalling complexes in a FADD-dependent manner but can not functionally substitute caspase-8.</a> EMBO Journal. 21 (17), 4520-4530 (2002).</li><li>Neumann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+within+the+CD95+death-inducing+signaling+complex+decide+life+and+death+of+cells.">Dynamics within the CD95 death-inducing signaling complex decide life and death of cells.</a> Molecular Systems Biology. 6 (1), 352 (2010).</li><li>Kischkel, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity-dependent+APO-1+(Fas/CD95)-associated+proteins+form+a+death-inducing+signaling+complex+(DISC)+with+the+receptor.">Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor.</a> EMBO Journal. 14 (22), 5579-5588 (1995).</li><li>Seyrek, K., Richter, M., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+the+sweet+regulation+of+apoptosis:+the+role+of+glycosylation+and+galectins+in+apoptotic+signaling+pathways.">Decoding the sweet regulation of apoptosis: the role of glycosylation and galectins in apoptotic signaling pathways.</a> Cell Death and Differentiation. 26 (6), 981-993 (2019).</li><li>Kallenberger, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-+and+interdimeric+caspase-8+self-cleavage+controls+strength+and+timing+of+CD95-induced+apoptosis.">Intra- and interdimeric caspase-8 self-cleavage controls strength and timing of CD95-induced apoptosis.</a> Science Signaling. 7 (316), 23 (2014).</li></ol>

وقد وصف هذا النهج في البداية كيشكل وآخرون27 وقد طورته بنجاح منذ ذلك الحين عدة مجموعات. ويتعين النظر في عدة مسائل هامة من أجل كفاءة معالجة الكاسباس -8 في هذا المجمع.
أولا، من الضروري اتباع جميع خطوات الغسيل أثناء التكفير المناعي. أهمية خاصة هي الخطوات النهائية لغس?...

واحدة من مستقبلات الموت الأكثر دراسة (DRs) هو CD95 (Fas, APO-1). يبدأ المسار الأبوبتوتيكي extrinsic مع تفاعل DR مع ليغند cognate لها، أي CD95L يتفاعل مع CD95 أو تريل يربط تريل-Rs. وهذا يؤدي إلى تشكيل القرص في القرص DR. المقابلة يتكون من CD95، FADD، procaspase-8/-10، وC-FLIP البروتينات1،2. وعلاوة على ذلك، يتم تجميع القرص عن طريق التفاعلات بين مجال الموت (DD) التي تحتوي على البروتينات، مثل CD95 و FADD، والبروتينات المحتوية على DED مثل FADD، procaspase-8/-10، وc-FLIP (الشكل 1). Procaspase-8 يخضع لoligomerization عن طريق جمعية من DEDs لها، مما أدى إلى تشكيل خيوط DED، تليها تنشيط procaspase-8 وتجهيزها. وهذا يؤدي إلى سلسلة كاسباس، مما يؤدي إلى موت الخلية (الشكل 1)3،4. وهكذا، procaspase-8 هو caspase البادئ المركزي للمسار الخلايا المبرمج extrinsic بوساطة CD95 أو تريل-Rs، تفعيلها في منصة الجزيئية الكلية المقابلة، القرص.
اثنين من isoforms من procaspase -8 ، وهي procaspase - 8a (p55) و -8b (p53) ، ومن المعروف أن يتم تجنيدهم في القرص5. كلا isoforms تتألف من اثنين من DEDs. يقع DED1 و DED2 في الجزء N-terminal من procaspase-8a/b متبوعا بنطاقي p18 و p10 الحفازين. كشف التحليل التفصيلي المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) ل procaspase-8 DEDs عن تجميع بروتينات procaspase-8 في هياكل خيوط تسمى خيوط DED4،6. ومن اللافت للنظر أن سلاسل procaspase-8 الخطية اقترحت في البداية للمشاركة في التعتيم يليه تنشيط procaspase-8 في DISC. الآن، ومن المعروف أن تلك السلاسل ليست سوى بنية فرعية من خيوط بروكاسباس-8 DED، وهذا الأخير يتألف من ثلاث سلاسل تجميعها في الحلزون الثلاثي3،4،6،7.
عند التعتيم في خيوط DED ، تؤدي التغييرات التشكيلية في procaspase-8a /b إلى تشكيل المركز النشط للبروكاسباس -8 وتفعيله3،8. ويتبع ذلك معالجة procaspase-8 ، والتي يتم التوسط فيها عبر مسارين: الأول يمر عبر توليد منتج شق p43/p41 والثاني عبر الجيل الأولي من منتج الانقسام p30. يبدأ مسار p43/p41 من خلال انشقاق procaspase-8a/b في Asp374 ، مما أدى إلى منتجات الانقسام p43/p41 و p12 (الشكل 2). وعلاوة على ذلك، يتم قطع هذه الشظايا تلقائيا بشكل تحفيزي في Asp384 و Asp210/216، مما أدى إلى تشكيل التروتروترمر caspase-8 النشط، p102/p1829،10،11. وبالإضافة إلى ذلك، تبين أنه بالتوازي مع مسار p43/p41 للمعالجة، procaspase-8a/b هو أيضا مشقوق في Asp216، مما يؤدي إلى تشكيل المنتج C-محطة الانقسام p30، تليها بروتيوليسيس إلى p10 و P1810 (الشكل 2).
Procaspase-8a/b التنشيط في خيوط DED ينظم بدقة من قبل البروتينات المسماة c-FLIPs12. تحدث بروتينات c-FLIP في ثلاثة أشكال متساوية: c-FLIPLong (c-FLIPL)،c-FLIPShort (c-FLIPS)،وc-FLIPRaji (c-FLIPR). تحتوي جميع الأشكال الثلاثة على اثنين من DEDs في منطقة N-terminal الخاصة بهم. ج-فليبL أيضا C-محطة نشطة بشكل حفاز caspase مثل المجال12,13. كل isoforms قصيرة من C-FLIP-C-FLIPS و C-FLIPR-العملبطريقة مضادة للapoptotic عن طريق تعطيل تشكيل خيوط DED في القرص6,14,15. وبالإضافة إلى ذلك، C-FLIPL يمكن تنظيم caspase-8 التنشيط بطريقة تعتمد على التركيز. وهذا يمكن أن يؤدي إلى كل من الموالية ومكافحة apoptotic آثار16,17,18. من خلال تشكيل procaspase-8/c-FLIPL heterodimer النشطة تحفيزيا، c-FLIPL يؤدي إلى استقرار المركز النشط من procaspase-8 وتفعيله. تعتمد الدالة المؤيدة أو المضادة للأبوبتوتيك ل c-FLIPL بشكل مباشر على مقدارها في خيوط DED والمبلغ اللاحق من procaspase-8/c-FLIPL heterodimers19. تركيزات منخفضة أو متوسطة من C-FLIPL في DISC يؤدي إلى كميات كافية من التروديمرات procaspase-8/c-FLIPL في خيوط DED، والتي تدعم تنشيط caspase-8. في المقابل، زيادة كميات C-FLIPL يؤدي مباشرة إلى آثارها المضادة لل أبوتوبوتيك في القرص20.
معا، وتنشيط وتجهيز procaspase-8a/b في القرص هو عملية منظمة للغاية تنطوي على عدة خطوات. تناقش هذه الورقة قياس معالجة procaspase-8 مباشرة في DISC بالإضافة إلى تحليل تكوين هذا المجمع. وسيتم تقديم هذا باستخدام CD95 DISC كمجمع DR المثالي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12.5% SDS gel</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td>for two separating gels: 
			3.28 mL distilled H2O 
			2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 
			4.06 mL acrylamide 
			100 &#181;L 10% SDS 
			100 &#181;L 10% APS 
			7.5 &#181;L TEMED 
			 
			for two collecting gels: 
			3.1 mL distilled H2O 
			1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 
			0.5 mL acrylamide 
			50 &#181;L 10% SDS 
			25 &#181;L 10% APS 
			7.5 &#181;L TEMED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14.5 cm cell dishes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>639160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acrylamide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A124.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-actin Ab</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2103</td>
			<td>dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-APO-1 Ab</td>
			<td>provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo</td>
			<td>ALX-805-038-C100</td>
			<td>used only for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-caspase-10 Ab</td>
			<td>Biozol</td>
			<td>MBL-M059-3</td>
			<td>dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-caspase-3 Ab</td>
			<td>cell signaling</td>
			<td>9662 S</td>
			<td>dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-caspase-8 Ab C15</td>
			<td>provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO</td>
			<td>ALX-804-242-C100</td>
			<td>dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD95 Ab</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-715</td>
			<td>dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-c-FLIP NF6 Ab</td>
			<td>provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO</td>
			<td>ALX-804-961-0100</td>
			<td>dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FADD 1C4 Ab</td>
			<td>provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO</td>
			<td>ADI-AAM-212-E</td>
			<td>dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PARP Ab</td>
			<td>cell signaling</td>
			<td>9542</td>
			<td>dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9592.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4227.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford solution 
			Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>used according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD95L</td>
			<td>provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO</td>
			<td>ALX-522-020-C005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chemoluminescence detector 
			Chem Doc XRS+</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11 836 145 001</td>
			<td>prepared according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10x) w/o Ca, Mg</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-53500</td>
			<td>dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eletrophoresis buffer</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td>10x electrophoresis buffer: 
			60.6 g Tris 
			288 g glycine 
			20 g SDS 
			ad 2 L H2O 
			1:10 dilution before usage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3908.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG1 HRP</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>1070-05</td>
			<td>dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG2b</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>1090-05</td>
			<td>dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG-HRP</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>4030-05</td>
			<td>dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin-2 Human(hIL-2)</td>
			<td>Merckgroup/ Roche</td>
			<td>11011456001</td>
			<td>for activation of T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3904.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>loading buffer 
			4x Laemmli Sample Buffer,10 mL</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0747</td>
			<td>prepared according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminata Forte Western HRP substrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBLUFO500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysis buffer</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td>13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 
			27.5 mL NaCl; 5 M 
			10 mL EDTA; 2 mM 
			100 mL Triton X-100 
			add 960 mL H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine,&#160; 2,438 g/L</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-41154</td>
			<td>adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medium for primary T cells</td>
			<td>gibco by Life Technologie</td>
			<td>21875034</td>
			<td>adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>milk powder</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T145.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P030.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3957.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td>20x PBST: 
			230 g NaCl 
			8 g KCl 
			56.8 g Na2HPO4 
			8 g KH2PO4 
			20 mL Tween-20 
			ad 2 L H2O 
			dilution 1:20 before usage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST + 5% milk</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td>50 g milk powder + 1 L PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R30852801</td>
			<td>for actavation of T ells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pac HC</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Standard All Blue</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0373</td>
			<td>use between 3-5 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A Sepharose CL-4B beads</td>
			<td>Novodirect/ Th.Geyer</td>
			<td>GE 17-0780-01</td>
			<td>affinity resin beads prepared according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scraper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4360.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shaker</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K305.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>170-4270</td>
			<td>used according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>10026938</td>
			<td>prepared according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>170-4270</td>
			<td>used according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot-Turbo</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Chem Solute</td>
			<td>8,08,51,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3051.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Pan Reac Appli Chem</td>
			<td>A4974,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring composition of cd95 death-inducing signaling complex and processing of procaspase-8 in this complex

يتم التوسط في موت الخلايا المبرمج ال extrinsic عن طريق تنشيط مستقبلات الموت (DRs) مثل CD95/Fas/APO-1 أو الليغاند المسبب لداء موت الخلايا المبرمج المرتبط بعامل الورم (TRAIL) - مستقبلات 1/مستقبلات 2 (TRAIL-R1/R2). تحفيز هذه المستقبلات مع ليغاندس cognate يؤدي إلى تجميع مجمع الإشارات المسببة للموت (DISC). القرص يتكون DR، البروتين المحول Fas المرتبطة مع مجال الموت (FADD)، procaspases-8/-10، والخلوية مثل FADD interleukin (IL) -1β تحويل البروتينات المثبطة للإنزيم (c-FLIPs). القرص بمثابة منصة لمعالجة procaspase -8 والتنشيط. يحدث هذا الأخير عن طريق التعتيم / oligomerization في مجال تأثير الموت (DED) خيوط تجميعها في القرص. 
ويتبع تنشيط procaspase-8 معالجتها، والذي يحدث في عدة خطوات. في هذا العمل ، يتم وصف سير عمل تجريبي ثابت يسمح بقياس تكوين DISC ومعالجة procaspase-8 في هذا المجمع. ويستند سير العمل على تقنيات التكفير المناعي المدعومة بتحليل البقع الغربية. هذا سير العمل يسمح رصد دقيق لخطوات مختلفة من procaspase-8 التوظيف إلى القرص ومعالجتها، وهي ذات صلة عالية للتحقيق في الآليات الجزيئية للخلايا المبرمج extrinsic.

لتحليل caspase -8 التوظيف إلى القرص ومعالجتها في القرص CD95 ، هذه الورقة يصف سير العمل الكلاسيكية ، الذي يجمع بين الملكية الفكرية للقرص CD95 مع تحليل لطخة الغربية. وهذا يسمح للكشف عن العديد من السمات الرئيسية لتفعيل caspase-8 في DISC: تجميع منصة caspase-8-activating الجزيئية، وتجنيد procaspase-8 إلى القرص، ومعالجة هذا c...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex at JoVE.com

Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex

هنا، يتم تقديم سير عمل تجريبي يمكن من الكشف عن معالجة caspase-8 مباشرة في مجمع الإشارات المسببة للوفاة (DISC) ويحدد تكوين هذا المجمع. هذه المنهجية لها تطبيقات واسعة النطاق، من كشف الآليات الجزيئية لمسارات موت الخلايا إلى النمذجة الديناميكية لشبكات موت الخلايا المبرمج.

قياس تكوين CD95 الموت المسببة للإشارات المعقدة ومعالجة Procaspase-8 في هذا المجمع

Extrinsic apoptosis is mediated by the activation of death receptors (DRs) such as CD95/Fas/APO-1 or tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ...

يتم التوسط بدء موت الخلايا المبرمج عن طريق تفعيل caspases في منصات الجزيئية علامة. نقدم الكشف عن القرص مفتاح بدء موت الخلية المعقدة، والتي هي بمثابة منصة لتفعيل caspase-8. ميزة هذه التقنية هي أنها تسمح بالكشف عن التجميع وتكوين مجمع DISC إلى جانب توفير معلومات حول معالجة caspase-8 في هذا المجمع.ابدأ التجربة مع الخلايا التي تتراوح نسبة التقاءها بين 80٪ و90٪، مع الالتزام بالطبق. تجاهل المتوسط وإضافة وسط جديد إلى الخلايا الملتصقة. ثم تحفيز الخلايا مع تركيز محدد من CD95L عن طريق عقد لوحة في زاوية وماسورة ليغاند في الوسط دون لمس الخلايا الملتصقة.لحصاد الخلايا، ضع طبق الخلية على الجليد. إضافة 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني الباردة لتعليق الخلية وكشط الخلايا المرفقة قبالة لوحة. جمع تعليق الخلية في أنبوب 50 ملليلتر.غسل طبق الخلية مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني الباردة مرتين وإضافة محلول الغسيل في نفس أنبوب 50 ملليلتر. ثم طرد تعليق الخلية في 500 مرة G لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية. بعد التخلص من supernatant، resuspend بيليه الخلية في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني الباردة.ثم نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 1.5 ملليلتر. الطرد المركزي تعليق الخلية وإعادة إنفاق بيليه الخلية في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني الباردة مرة أخرى. كرر الطرد المركزي مرة أخرى، ثم إعادة تثبيت بيليه الخلية في ملليلتر واحد من العازلة تحلل واحتضانه لمدة 30 دقيقة على الجليد.بعد الحضانة، والطرد المركزي lysate في أقصى سرعة لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية، ثم نقل supernatant إلى أنبوب نظيف. تجاهل بيليه وجمع عينة 50 ميكرولتر من الليستر في أنبوب آخر لتحديد تركيز البروتين. لprecipitation المناعي، إضافة اثنين من microliters من الأجسام المضادة المضادة APO1 و 10 ميكرولتر من البروتين المعدة حبات سيفاروز إلى الليست.إضافة 10 ميكرولتر من الخرز وحدها إلى أنبوب منفصل يحتوي على lysate لتكون بمثابة عنصر تحكم حبة. احتضان الخليط الذي يحتوي على الليسات والأجسام المضادة، وخرز البروتين A Sepharose بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية مع خلط لطيف. في اليوم التالي، طرد مركزي الخليط في 500 مرة G لمدة أربع دقائق في أربع درجات مئوية.بعد التخلص من supernatant، وغسل الخرز عن طريق إضافة ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني الباردة والتخلص من supernatant بعد الطرد المركزي. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات على الأقل. بعد التخلص من غسل برنامج تلفزيوني الماضي، يستنشق الخرز ويفضل مع حقنة هاملتون 50 ميكرولتر.لتنفيذ لطخة الغربية، إضافة 20 ميكرولتر من العازلة تحميل 4X إلى الخرز والحرارة في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. في وقت واحد، تسخين الضوابط lysate في 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. تحميل الlysates، مناعة، ومعيار البروتين على هلام SDS 12.5٪وتشغيل مع الجهد المستمر من 80 فولت.بعد اكتمال تشغيل هلام، نقل البروتينات من هلام SDS إلى غشاء النيتروسليلوز. بعد اكتمال النقل ، ضع الغشاء الملطخ في صندوق واحتضانه لمدة ساعة في محلول الحجب تحت الهياج اللطيف ، ثم اغسل الغشاء ثلاث مرات لمدة خمس دقائق باستخدام PBST. للكشف عن البروتينات، إضافة أول الأجسام المضادة الأولية في التخفيف المشار إليها إلى الغشاء واحتضانه بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية مع التحريض لطيف.في اليوم التالي، اغسل الغشاء بثلاثة يغسل برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق، ثم احتضن الغشاء مع 20 ملليلتر من الأجسام المضادة الثانوية مع اهتزاز لطيف لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. غسل الغشاء ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني مرة أخرى. بعد التخلص من غسل بي بي إس تي الأخير، أضف ما يقرب من ملليلتر واحد من ركيزة البيروكسيديداز الفجل إلى الغشاء وكشف إشارة الإضاءة الكيميائية.أدى تحفيز خلايا HeLa-CD95 لسرطان عنق الرحم مع CD95L إلى مستوى عال من تكوين CD95 DISC الذي تم رصده عن طريق التكفير المناعي CD95. CD95، FADD، procaspase-8، بروكاسباس-10، وC-FLIPS لوحظت في هذه التخصصات المناعية CD95 تشير إلى تشكيل القرص كفاءة. تم الكشف عن منتجات الانقسام من p43-FLIP و p22-FLIP في التخصصات المناعية، مما يشير إلى تنشيط caspase-8.HeLa-CD95 الخلايا التي عبر عن c-FLIP طويلة استخدمت لتحليل تشكيل القرص CD95. على غرار خلايا HeLa-CD95 الأبوية ، لم يتم الكشف عن أي تجنيد لبروتينات FADD و procaspase-9 و procaspase-10 و c-FLIP و PARP1 في النسيب المناعي من هذه الخلايا دون علاج CD95L. وتميزت الخلايا التائية الأولية المنشطة بمستويات عالية من CD95، و FADD، و procaspase-8، و procaspase-10، و c-FLIPS في البروكابات المناعية المضادة لل CD95.تسمح هذه التقنية بتحليل تكوين القرص الجزيئي ، بما في ذلك معالجة caspase-8 في DISC. جميع خطوات الغسيل مهمة جدا. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن تؤخذ نقاط التحفيز وأوقات الحضانة على محمل الجد.هذه هي الطريقة الوحيدة لقياس التجميع على مجمع القرص. ومع ذلك، لقياس تنشيط caspase-8، يمكن للمرء أيضا تنفيذ كاسباس-8 عمليات قياس النشاط. سمح لنا هذا النهج بالحصول على رؤى جديدة حول بدء موت الخلايا المبرمج.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

البروتين مجمع القبض على الانجذاب من خلايا الثدييات Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

طريقة لقياس التمثيل الغذائي في التصنيف القطعان المجتمعات خلية مجمع عن طريق مستقر النظائر للبحث عن المفقودين

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

إعداد العملاق الحويصلات تغليف المجهرية بواسطة الطرد المركزي من مستحلب الماء في الزيت

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

قياس إشارة مستقبلات G- البروتينات عبر الملزمة غتب المسمى راديو

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

A الخميرة تعديل واحد نظام هجين ل هيتيروميريك البروتين مجمع دنا التفاعل الدراسات

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

وصف SP0092 الركيزة-ملزمة-بروتين النقل الكربوهيدرات البيوكيميائية والهيكلية

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

تحليل توبرينتينج "الترجمة بدء تشكيل معقدة" في مرناس الثدييات

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

الفحص الاستراتيجي وتوصيف مجمع إشارات البروتين البصرية GPCR-mini-G للتبلور الناجح

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

التبلور والتصميم الهيكلي للانزيم: مجمع الركيزة بواسطة البلورات التسلسلية في رقاقة Microfluidic متعددة الاستخدامات

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads

استكمال نشاط الربط بواسطة Galectin-3 - U1 SnRNP مجمع على الخرز

Classic depletion-reconstitution experiments indicate that galectin-3 is a required splicing factor in nuclear extracts. The mechanism of incorporation of ...