Name: measuring composition of cd95 death-inducing signaling complex and processing of procaspase-8 in this complex
Uploaded: 2021-08-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex at JoVE.com

Vi anerkender Wilhelm Sander-Foundation (2017.008.02), Center of Dynamic Systems (CDS), finansieret af EU-programmet EFRU (Den Europæiske Fond for Regionaludvikling) og DFG (LA 2386) for at støtte vores arbejde. Vi takker Karina Guttek for at støtte vores eksperimenter. Vi anerkender Prof. Dirk Reinhold (OvGU, Magdeburg) for at give os primære T-celler.

T celle eksperimenter blev udført i henhold til den etiske aftale 42502-2-1273 Uni MD.
1. Forberedelse af celler til eksperimentet
BEMÆRK: Det gennemsnitlige antal celler til denne immunprecipitation er 1 × 107. Klæbende celler skal sås en dag før eksperimentet, så der er 1 × 107 celler på dagen for eksperimentet.
<ol><li>Forberedelse af klæbeceller til eksperimentet<ol>
<li>Frø 5-8 × 106 klæbende celler i ...

<ol>
	<li>Lavrik, I. N., Krammer, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+CD95/Fas+signaling+at+the+DISC.">Regulation of CD95/Fas signaling at the DISC.</a> Cell Death and Differentiation. 19 (1), 36-41 (2012).</li><li>Krammer, P. H., Arnold, R., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+and+death+in+peripheral+T+cells.">Life and death in peripheral T cells.</a> Nature Reviews Immunology. 7 (7), 532-542 (2007).</li><li>Dickens, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+death+effector+domain+chain+DISC+model+reveals+a+crucial+role+for+caspase-8+chain+assembly+in+mediating+apoptotic+cell+death.">A death effector domain chain DISC model reveals a crucial role for caspase-8 chain assembly in mediating apoptotic cell death.</a> Molecular Cell. 47 (2), 291-305 (2012).</li><li>Fu, T. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+caspase-8+tandem+DED+filament+reveals+assembly+and+regulation+mechanisms+of+the+death-inducing+signaling+complex.">Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex.</a> Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).</li><li>Scaffidi, C., Medema, J. P., Krammer, P. H., Peter, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLICE+is+predominantly+expressed+as+two+functionally+active+isoforms,+caspase-8/a+and+caspase-8/b.">FLICE is predominantly expressed as two functionally active isoforms, caspase-8/a and caspase-8/b.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 26953-26958 (1997).</li><li>Fox, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structural+analysis+of+FADD:Caspase-8+complexes+defines+the+catalytic+dimer+architecture+for+co-ordinated+control+of+cell+fate.">Cryo-EM structural analysis of FADD:Caspase-8 complexes defines the catalytic dimer architecture for co-ordinated control of cell fate.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).</li><li>Schleich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+of+the+CD95+death-inducing+signaling+complex:+experimental+and+modeling+evidence+for+a+death+effector+domain+chain+model.">Stoichiometry of the CD95 death-inducing signaling complex: experimental and modeling evidence for a death effector domain chain model.</a> Molecular Cell. 47 (2), 306-319 (2012).</li><li>Hughes, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+death-inducing+signaling+complex+reveals+a+substrate+switch+that+determines+CD95-mediated+death+or+survival.">Reconstitution of the death-inducing signaling complex reveals a substrate switch that determines CD95-mediated death or survival.</a> Molecular Cell. 35 (3), 265-279 (2009).</li><li>Lavrik, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+active+caspase-8+heterotetramer+is+formed+at+the+CD95+DISC+[2].">The active caspase-8 heterotetramer is formed at the CD95 DISC [2].</a> Cell Death and Differentiation. 10 (1), 144-145 (2003).</li><li>Hoffmann, J. C., Pappa, A., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+C-terminal+cleavage+product+of+procaspase-8,+p30,+defines+an+alternative+pathway+of+procaspase-8+activation.">A new C-terminal cleavage product of procaspase-8, p30, defines an alternative pathway of procaspase-8 activation.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (16), 4431-4440 (2009).</li><li>Golks, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+CAP3+in+CD95+signaling:+New+insights+into+the+mechanism+of+procaspase-8+activation.">The role of CAP3 in CD95 signaling: New insights into the mechanism of procaspase-8 activation.</a> Cell Death and Differentiation. 13 (3), 489-498 (2006).</li><li>Ozt&#252;rk, S., Schleich, K., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+FLICE-like+inhibitory+proteins+(c-FLIPs):+Fine-tuners+of+life+and+death+decisions.">Cellular FLICE-like inhibitory proteins (c-FLIPs): Fine-tuners of life and death decisions.</a> Experimental Cell Research. 318 (11), 1324-1331 (2012).</li><li>Golks, A., Brenner, D., Fritsch, C., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-FLIPR,+a+new+regulator+of+death+receptor-induced+apoptosis.">c-FLIPR, a new regulator of death receptor-induced apoptosis.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 14507-14513 (2005).</li><li>Hughes, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-operative+and+hierarchical+binding+of+c-FLIP+and+caspase-8:+A+unified+model+defines+how+c-FLIP+isoforms+differentially+control+cell+fate.">Co-operative and hierarchical binding of c-FLIP and caspase-8: A unified model defines how c-FLIP isoforms differentially control cell fate.</a> Molecular Cell. 61 (6), 834-849 (2016).</li><li>Hillert, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+and+short+isoforms+of+c-FLIP+act+as+control+checkpoints+of+DED+filament+assembly.">Long and short isoforms of c-FLIP act as control checkpoints of DED filament assembly.</a> Oncogene. 39 (8), 1756-1772 (2020).</li><li>Yu, J. W., Jeffrey, P. D., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+procaspase-8+activation+by+c-FLIPL.">Mechanism of procaspase-8 activation by c-FLIPL.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8169-8174 (2009).</li><li>Micheau, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long+form+of+FLIP+is+an+activator+of+caspase-8+at+the+Fas+death-inducing+signaling+complex.">The long form of FLIP is an activator of caspase-8 at the Fas death-inducing signaling complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 45162-45171 (2002).</li><li>Chang, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-FLIPL+is+a+dual+function+regulator+for+caspase-8+activation+and+CD95-mediated+apoptosis.">C-FLIPL is a dual function regulator for caspase-8 activation and CD95-mediated apoptosis.</a> EMBO Journal. 21 (14), 3704-3714 (2002).</li><li>Hillert, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+DISC+regulation+via+pharmacological+targeting+of+caspase-8/c-FLIPL+heterodimer.">Dissecting DISC regulation via pharmacological targeting of caspase-8/c-FLIPL heterodimer.</a> Cell Death and Differentiation. 27 (7), 2117-2130 (2020).</li><li>Fricker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+dissection+of+CD95+signaling+dynamics+reveals+both+a+pro-+and+antiapoptotic+role+of+c-FLIPL.">Model-based dissection of CD95 signaling dynamics reveals both a pro- and antiapoptotic role of c-FLIPL.</a> Journal of Cell Biology. 190 (3), 377-389 (2010).</li><li>Arndt, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+TCR+activation+kinetics+in+primary+human+T+cells+upon+focal+or+soluble+stimulation.">Analysis of TCR activation kinetics in primary human T cells upon focal or soluble stimulation.</a> Journal of Immunological Methods. 387 (1-2), 276-283 (2013).</li><li>Pietkiewicz, S., Eils, R., Krammer, P. H., Giese, N., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+treatment+of+CD95L+and+gemcitabine+in+pancreatic+cancer+cells+induces+apoptotic+and+RIP1-mediated+necroptotic+cell+death+network.">Combinatorial treatment of CD95L and gemcitabine in pancreatic cancer cells induces apoptotic and RIP1-mediated necroptotic cell death network.</a> Experimental Cell Research. 339 (1), 1-9 (2015).</li><li>Schleich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+DED+chains+at+the+DISC:+regulation+of+procaspase-8+activation+by+short+DED+proteins+c-FLIP+and+procaspase-8+prodomain.">Molecular architecture of the DED chains at the DISC: regulation of procaspase-8 activation by short DED proteins c-FLIP and procaspase-8 prodomain.</a> Cell Death and Differentiation. 23 (4), 681-694 (2016).</li><li>Lavrik, I. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+CD95+threshold+signaling:+Triggering+of+CD95+(FAS/APO-1)+at+low+concentrations+primarily+results+in+survival+signaling.">Analysis of CD95 threshold signaling: Triggering of CD95 (FAS/APO-1) at low concentrations primarily results in survival signaling.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13664-13671 (2007).</li><li>Sprick, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-10+is+recruited+to+and+activated+at+the+native+TRAIL+and+CD95+death-inducing+signalling+complexes+in+a+FADD-dependent+manner+but+can+not+functionally+substitute+caspase-8.">Caspase-10 is recruited to and activated at the native TRAIL and CD95 death-inducing signalling complexes in a FADD-dependent manner but can not functionally substitute caspase-8.</a> EMBO Journal. 21 (17), 4520-4530 (2002).</li><li>Neumann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+within+the+CD95+death-inducing+signaling+complex+decide+life+and+death+of+cells.">Dynamics within the CD95 death-inducing signaling complex decide life and death of cells.</a> Molecular Systems Biology. 6 (1), 352 (2010).</li><li>Kischkel, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity-dependent+APO-1+(Fas/CD95)-associated+proteins+form+a+death-inducing+signaling+complex+(DISC)+with+the+receptor.">Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor.</a> EMBO Journal. 14 (22), 5579-5588 (1995).</li><li>Seyrek, K., Richter, M., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+the+sweet+regulation+of+apoptosis:+the+role+of+glycosylation+and+galectins+in+apoptotic+signaling+pathways.">Decoding the sweet regulation of apoptosis: the role of glycosylation and galectins in apoptotic signaling pathways.</a> Cell Death and Differentiation. 26 (6), 981-993 (2019).</li><li>Kallenberger, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-+and+interdimeric+caspase-8+self-cleavage+controls+strength+and+timing+of+CD95-induced+apoptosis.">Intra- and interdimeric caspase-8 self-cleavage controls strength and timing of CD95-induced apoptosis.</a> Science Signaling. 7 (316), 23 (2014).</li></ol>

Denne fremgangsmåde blev først beskrevet af Kischkel et al.27 og er med succes blevet udviklet siden da af flere grupper. Flere vigtige spørgsmål skal overvejes for effektiv DISC-immunprecipitation og overvågning caspase-8 behandling i dette kompleks.
For det første er det vigtigt at følge alle vasketrin under immunprecipitation. Særligt vigtigt er de sidste vasketrin af sepharose perler og tørring af sepharose perler. Dette skal gøres korrekt for at øge sign...

En af de bedst studerede død receptorer (DRs) er CD95 (Fas, APO-1). Den ydre apoptotiske vej starter med DR's interaktion med dens cognate ligand, dvs. CD95L interagerer med CD95 eller TRAIL binder sig til TRAIL-Rs. Dette resulterer i dannelsen af DISC på den tilsvarende DR. DISC består af CD95, FADD, procaspase-8/-10, og c-FLIP proteiner1,2. Desuden samles DISC'en ved interaktioner mellem dødsdomæne (DD)-holdige proteiner, såsom CD95 og FADD, og DED-holdige proteiner som FADD, procaspase-8/-10 og c-FLIP (Figur 1). Procaspase-8 gennemgår oligomerisering via sammenslutningen af sine DED'er, hvilket resulterer i dannelsen af DED filamenter, efterfulgt af procaspase-8 aktivering og behandling. Dette udløser en caspase kaskade, som fører til celledød (Figur 1)3,4. Procaspase-8 er således en central initiator caspase af den ydre apoptosevej, der er medieret af CD95 eller TRAIL-R'erne, aktiveret på den tilsvarende makromoekylær platform, DISC.
To isoforme procaspase-8, nemlig procaspase-8a (p55) og -8b (p53), er kendt for at blive rekrutteret til DISC5. Begge isoformer består af to DED'er. DED1 og DED2 er placeret på N-terminal del af procaspase-8a/b efterfulgt af katalytiske p18 og p10 domæner. Detaljeret kryo-elektronmikroskopi (kryo-EM) analyse af procaspase-8 DEDs afslørede samlingen af procaspase-8 proteiner i filamentøse strukturer kaldet DED filamenter4,6. Bemærkelsesværdigt, den lineære procaspase-8 kæder blev oprindeligt foreslået at være involveret i dimerization efterfulgt af procaspase-8 aktivering på DISC. Nu er det kendt, at disse kæder kun er en understruktur af procaspase-8 DED glødetråd, sidstnævnte bestående af tre kæder samlet i en tredobbelt helix3,4,6,7.
Ved dimerisering ved DED-glødetråden fører kropslige ændringer i procaspase-8a/b til dannelsen af det aktive center for procaspase-8 og dets aktivering3,8. Dette efterfølges af procaspase-8 behandling, som medieres via to veje: den første går via generering af et p43/p41 kavalergangsprodukt og det andet via den første generation af et p30 kavalergangsprodukt. P43/p41-stien indledes ved kavalergang af procaspase-8a/b ved Asp374, hvilket resulterer i p43/p41 og p12 kavalergangsprodukter (figur 2). Desuden er disse fragmenter automatisk katalytisk kløvet ved Asp384 og Asp210/216, hvilket giver anledning til dannelsen af den aktive caspase-8 heterotetramer, p102/ p1829,10,11. Derudover blev det påvist, at procaspase-8a/b parallelt med p43/p41-forarbejdningsvejen også spaltes ved Asp216, hvilket fører til dannelsen af C-terminal kavalergangsproduktet p30, efterfulgt af dets proteolyse til p10 og p1810 (figur 2).
Procaspase-8a/b aktivering ved DED glødetråd er strengt reguleret af proteiner ved navn c-FLIPs12. C-FLIP-proteinerne forekommer i tre isoformer: c-FLIPLong (c-FLIPL), c-FLIPShort (c-FLIPS)og c-FLIPRaji (c-FLIPR). Alle tre isoformer indeholder to DED'er i deres N-terminal-område. c-FLIPL har også en C-terminal katalytisk inaktiv caspase-lignende domæne12,13. Både korte isoforme af c-FLIP-c-FLIPS og c-FLIPR-virker på en anti-apoptotisk måde ved at forstyrre DED glødetråd dannelse på DISC6,14,15. Derudover kan c-FLIPL regulere caspase-8 aktivering på en koncentrationsafhængig måde. Dette kan resultere i både pro- og antiapptotiske virkninger16,17,18. Ved at danne den katalytisk aktive procaspase-8/c-FLIPL heterodimer fører c-FLIPL til stabilisering af det aktive centrum af procaspase-8 og dets aktivering. C-FLIPL's pro- eller antiapptotiske funktion afhænger direkte af dens mængde ved DED-filamenter og den efterfølgende mængde samlede procaspase-8/c-FLIP L-heterodimers 19. Lave eller mellemliggende koncentrationer af c-FLIPL ved DISC resulterer i tilstrækkelige mængder procaspase-8/c-FLIP L-heterodimerer ved DED-glødetråden, som understøtter aktiveringen af caspase-8. I modsætning hertil fører øgede mængder c-FLIPL direkte til dets antiapptotiske virkninger på DISC20.
Samlet set er aktivering og behandling af procaspase-8a/b på DISC en stærkt reguleret proces, der involverer flere trin. Dette papir diskuterer måling af procaspase-8 behandling direkte på DISC samt analysen af sammensætningen af dette kompleks. Dette vil blive præsenteret ved hjælp af CD95 DISC som det eksemplariske DR-kompleks.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12.5% SDS gel</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td>for two separating gels: 
			3.28 mL distilled H2O 
			2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 
			4.06 mL acrylamide 
			100 &#181;L 10% SDS 
			100 &#181;L 10% APS 
			7.5 &#181;L TEMED 
			 
			for two collecting gels: 
			3.1 mL distilled H2O 
			1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 
			0.5 mL acrylamide 
			50 &#181;L 10% SDS 
			25 &#181;L 10% APS 
			7.5 &#181;L TEMED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14.5 cm cell dishes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>639160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acrylamide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A124.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-actin Ab</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2103</td>
			<td>dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-APO-1 Ab</td>
			<td>provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo</td>
			<td>ALX-805-038-C100</td>
			<td>used only for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-caspase-10 Ab</td>
			<td>Biozol</td>
			<td>MBL-M059-3</td>
			<td>dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-caspase-3 Ab</td>
			<td>cell signaling</td>
			<td>9662 S</td>
			<td>dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-caspase-8 Ab C15</td>
			<td>provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO</td>
			<td>ALX-804-242-C100</td>
			<td>dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD95 Ab</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-715</td>
			<td>dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-c-FLIP NF6 Ab</td>
			<td>provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO</td>
			<td>ALX-804-961-0100</td>
			<td>dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FADD 1C4 Ab</td>
			<td>provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO</td>
			<td>ADI-AAM-212-E</td>
			<td>dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PARP Ab</td>
			<td>cell signaling</td>
			<td>9542</td>
			<td>dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9592.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4227.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford solution 
			Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>used according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD95L</td>
			<td>provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO</td>
			<td>ALX-522-020-C005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chemoluminescence detector 
			Chem Doc XRS+</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11 836 145 001</td>
			<td>prepared according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10x) w/o Ca, Mg</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-53500</td>
			<td>dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eletrophoresis buffer</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td>10x electrophoresis buffer: 
			60.6 g Tris 
			288 g glycine 
			20 g SDS 
			ad 2 L H2O 
			1:10 dilution before usage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3908.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG1 HRP</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>1070-05</td>
			<td>dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG2b</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>1090-05</td>
			<td>dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG-HRP</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>4030-05</td>
			<td>dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin-2 Human(hIL-2)</td>
			<td>Merckgroup/ Roche</td>
			<td>11011456001</td>
			<td>for activation of T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3904.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>loading buffer 
			4x Laemmli Sample Buffer,10 mL</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0747</td>
			<td>prepared according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminata Forte Western HRP substrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBLUFO500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysis buffer</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td>13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 
			27.5 mL NaCl; 5 M 
			10 mL EDTA; 2 mM 
			100 mL Triton X-100 
			add 960 mL H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine,&#160; 2,438 g/L</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-41154</td>
			<td>adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medium for primary T cells</td>
			<td>gibco by Life Technologie</td>
			<td>21875034</td>
			<td>adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>milk powder</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T145.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P030.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3957.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td>20x PBST: 
			230 g NaCl 
			8 g KCl 
			56.8 g Na2HPO4 
			8 g KH2PO4 
			20 mL Tween-20 
			ad 2 L H2O 
			dilution 1:20 before usage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST + 5% milk</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td>50 g milk powder + 1 L PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R30852801</td>
			<td>for actavation of T ells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pac HC</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Standard All Blue</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0373</td>
			<td>use between 3-5 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A Sepharose CL-4B beads</td>
			<td>Novodirect/ Th.Geyer</td>
			<td>GE 17-0780-01</td>
			<td>affinity resin beads prepared according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scraper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4360.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shaker</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K305.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>170-4270</td>
			<td>used according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>10026938</td>
			<td>prepared according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>170-4270</td>
			<td>used according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot-Turbo</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Chem Solute</td>
			<td>8,08,51,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3051.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Pan Reac Appli Chem</td>
			<td>A4974,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring composition of cd95 death-inducing signaling complex and processing of procaspase-8 in this complex

Ekstrinsisk apoptose medieres ved aktivering af dødsreceptorer (DRs) såsom CD95/Fas/APO-1 eller tumornekrosefaktorrelateret apoptosefremkaldende ligand (TRAIL)-receptor 1/receptor 2 (TRAIL-R1/R2). Stimulering af disse receptorer med deres cognate ligands fører til samlingen af det dødsfremkaldende signalkompleks (DISC). DISC består af DR, adapterproteinet Fas-associeret protein med dødsdomæne (FADD), prokapaser-8/-10 og cellulær FADD-lignende interleukin (IL)-1β-konvertering af enzymhæmningstrumende proteiner (c-FLIPs). DISC fungerer som en platform for procaspase-8 behandling og aktivering. Sidstnævnte sker via sin dimerization /oligomerisering i død effector domæne (DED) filamenter samlet på DISC. 
Aktivering af procaspase-8 efterfølges af dens behandling, som forekommer i flere trin. I dette arbejde beskrives en etableret eksperimentel arbejdsgang, der gør det muligt at måle DISC-dannelse og behandling af procaspase-8 i dette kompleks. Arbejdsgangen er baseret på immunprecipitation teknikker understøttes af vestlige blot analyse. Denne arbejdsgang giver mulighed for omhyggelig overvågning af forskellige trin i procaspase-8 rekruttering til DISC og dens behandling og er yderst relevant for at undersøge molekylære mekanismer af extrinsisk apoptose.

For at analysere caspase-8 rekruttering til DISC og dens behandling på CD95 DISC, dette papir beskriver en klassisk arbejdsgang, som kombinerer IP af CD95 DISC med western blot analyse. Dette gør det muligt at påeskrive flere nøglefunktioner i caspase-8-aktivering på DISC: samling af caspase-8-aktiverende makromolekylær platform, rekruttering af procaspase-8 til DISC og behandling af denne initiator caspase (figur 1 og figur 2). Denne arbejdsgang omfatter ...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex at JoVE.com

Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex

Her præsenteres en eksperimentel arbejdsgang, der muliggør påvisning af caspase-8-behandling direkte ved det dødsfremkaldende signalkompleks (DISC) og bestemmer sammensætningen af dette kompleks. Denne metode har brede anvendelser, fra optrævling af de molekylære mekanismer i celledødsveje til dynamisk modellering af apoptosenetværk.

Måling sammensætning af CD95 Death-inducerende signalering kompleks og behandling af Procaspase-8 i dette kompleks

Extrinsic apoptosis is mediated by the activation of death receptors (DRs) such as CD95/Fas/APO-1 or tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ...

Apoptosis indledning medieres ved aktivering af caspases på markør molekylære platforme. Vi præsenterer påvisning af det centrale indvielsescelledødskompleks DISC, der fungerer som en platform for caspase-8 aktivering. Fordelen ved denne teknik er, at det gør det muligt at detektere samlingen og sammensætningen af DISC-komplekset sammen med at give oplysninger om caspase-8-behandling i dette kompleks.Begynd eksperimentet med celler, der er 80% til 90% sammenløb og klæbende til skålen. Kassér mediet og tilsæt frisk medium til klæbende celler. Derefter stimulere cellerne med den valgte koncentration af CD95L ved at holde pladen i en vinkel og pipetter ligand ind i mediet uden at røre de klæbende celler.For at høste cellerne skal du placere celleskålen på is. Tilsæt 10 milliliter kold PBS til celleaffjedringen og skrab de vedhæftede celler af pladen. Saml celleaffjedringen i et 50 milliliterrør.Vask celleskålen med 10 milliliter kold PBS to gange og tilsæt vaskeopløsningen i det samme 50 milliliterrør. Derefter centrifugere celle suspension på 500 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius. Efter at have kasseret supernatanten skal cellepillen genbruges i en milliliter kold PBS.Overfør derefter celleaffjedringen til et 1,5 milliliterrør. Centrifuge celle suspension og genbruge celle pellet i en milliliter af kold PBS igen. Gentag centrifugeringen igen, og genbrug derefter cellepillen i en milliliter lysisbuffer og inkuber den i 30 minutter på is.Efter inkubation centrifugerer lysatet ved maksimal hastighed i 15 minutter ved fire grader Celsius, og overfør derefter supernatanten til et rent rør. Kassér pelleten, og saml en 50 mikroliterprøve af lysatet i et andet rør til bestemmelse af proteinkoncentrationen. Til immunprecipitation tilsættes to mikroliter anti-APO1 antistof og 10 mikroliter af tilberedt protein A Sepharose perler til lysatet.Tilsæt 10 mikroliter af perlerne alene til et separat rør, der indeholder lysatet til at tjene som en perle kontrol. Inkuber blandingen, der indeholder lysatet, antistofferne og Protein A Sepharose perler natten over ved fire grader Celsius med blid blanding. Den følgende dag centrifugere blandingen ved 500 gange G i fire minutter ved fire grader Celsius.Efter at have kasseret supernatanten vaskes perlerne ved at tilføje en milliliter kold PBS og kassere supernatanten efter centrifugering. Gentag dette trin mindst tre gange. Efter at have kasseret den sidste PBS vask, aspirere perlerne helst med en 50 mikroliter Hamilton sprøjte.For at udføre den vestlige blot skal du tilføje 20 mikroliter af 4X belastningsbuffer til perlerne og varmen ved 95 grader Celsius i 10 minutter. Samtidig opvarmes lysatkontrollerne ved 95 grader Celsius i fem minutter. Læg lysater, immunprecipitanter og en proteinstandard på en 12,5% SDS gel og kør med en konstant spænding på 80 volt.Når gelkørslen er færdig, overføres proteinerne fra SDS-gelen til en nitrocellulosemembran. Når overførslen er færdig, skal du placere den blottede membran i en kasse og inkubere den i en time i blokeringsopløsning under blid omrøring og derefter vaske membranen tre gange i fem minutter med PBST. For at detektere proteinerne tilsættes det første primære antistof ved den angivne fortynding til membranen og inkuberes natten over ved fire grader Celsius med blid agitation.Den næste dag vaskes membranen med tre fem minutters PBST-vasker, og inkuberer derefter membranen med 20 milliliter sekundært antistof med blid rysten i en time ved stuetemperatur. Vask membranen tre gange med PBST igen. Efter at have kasseret den sidste PBST vask, tilsæt ca. en milliliter peberrod peroxidasesubstrat til membranen og detektere kemoluminescenssignalet.Stimulering af livmoderhalskræft HeLa-CD95-celler med CD95L resulterede i et højt niveau af CD95 DISC-dannelse overvåget via CD95 immunprecipitation. CD95, FADD, procaspase-8, procaspase-10 og c-FLIPS blev observeret i disse CD95 immunprecipitationer, der indikerer effektiv DISK-dannelse. Kavalergangsprodukterne af p43-FLIP og p22-FLIP blev påvist i immunprecipitationerne, hvilket indikerer caspase-8 aktivering.HeLa-CD95 celler, der over-express c-FLIP længe blev brugt til analyse af CD95 DISC dannelse. Svarende til forældrenes HeLa-CD95 celler, ingen rekruttering af FADD, procaspase-9, procaspase-10, c-FLIP proteiner, og PARP1 blev påvist i immunprecipitationer fra disse celler uden CD95L behandling. Aktiverede primære T-celler var karakteriseret ved høje niveauer af CD95, FADD, procaspase-8, procaspase-10, og c-FLIPS i anti-CD95 immunprecipitationer.Denne teknik gør det muligt at analysere molekylær DISC dannelse, herunder behandling af caspase-8 på DISC. Alle vasketrin er meget vigtige. Derudover bør stimuleringspunkter og inkubationstider tages alvorligt.Dette er den eneste måde at måle samlingen på DISC-komplekset på. Men for at måle caspase-8 aktivering, kan man også gennemføre caspase-8 aktivitet assays. Denne tilgang gav os mulighed for at få ny indsigt i apoptose indledning.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture fra Cryomilled pattedyrsceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

En metode til måling Metabolisme i Sorteret subpopulationer af Komplekse Cell Fællesskaber Brug stabile isotoper Tracing

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

Fremstilling af Giant vesikler indkapslende mikrosfærer ved centrifugering af en vand-i-olie-emulsion

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Måling af G-proteinkoblet receptorreceptor via radio-mærket GTP-binding

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

Et modificeret gær-et hybrid system til studier af heteromere proteinkompleks-DNA-interaktioner

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biokemiske og strukturel karakterisering af kulhydrat Transport substrat-bindende-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Toeprinting analyse af oversættelse indledningen kompleks dannelse på pattedyr mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Strategisk screening og karakterisering af Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for vellykket krystallisering

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Krystallisering og strukturel bestemmelse af et enzym:Substratkompleks ved seriel krystallografi i en alsidig mikrofluidisk chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads

Komplementering af splejsning aktivitet af en Galectin-3 - U1 snRNP Kompleks på perler

Classic depletion-reconstitution experiments indicate that galectin-3 is a required splicing factor in nuclear extracts. The mechanism of incorporation of ...