Name: measuring composition of cd95 death-inducing signaling complex and processing of procaspase-8 in this complex
Uploaded: 2021-08-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex at JoVE.com

אנו מכירים בקרן וילהלם סנדר (2017.008.02), המרכז למערכות דינמיות (CDS), הממומן על ידי תוכנית האיחוד האירופי ERDF (הקרן האירופית לפיתוח אזורי) ו- DFG (LA 2386) לתמיכה בעבודתנו. אנו מודים לקרינה גוטק על תמיכתה בניסויים שלנו. אנו מודים לפרופ' דירק ריינהולד (OvGU, מגדבורג) על כך שסיפק לנו תאי T ראשוניים.

ניסויים בתאי T בוצעו על פי ההסכם האתי 42502-2-1273 Uni MD.
1. הכנת תאים לניסוי
הערה: המספר הממוצע של תאים עבור אימונופרציפיטציה זו הוא 1 × 107. תאים דבקים צריכים להיות זרע יום אחד לפני הניסוי, כך שיש 1 × 107 תאים ביום הניסוי.
<ol><li>הכנת תאים חסידיים לניסוי<ol>
<...

<ol>
	<li>Lavrik, I. N., Krammer, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+CD95/Fas+signaling+at+the+DISC.">Regulation of CD95/Fas signaling at the DISC.</a> Cell Death and Differentiation. 19 (1), 36-41 (2012).</li><li>Krammer, P. H., Arnold, R., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+and+death+in+peripheral+T+cells.">Life and death in peripheral T cells.</a> Nature Reviews Immunology. 7 (7), 532-542 (2007).</li><li>Dickens, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+death+effector+domain+chain+DISC+model+reveals+a+crucial+role+for+caspase-8+chain+assembly+in+mediating+apoptotic+cell+death.">A death effector domain chain DISC model reveals a crucial role for caspase-8 chain assembly in mediating apoptotic cell death.</a> Molecular Cell. 47 (2), 291-305 (2012).</li><li>Fu, T. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+caspase-8+tandem+DED+filament+reveals+assembly+and+regulation+mechanisms+of+the+death-inducing+signaling+complex.">Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex.</a> Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).</li><li>Scaffidi, C., Medema, J. P., Krammer, P. H., Peter, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLICE+is+predominantly+expressed+as+two+functionally+active+isoforms,+caspase-8/a+and+caspase-8/b.">FLICE is predominantly expressed as two functionally active isoforms, caspase-8/a and caspase-8/b.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 26953-26958 (1997).</li><li>Fox, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structural+analysis+of+FADD:Caspase-8+complexes+defines+the+catalytic+dimer+architecture+for+co-ordinated+control+of+cell+fate.">Cryo-EM structural analysis of FADD:Caspase-8 complexes defines the catalytic dimer architecture for co-ordinated control of cell fate.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).</li><li>Schleich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+of+the+CD95+death-inducing+signaling+complex:+experimental+and+modeling+evidence+for+a+death+effector+domain+chain+model.">Stoichiometry of the CD95 death-inducing signaling complex: experimental and modeling evidence for a death effector domain chain model.</a> Molecular Cell. 47 (2), 306-319 (2012).</li><li>Hughes, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+death-inducing+signaling+complex+reveals+a+substrate+switch+that+determines+CD95-mediated+death+or+survival.">Reconstitution of the death-inducing signaling complex reveals a substrate switch that determines CD95-mediated death or survival.</a> Molecular Cell. 35 (3), 265-279 (2009).</li><li>Lavrik, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+active+caspase-8+heterotetramer+is+formed+at+the+CD95+DISC+[2].">The active caspase-8 heterotetramer is formed at the CD95 DISC [2].</a> Cell Death and Differentiation. 10 (1), 144-145 (2003).</li><li>Hoffmann, J. C., Pappa, A., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+C-terminal+cleavage+product+of+procaspase-8,+p30,+defines+an+alternative+pathway+of+procaspase-8+activation.">A new C-terminal cleavage product of procaspase-8, p30, defines an alternative pathway of procaspase-8 activation.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (16), 4431-4440 (2009).</li><li>Golks, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+CAP3+in+CD95+signaling:+New+insights+into+the+mechanism+of+procaspase-8+activation.">The role of CAP3 in CD95 signaling: New insights into the mechanism of procaspase-8 activation.</a> Cell Death and Differentiation. 13 (3), 489-498 (2006).</li><li>Ozt&#252;rk, S., Schleich, K., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+FLICE-like+inhibitory+proteins+(c-FLIPs):+Fine-tuners+of+life+and+death+decisions.">Cellular FLICE-like inhibitory proteins (c-FLIPs): Fine-tuners of life and death decisions.</a> Experimental Cell Research. 318 (11), 1324-1331 (2012).</li><li>Golks, A., Brenner, D., Fritsch, C., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-FLIPR,+a+new+regulator+of+death+receptor-induced+apoptosis.">c-FLIPR, a new regulator of death receptor-induced apoptosis.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 14507-14513 (2005).</li><li>Hughes, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-operative+and+hierarchical+binding+of+c-FLIP+and+caspase-8:+A+unified+model+defines+how+c-FLIP+isoforms+differentially+control+cell+fate.">Co-operative and hierarchical binding of c-FLIP and caspase-8: A unified model defines how c-FLIP isoforms differentially control cell fate.</a> Molecular Cell. 61 (6), 834-849 (2016).</li><li>Hillert, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+and+short+isoforms+of+c-FLIP+act+as+control+checkpoints+of+DED+filament+assembly.">Long and short isoforms of c-FLIP act as control checkpoints of DED filament assembly.</a> Oncogene. 39 (8), 1756-1772 (2020).</li><li>Yu, J. W., Jeffrey, P. D., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+procaspase-8+activation+by+c-FLIPL.">Mechanism of procaspase-8 activation by c-FLIPL.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8169-8174 (2009).</li><li>Micheau, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long+form+of+FLIP+is+an+activator+of+caspase-8+at+the+Fas+death-inducing+signaling+complex.">The long form of FLIP is an activator of caspase-8 at the Fas death-inducing signaling complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 45162-45171 (2002).</li><li>Chang, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-FLIPL+is+a+dual+function+regulator+for+caspase-8+activation+and+CD95-mediated+apoptosis.">C-FLIPL is a dual function regulator for caspase-8 activation and CD95-mediated apoptosis.</a> EMBO Journal. 21 (14), 3704-3714 (2002).</li><li>Hillert, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+DISC+regulation+via+pharmacological+targeting+of+caspase-8/c-FLIPL+heterodimer.">Dissecting DISC regulation via pharmacological targeting of caspase-8/c-FLIPL heterodimer.</a> Cell Death and Differentiation. 27 (7), 2117-2130 (2020).</li><li>Fricker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+dissection+of+CD95+signaling+dynamics+reveals+both+a+pro-+and+antiapoptotic+role+of+c-FLIPL.">Model-based dissection of CD95 signaling dynamics reveals both a pro- and antiapoptotic role of c-FLIPL.</a> Journal of Cell Biology. 190 (3), 377-389 (2010).</li><li>Arndt, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+TCR+activation+kinetics+in+primary+human+T+cells+upon+focal+or+soluble+stimulation.">Analysis of TCR activation kinetics in primary human T cells upon focal or soluble stimulation.</a> Journal of Immunological Methods. 387 (1-2), 276-283 (2013).</li><li>Pietkiewicz, S., Eils, R., Krammer, P. H., Giese, N., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+treatment+of+CD95L+and+gemcitabine+in+pancreatic+cancer+cells+induces+apoptotic+and+RIP1-mediated+necroptotic+cell+death+network.">Combinatorial treatment of CD95L and gemcitabine in pancreatic cancer cells induces apoptotic and RIP1-mediated necroptotic cell death network.</a> Experimental Cell Research. 339 (1), 1-9 (2015).</li><li>Schleich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+DED+chains+at+the+DISC:+regulation+of+procaspase-8+activation+by+short+DED+proteins+c-FLIP+and+procaspase-8+prodomain.">Molecular architecture of the DED chains at the DISC: regulation of procaspase-8 activation by short DED proteins c-FLIP and procaspase-8 prodomain.</a> Cell Death and Differentiation. 23 (4), 681-694 (2016).</li><li>Lavrik, I. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+CD95+threshold+signaling:+Triggering+of+CD95+(FAS/APO-1)+at+low+concentrations+primarily+results+in+survival+signaling.">Analysis of CD95 threshold signaling: Triggering of CD95 (FAS/APO-1) at low concentrations primarily results in survival signaling.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13664-13671 (2007).</li><li>Sprick, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-10+is+recruited+to+and+activated+at+the+native+TRAIL+and+CD95+death-inducing+signalling+complexes+in+a+FADD-dependent+manner+but+can+not+functionally+substitute+caspase-8.">Caspase-10 is recruited to and activated at the native TRAIL and CD95 death-inducing signalling complexes in a FADD-dependent manner but can not functionally substitute caspase-8.</a> EMBO Journal. 21 (17), 4520-4530 (2002).</li><li>Neumann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+within+the+CD95+death-inducing+signaling+complex+decide+life+and+death+of+cells.">Dynamics within the CD95 death-inducing signaling complex decide life and death of cells.</a> Molecular Systems Biology. 6 (1), 352 (2010).</li><li>Kischkel, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity-dependent+APO-1+(Fas/CD95)-associated+proteins+form+a+death-inducing+signaling+complex+(DISC)+with+the+receptor.">Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor.</a> EMBO Journal. 14 (22), 5579-5588 (1995).</li><li>Seyrek, K., Richter, M., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+the+sweet+regulation+of+apoptosis:+the+role+of+glycosylation+and+galectins+in+apoptotic+signaling+pathways.">Decoding the sweet regulation of apoptosis: the role of glycosylation and galectins in apoptotic signaling pathways.</a> Cell Death and Differentiation. 26 (6), 981-993 (2019).</li><li>Kallenberger, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-+and+interdimeric+caspase-8+self-cleavage+controls+strength+and+timing+of+CD95-induced+apoptosis.">Intra- and interdimeric caspase-8 self-cleavage controls strength and timing of CD95-induced apoptosis.</a> Science Signaling. 7 (316), 23 (2014).</li></ol>

גישה זו תוארה לראשונה על ידי Kischkel ואח'27 ופותחה בהצלחה מאז על ידי מספר קבוצות. מספר נושאים חשובים יש לשקול עבור יעיל דיסק-immunoprecipitation וניטור בעיבוד caspase-8 במתחם זה.
ראשית, זה חיוני כדי לעקוב אחר כל שלבי הכביסה במהלך immunoprecipitation. חשוב במיוחד הם צעדי הכביסה הסופיים של ח?...

אחד קולטני המוות הנחקרים ביותר (DRs) הוא CD95 (פאס, APO-1). המסלול האפופטוטי הקיצוני מתחיל באינטראקציה של ה- DR עם ליגנד הקוגנייט שלו, כלומר, CD95L מקיים אינטראקציה עם CD95 או TRAIL נקשר ל- TRAIL-Rs. התוצאה היא היווצרות הדיסק ב- DR. DISC המתאים מורכב CD95, FADD, פרוקספאז-8/-10, וחלבוני C-FLIP1,2. יתר על כן, הדיסק מורכב על ידי אינטראקציות בין חלבונים המכילים תחום מוות (DD), כגון CD95 ו- FADD, וחלבונים המכילים DED כגון FADD, פרוקספסאז-8/-10 ו- c-FLIP (איור 1). Procaspase-8 עובר אוליגומריזציה באמצעות שיוך של DDs שלה, וכתוצאה מכך היווצרות של חוטי DED, ואחריו הפעלה ועיבוד פרוקספאז-8. הדבר מעורר מפל מפל, מה שמוביל למוות תאי (איור 1)3,4. לכן, procaspase-8 הוא יזם מרכזי caspase של מסלול אפופטוזיס extrinsic בתיווך CD95 או TRAIL-Rs, מופעל בפלטפורמה המקרומולקולרית המתאימה, דיסק.
שני איזופורמים של פרוקספאז-8, כלומר פרוקספאז-8a (p55) ו -8b (p53), ידועים שגויסו ל- DISC5. שני האיזופורמים מורכבים משני מקרים של נזיפה. DED1 ו- DED2 ממוקמים בחלק N-terminal של procaspase-8a/b ואחריו הדומיינים הקטליטיים p18 ו- p10. ניתוח מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית מפורטת (cryo-EM) של ממסמכים מזהים פרוקספצאז-8 גילה את ההרכבה של חלבוני פרוקספאז-8 למבנים חוטיים הנקראים חוטי DED4,6. למרבה הפלא, רשתות הפרוקספסאז-8 הליניאריות הוצעו בתחילה לעסוק בדימרציה ואחריה הפעלת פרוקספסאז-8 בדיסק. עכשיו, זה ידוע כי רשתות אלה הם רק תת מבנה של חוט DED procaspase-8, האחרון מורכב שלוש שרשראות התאספו סליל משולש3,4,6,7.
עם עמעום בסימת DED, שינויים קונפורמציה procaspase-8a/b להוביל להיווצרות של המרכז הפעיל של procaspase-8 והפעלתו3,8. לאחר מכן עיבוד procaspase-8, אשר מתווך באמצעות שני מסלולים: הראשון עובר דרך הדור של מוצר מחשוף p43/p41 והשני באמצעות הדור הראשוני של מוצר מחשוף p30. מסלול p43/p41 הוא ביוזמת מחשוף של פרוקספז-8a/b ב Asp374, וכתוצאה מכך p43/p41 ו p12 מחשוף מוצרים(איור 2). יתר על כן, שברים אלה הם אוטומטית קטליטית בקע ב Asp384 ו Asp210/216, מה שמוליד היווצרות של הטרוטרמר קפסטה פעיל-8, p102/p1829,10,11. בנוסף, הוכח כי במקביל למסלול העיבוד p43/p41, פרוקספז-8a/b מבקע גם ב-Asp216, מה שמוביל להיווצרותו של מוצר המחשוף C-terminal p30, ואחריו הפרוטאוליזה שלו ל-p10 ו-p1810 (איור 2).
הפעלה של פרוקספאז-8a/b בסיבי DED מוסדרת בקפדנות על ידי חלבונים הנקראים c-FLIPs12. חלבוני C-FLIP מופיעים בשלושה איזופורמים: C-FLIPלונג (c-FLIPL),C-FLIPShort (c-FLIPS)ו-C-FLIPRaji (c-FLIPR). כל שלושת האיזופורמים מכילים שני מקרים של פענוחים באזור N-terminal שלהם. c-FLIPL כולל גם תחום דמוי קפטאז12,13. שני האיזופורמים הקצרים של C-FLIP-C-FLIPS ו- c-FLIPR- פועלים באופן אנטי-אפופטוטי על ידי שיבוש היווצרות חוט DED בדיסק6,14,15. בנוסף, c-FLIPL יכול לווסת את הפעלת caspase-8 באופן תלוי ריכוז. זה יכול לגרום הן אפקטים פרו-אנטיאפופטוטיים 16,17,18. על ידי יצירת פרוקספאז פעיל קטליטית-8/c-FLIPL הטרודימר, c-FLIPL מוביל לייצוב של המרכז הפעיל של פרוקספז-8 והפעלתו. הפונקציה pro- או אנטי אפופטוטי של c-FLIPL תלויה ישירות בכמות שלה בסיבי DED ואת הכמות הבאה של procaspase-8/c-FLIPL הטרודימרים19. ריכוזים נמוכים או בינוניים של C-FLIPL בדיסק גורמים לכמויות מספיקות של הטרודימרים פרוקספאז-8/c-FLIPL בסיעת DED, התומכת בהפעלה של caspase-8. לעומת זאת, כמויות מוגברות של c-FLIPL מובילות ישירות להשפעות האנטי-אפופטוטיות שלה בדיסק20.
יחד, ההפעלה ועיבוד של procaspase-8a/b בדיסק הוא תהליך מוסדר מאוד הכולל מספר שלבים. מאמר זה דן במדידת עיבוד procaspase-8 ישירות בדיסק, כמו גם בניתוח הרכב של קומפלקס זה. פעולה זו תוצג באמצעות תקליטור CD95 כמתחם DR למופת.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12.5% SDS gel</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td>for two separating gels: 
			3.28 mL distilled H2O 
			2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 
			4.06 mL acrylamide 
			100 &#181;L 10% SDS 
			100 &#181;L 10% APS 
			7.5 &#181;L TEMED 
			 
			for two collecting gels: 
			3.1 mL distilled H2O 
			1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 
			0.5 mL acrylamide 
			50 &#181;L 10% SDS 
			25 &#181;L 10% APS 
			7.5 &#181;L TEMED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14.5 cm cell dishes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>639160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acrylamide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A124.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-actin Ab</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2103</td>
			<td>dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-APO-1 Ab</td>
			<td>provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo</td>
			<td>ALX-805-038-C100</td>
			<td>used only for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-caspase-10 Ab</td>
			<td>Biozol</td>
			<td>MBL-M059-3</td>
			<td>dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-caspase-3 Ab</td>
			<td>cell signaling</td>
			<td>9662 S</td>
			<td>dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-caspase-8 Ab C15</td>
			<td>provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO</td>
			<td>ALX-804-242-C100</td>
			<td>dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD95 Ab</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-715</td>
			<td>dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-c-FLIP NF6 Ab</td>
			<td>provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO</td>
			<td>ALX-804-961-0100</td>
			<td>dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FADD 1C4 Ab</td>
			<td>provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO</td>
			<td>ADI-AAM-212-E</td>
			<td>dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PARP Ab</td>
			<td>cell signaling</td>
			<td>9542</td>
			<td>dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9592.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4227.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford solution 
			Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>used according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD95L</td>
			<td>provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO</td>
			<td>ALX-522-020-C005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chemoluminescence detector 
			Chem Doc XRS+</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11 836 145 001</td>
			<td>prepared according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10x) w/o Ca, Mg</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-53500</td>
			<td>dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eletrophoresis buffer</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td>10x electrophoresis buffer: 
			60.6 g Tris 
			288 g glycine 
			20 g SDS 
			ad 2 L H2O 
			1:10 dilution before usage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3908.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG1 HRP</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>1070-05</td>
			<td>dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG2b</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>1090-05</td>
			<td>dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG-HRP</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>4030-05</td>
			<td>dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin-2 Human(hIL-2)</td>
			<td>Merckgroup/ Roche</td>
			<td>11011456001</td>
			<td>for activation of T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3904.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>loading buffer 
			4x Laemmli Sample Buffer,10 mL</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0747</td>
			<td>prepared according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminata Forte Western HRP substrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBLUFO500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysis buffer</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td>13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 
			27.5 mL NaCl; 5 M 
			10 mL EDTA; 2 mM 
			100 mL Triton X-100 
			add 960 mL H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine,&#160; 2,438 g/L</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-41154</td>
			<td>adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medium for primary T cells</td>
			<td>gibco by Life Technologie</td>
			<td>21875034</td>
			<td>adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>milk powder</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T145.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P030.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3957.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td>20x PBST: 
			230 g NaCl 
			8 g KCl 
			56.8 g Na2HPO4 
			8 g KH2PO4 
			20 mL Tween-20 
			ad 2 L H2O 
			dilution 1:20 before usage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST + 5% milk</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td>50 g milk powder + 1 L PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R30852801</td>
			<td>for actavation of T ells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pac HC</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Standard All Blue</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0373</td>
			<td>use between 3-5 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A Sepharose CL-4B beads</td>
			<td>Novodirect/ Th.Geyer</td>
			<td>GE 17-0780-01</td>
			<td>affinity resin beads prepared according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scraper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4360.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shaker</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K305.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>170-4270</td>
			<td>used according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>10026938</td>
			<td>prepared according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>170-4270</td>
			<td>used according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot-Turbo</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Chem Solute</td>
			<td>8,08,51,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3051.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Pan Reac Appli Chem</td>
			<td>A4974,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring composition of cd95 death-inducing signaling complex and processing of procaspase-8 in this complex

אפופטוזיס Extrinsic הוא בתיווך על ידי ההפעלה של קולטני מוות (DRs) כגון CD95 /Fas/APO-1 או גידול נמק הקשורים אפופטוזיס-גרימת ליגנד (TRAIL)-קולטן 1/קולטן 2 (TRAIL-R1/R2). גירוי של קולטנים אלה עם ליגנדים מודעים שלהם מוביל להרכבה של תסביך איתות גרימת מוות (DISC). ה-DISC כולל את DR, חלבון המתאם Fas הקשור לתחום המוות (FADD), פרוקספסות-8/-10, ואינטרלוקין דמוי FADD תאי (IL)-1β הממיר חלבונים מעכבי אנזימים (c-FLIPs). הדיסק משמש כפלטפורמה לעיבוד והפעלה של פרוקספאז-8. זה האחרון מתרחש באמצעות דימרציה שלה / אוליגומריזציה בתחום אפקט המוות (DED) חוטים שהורכבו בדיסק. 
הפעלה של procaspase-8 מלווה בעיבוד שלה, אשר מתרחשת במספר שלבים. בעבודה זו, מתוארת זרימת עבודה ניסיונית מבוססת המאפשרת מדידה של היווצרות דיסק ועיבוד של פרוקספאז-8 במתחם זה. זרימת העבודה מבוססת על טכניקות אימונופרציפיטציה הנתמכות על-ידי ניתוח כתם מערבי. זרימת עבודה זו מאפשרת ניטור זהיר של שלבים שונים של גיוס procaspase-8 ל- DISC ועיבודו והיא רלוונטית מאוד לחקירת מנגנונים מולקולריים של אפופטוזיס קיצוני.

כדי לנתח גיוס caspase-8 לדיסק ועיבודו בדיסק CD95, מאמר זה מתאר זרימת עבודה קלאסית, המשלבת IP של דיסק CD95 עם ניתוח כתם מערבי. הדבר מאפשר זיהוי של מספר תכונות מרכזיות של הפעלת caspase-8 בדיסק: ההרכבה של הפלטפורמה המקרומולקולרית המפעילה caspase-8, גיוס פרוקספז-8 ל- DISC ועיבוד של קספאז יוזם זה (איור 1</stro...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex at JoVE.com

Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex

כאן, מוצגת זרימת עבודה ניסיונית המאפשרת זיהוי של עיבוד caspase-8 ישירות בקומפלקס האיתות מעורר המוות (DISC) וקובעת את ההרכב של קומפלקס זה. למתודולוגיה זו יש יישומים רחבים, החל מחשיפת המנגנונים המולקולריים של נתיבי מוות תאים ועד למודל הדינמי של רשתות אפופטוזיס.

מדידת הרכב של CD95 מוות גרימת איתות מורכב ועיבוד של Procaspase-8 במתחם זה

Extrinsic apoptosis is mediated by the activation of death receptors (DRs) such as CD95/Fas/APO-1 or tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ...

ייזום אפופטוזיס מתווך על ידי הפעלה של כספיות בפלטפורמות מולקולריות של סמן. אנו מציגים את הזיהוי של דיסק מורכב המוות של תאי החניכה, המשמש כפלטפורמה להפעלת caspase-8. היתרון של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת זיהוי של ההרכבה ואת הרכב של מתחם הדיסק יחד עם מתן מידע על עיבוד caspase-8 במתחם זה.התחל את הניסוי עם תאים שהם 80% עד 90% משוחחים ודבקים במנה. יש להשליך את המדיום ולהוסיף מדיום טרי לתאים החסידים. לאחר מכן לעורר את התאים עם הריכוז הנבחר של CD95L על ידי החזקת הצלחת בזווית וצינורות ליגנד לתוך המדיום מבלי לגעת בתאים החסידים.כדי לקצור את התאים, מניחים את צלחת התא על קרח. הוסף 10 מיליליטר של PBS קר להשעיית התא ולגרד את התאים המצורפים מהצלחת. לאסוף את השעיית התא בצינור 50 מיליליטר.לשטוף את צלחת התא עם 10 מיליליטר של PBS קר פעמיים ולהוסיף את פתרון לשטוף לתוך אותו צינור 50 מיליליטר. ואז צנטריפוגה השעיית התא ב 500 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר השלכת supernatant, resuspend גלולה התא מיליליטר אחד של PBS קר.ואז להעביר את השעיית התא לתוך צינור 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה השעיית התא ו resuspend גלולה התא במיליליטר אחד של PBS קר שוב. חזור על הצנטריפוגה שוב, ולאחר מכן resuspend את גלולה התא במיליליטר אחד של חוצץ תמוגה ודגרה זה במשך 30 דקות על קרח.לאחר הדגירה, צנטריפוגה ליסאט במהירות מקסימלית במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להעביר את supernatant לצינור נקי. להשליך את הכדור ולאסוף 50 דגימת microliter של ליסאט בצינור אחר לקביעת ריכוז החלבון. עבור immunoprecipitation, להוסיף שני microliters של נוגדן נגד APO1 ו 10 microliters של חלבון מוכן חרוזים ספרוז ליסאט.הוסף 10 מיקרוליטרים של החרוזים לבד לצינור נפרד המכיל את lysate לשמש בקרת חרוזים. לדגור על התערובת המכילה את הליסאט, הנוגדנים וחרוזי החלבון A Sepharose למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס עם ערבוב עדין. למחרת, צנטריפוגה התערובת ב 500 פעמים G במשך ארבע דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר השלכת supernatant, לשטוף את החרוזים על ידי הוספת מיליליטר אחד של PBS קר להשליך את supernatant לאחר צנטריפוגה. חזור על שלב זה לפחות שלוש פעמים. לאחר השלכת שטיפת PBS האחרונה, שאפו את החרוזים רצוי עם מזרק 50 מיקרוליטר המילטון.כדי לבצע את הכתם המערבי, להוסיף 20 microliters של חוצץ טעינה 4X לחרוזים וחום ב 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. בו זמנית, מחממים את פקדי הלסייט ב-95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. העמיסו את הריסאטים, האימונופרציפיטנטים ותקן החלבון על ג'ל SDS של 12.5% ופעלו במתח קבוע של 80 וולט.לאחר ריצת הג'ל הושלמה, להעביר את החלבונים מן ג'ל SDS לקרום ניטרוצלולוז. לאחר השלמת ההעברה, מניחים את הממברנה הכתומה בקופסה ודגר אותה במשך שעה בחסימת פתרון תחת תסיסה עדינה, ולאחר מכן לשטוף את הממברנה שלוש פעמים במשך חמש דקות עם PBST. כדי לזהות את החלבונים, מוסיפים את הנוגדן הראשוני הראשון בדילול המצוין לממברנה ודגר אותו בן לילה בארבע מעלות צלזיוס בתסיסה עדינה.למחרת, לשטוף את הממברנה עם שלוש שטיפת PBST חמש דקות, ולאחר מכן לדגור על הממברנה עם 20 מיליליטר של נוגדן משני עם רועד עדין במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם PBST שוב. לאחר השלכת שטיפת PBST האחרונה, להוסיף כמיליליטר אחד של מצע peroxidase חזרת לממברנה ולזהות את אות הכימותרפיה.גירוי של סרטן צוואר הרחם HeLa-CD95 תאים עם CD95L הביא רמה גבוהה של היווצרות CD95 דיסק מנוטר באמצעות IMMUNOPRECIPitation CD95. CD95, FADD, procaspase-8, procaspase-10 ו- c-FLIPS נצפו ב- CD95 immunoprecipitations אלה המצביעים על היווצרות דיסק יעילה. מוצרי המחשוף של p43-FLIP ו- p22-FLIP זוהו ב- immunoprecipitations, המציין הפעלת caspase-8.תאי HeLa-CD95 המפרסמים יתר על המידה c-FLIP ארוך שימשו לניתוח היווצרות CD95 DISC. בדומה לתאי HeLa-CD95 הורים, לא זוהה גיוס של FADD, פרוקספז-9, פרוקספז-10, חלבוני C-FLIP ו- PARP1 בחלבוני האימונופרציפיטים של תאים אלה ללא טיפול CD95L. תאי T ראשיים מופעלים התאפיינו ברמות גבוהות של CD95, FADD, פרוקספז-8, פרוקספאז-10 ו- c-FLIPS באימונופרנציות נגד CD95.טכניקה זו מאפשרת ניתוח של היווצרות דיסק מולקולרי, כולל עיבוד של caspase-8 ב- DISC. כל מדרגות הכביסה חשובות מאוד. בנוסף, נקודות גירוי ודגיה יש לקחת ברצינות.זוהי הדרך היחידה למדוד את ההרכבה במתחם הדיסק. עם זאת, כדי למדוד הפעלת caspase-8, ניתן גם ליישם התקפות פעילות caspase-8. גישה זו אפשרה לנו לקבל תובנות חדשות על חניכת אפופטוזיס.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

שיטה למדידת מטבוליזם ב ממוינות תת-אוכלוסיות של קהילות Cell מורכבות באמצעות איתור איזוטופ יציב

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

הכנת ענק שלפוחית ​​encapsulating מיקרוסכמות על ידי צנטריפוגה של אמולסיה מים ב-שמן

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

מדידת G- חלבון מצמידים איתות באמצעות רדיו שכותרתו GTP מחייב

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

A השתנה- Hybrid מערכת אחת עבור חלבון Heteromeric מורכבות- DNA אינטראקציה מחקרים

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

אפיון הביוכימי ומבניים של SP0092 המצע-מחייב-חלבון פחמימות תחבורה

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

ניתוח Toeprinting של תרגום חניכה היווצרות מורכבות על יונקים mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

הקרנה אסטרטגית ואפיון של הקומפלקס החזותי של החלבון GPCR-mini-G של התגבשות מוצלחת

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

התגבשות וקביעת מבנה של אנזים:קומפלקס מצע על ידי התגבשות סדרתית בשבב מיקרופלואידי רב-תכליתי

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads

השלמת פעילות התרסיס על ידי מתחם גלקטין-3 - U1 snRNP על חרוזים

Classic depletion-reconstitution experiments indicate that galectin-3 is a required splicing factor in nuclear extracts. The mechanism of incorporation of ...