Name: measuring composition of cd95 death-inducing signaling complex and processing of procaspase-8 in this complex
Uploaded: 2021-08-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex at JoVE.com

我々は、ウィルヘルム・サンダー財団(2017.008.02)、EUプログラムERDF(欧州地域開発基金)、DFG(LA 2386)が資金を提供するダイナミックシステムセンター(CDS)が当社の活動を支援することを認めます。私たちの実験を支援してくれたカリーナ・グテクに感謝します。私たちは、私たちに原発性T細胞を提供したダーク・クラインホルド教授(OvGU、マクデブルク)を認めます。

T細胞実験は、倫理協定42502-2-1273 Uni MDに従って行った。
1. 実験用の細胞の準備
注: この免疫沈降の平均細胞数は 1 × 107です。 被着細胞は実験の日に107 個の細胞×されるように、実験の1日前に播種する必要があります。
<ol><li>実験用の接着細胞の準備<ol>
<li>種子5〜8×、実験開始の前日に14.5cmの皿の各条件について、培地20mL(?...

<ol>
	<li>Lavrik, I. N., Krammer, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+CD95/Fas+signaling+at+the+DISC.">Regulation of CD95/Fas signaling at the DISC.</a> Cell Death and Differentiation. 19 (1), 36-41 (2012).</li><li>Krammer, P. H., Arnold, R., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+and+death+in+peripheral+T+cells.">Life and death in peripheral T cells.</a> Nature Reviews Immunology. 7 (7), 532-542 (2007).</li><li>Dickens, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+death+effector+domain+chain+DISC+model+reveals+a+crucial+role+for+caspase-8+chain+assembly+in+mediating+apoptotic+cell+death.">A death effector domain chain DISC model reveals a crucial role for caspase-8 chain assembly in mediating apoptotic cell death.</a> Molecular Cell. 47 (2), 291-305 (2012).</li><li>Fu, T. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+caspase-8+tandem+DED+filament+reveals+assembly+and+regulation+mechanisms+of+the+death-inducing+signaling+complex.">Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex.</a> Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).</li><li>Scaffidi, C., Medema, J. P., Krammer, P. H., Peter, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLICE+is+predominantly+expressed+as+two+functionally+active+isoforms,+caspase-8/a+and+caspase-8/b.">FLICE is predominantly expressed as two functionally active isoforms, caspase-8/a and caspase-8/b.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 26953-26958 (1997).</li><li>Fox, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structural+analysis+of+FADD:Caspase-8+complexes+defines+the+catalytic+dimer+architecture+for+co-ordinated+control+of+cell+fate.">Cryo-EM structural analysis of FADD:Caspase-8 complexes defines the catalytic dimer architecture for co-ordinated control of cell fate.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).</li><li>Schleich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+of+the+CD95+death-inducing+signaling+complex:+experimental+and+modeling+evidence+for+a+death+effector+domain+chain+model.">Stoichiometry of the CD95 death-inducing signaling complex: experimental and modeling evidence for a death effector domain chain model.</a> Molecular Cell. 47 (2), 306-319 (2012).</li><li>Hughes, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+death-inducing+signaling+complex+reveals+a+substrate+switch+that+determines+CD95-mediated+death+or+survival.">Reconstitution of the death-inducing signaling complex reveals a substrate switch that determines CD95-mediated death or survival.</a> Molecular Cell. 35 (3), 265-279 (2009).</li><li>Lavrik, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+active+caspase-8+heterotetramer+is+formed+at+the+CD95+DISC+[2].">The active caspase-8 heterotetramer is formed at the CD95 DISC [2].</a> Cell Death and Differentiation. 10 (1), 144-145 (2003).</li><li>Hoffmann, J. C., Pappa, A., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+C-terminal+cleavage+product+of+procaspase-8,+p30,+defines+an+alternative+pathway+of+procaspase-8+activation.">A new C-terminal cleavage product of procaspase-8, p30, defines an alternative pathway of procaspase-8 activation.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (16), 4431-4440 (2009).</li><li>Golks, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+CAP3+in+CD95+signaling:+New+insights+into+the+mechanism+of+procaspase-8+activation.">The role of CAP3 in CD95 signaling: New insights into the mechanism of procaspase-8 activation.</a> Cell Death and Differentiation. 13 (3), 489-498 (2006).</li><li>Ozt&#252;rk, S., Schleich, K., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+FLICE-like+inhibitory+proteins+(c-FLIPs):+Fine-tuners+of+life+and+death+decisions.">Cellular FLICE-like inhibitory proteins (c-FLIPs): Fine-tuners of life and death decisions.</a> Experimental Cell Research. 318 (11), 1324-1331 (2012).</li><li>Golks, A., Brenner, D., Fritsch, C., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-FLIPR,+a+new+regulator+of+death+receptor-induced+apoptosis.">c-FLIPR, a new regulator of death receptor-induced apoptosis.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 14507-14513 (2005).</li><li>Hughes, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-operative+and+hierarchical+binding+of+c-FLIP+and+caspase-8:+A+unified+model+defines+how+c-FLIP+isoforms+differentially+control+cell+fate.">Co-operative and hierarchical binding of c-FLIP and caspase-8: A unified model defines how c-FLIP isoforms differentially control cell fate.</a> Molecular Cell. 61 (6), 834-849 (2016).</li><li>Hillert, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+and+short+isoforms+of+c-FLIP+act+as+control+checkpoints+of+DED+filament+assembly.">Long and short isoforms of c-FLIP act as control checkpoints of DED filament assembly.</a> Oncogene. 39 (8), 1756-1772 (2020).</li><li>Yu, J. W., Jeffrey, P. D., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+procaspase-8+activation+by+c-FLIPL.">Mechanism of procaspase-8 activation by c-FLIPL.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8169-8174 (2009).</li><li>Micheau, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long+form+of+FLIP+is+an+activator+of+caspase-8+at+the+Fas+death-inducing+signaling+complex.">The long form of FLIP is an activator of caspase-8 at the Fas death-inducing signaling complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 45162-45171 (2002).</li><li>Chang, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-FLIPL+is+a+dual+function+regulator+for+caspase-8+activation+and+CD95-mediated+apoptosis.">C-FLIPL is a dual function regulator for caspase-8 activation and CD95-mediated apoptosis.</a> EMBO Journal. 21 (14), 3704-3714 (2002).</li><li>Hillert, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+DISC+regulation+via+pharmacological+targeting+of+caspase-8/c-FLIPL+heterodimer.">Dissecting DISC regulation via pharmacological targeting of caspase-8/c-FLIPL heterodimer.</a> Cell Death and Differentiation. 27 (7), 2117-2130 (2020).</li><li>Fricker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+dissection+of+CD95+signaling+dynamics+reveals+both+a+pro-+and+antiapoptotic+role+of+c-FLIPL.">Model-based dissection of CD95 signaling dynamics reveals both a pro- and antiapoptotic role of c-FLIPL.</a> Journal of Cell Biology. 190 (3), 377-389 (2010).</li><li>Arndt, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+TCR+activation+kinetics+in+primary+human+T+cells+upon+focal+or+soluble+stimulation.">Analysis of TCR activation kinetics in primary human T cells upon focal or soluble stimulation.</a> Journal of Immunological Methods. 387 (1-2), 276-283 (2013).</li><li>Pietkiewicz, S., Eils, R., Krammer, P. H., Giese, N., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+treatment+of+CD95L+and+gemcitabine+in+pancreatic+cancer+cells+induces+apoptotic+and+RIP1-mediated+necroptotic+cell+death+network.">Combinatorial treatment of CD95L and gemcitabine in pancreatic cancer cells induces apoptotic and RIP1-mediated necroptotic cell death network.</a> Experimental Cell Research. 339 (1), 1-9 (2015).</li><li>Schleich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+DED+chains+at+the+DISC:+regulation+of+procaspase-8+activation+by+short+DED+proteins+c-FLIP+and+procaspase-8+prodomain.">Molecular architecture of the DED chains at the DISC: regulation of procaspase-8 activation by short DED proteins c-FLIP and procaspase-8 prodomain.</a> Cell Death and Differentiation. 23 (4), 681-694 (2016).</li><li>Lavrik, I. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+CD95+threshold+signaling:+Triggering+of+CD95+(FAS/APO-1)+at+low+concentrations+primarily+results+in+survival+signaling.">Analysis of CD95 threshold signaling: Triggering of CD95 (FAS/APO-1) at low concentrations primarily results in survival signaling.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13664-13671 (2007).</li><li>Sprick, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-10+is+recruited+to+and+activated+at+the+native+TRAIL+and+CD95+death-inducing+signalling+complexes+in+a+FADD-dependent+manner+but+can+not+functionally+substitute+caspase-8.">Caspase-10 is recruited to and activated at the native TRAIL and CD95 death-inducing signalling complexes in a FADD-dependent manner but can not functionally substitute caspase-8.</a> EMBO Journal. 21 (17), 4520-4530 (2002).</li><li>Neumann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+within+the+CD95+death-inducing+signaling+complex+decide+life+and+death+of+cells.">Dynamics within the CD95 death-inducing signaling complex decide life and death of cells.</a> Molecular Systems Biology. 6 (1), 352 (2010).</li><li>Kischkel, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity-dependent+APO-1+(Fas/CD95)-associated+proteins+form+a+death-inducing+signaling+complex+(DISC)+with+the+receptor.">Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor.</a> EMBO Journal. 14 (22), 5579-5588 (1995).</li><li>Seyrek, K., Richter, M., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+the+sweet+regulation+of+apoptosis:+the+role+of+glycosylation+and+galectins+in+apoptotic+signaling+pathways.">Decoding the sweet regulation of apoptosis: the role of glycosylation and galectins in apoptotic signaling pathways.</a> Cell Death and Differentiation. 26 (6), 981-993 (2019).</li><li>Kallenberger, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-+and+interdimeric+caspase-8+self-cleavage+controls+strength+and+timing+of+CD95-induced+apoptosis.">Intra- and interdimeric caspase-8 self-cleavage controls strength and timing of CD95-induced apoptosis.</a> Science Signaling. 7 (316), 23 (2014).</li></ol>

このアプローチは、Kischkelら27 によって最初に記述され、それ以来いくつかのグループによって開発されました。この複合体における効率的なDISC-免疫沈降およびモニタリングカスパーゼ-8処理に関しては、いくつかの重要な問題を考慮する必要があります。
まず、免疫沈降の間に全ての洗浄工程に従う必要があります。特に重要なのは、セファロース?...

最もよく研究された死の受容体(DR)の1つはCD95(Fas、APO-1)である。外因性アポトーシス経路は、DRと同結合リガンドとの相互作用から始まり、CD95LはTRAIL-Rsに結合するCD95またはTRAILと相互作用する。この結果、対応するDR. DISC での DISC の形成は、CD95、 FADD、 プロカスラーゼ-8/-10、および c-FLIP タンパク質1,2からなる 。さらに、DISCは、CD95やFADDなどの死ドメイン(DD)含有タンパク質、およびFADD、プロカスパス-8/-10、およびc-FLIPなどのDED含有タンパク質との相互作用によって組み立てられる(図1)。Procaspase-8は、そのDEの関連付けを介してオリゴマー化を行い、その結果、DEDフィラメントの形成、続いてプロカスパス8の活性化および処理を行う。これは、カスパーゼカスケードをトリガーし、細胞死(図1)3、4につながる。従って、プロカスパス症−8は、CD95またはTRAIL−Rsによって媒介される外因性アポトーシス経路の中心イニシエーターカスパーゼであり、対応する高分子プラットフォームDISCで活性化される。
プロカスパスゼ-8の2つのアイソフォーム、すなわちプロカスパス-8a(p55)および-8b(p53)は、DISC5に採用することが知られている。両方のアイソフォームは、2つのDEを含む。DED1およびDED2は、触媒p18およびp10ドメインが続く、プロアスパス症-8a/bのN末端部分に位置する。プロアスパス症-8DEの詳細なクライオ電子顕微鏡(cryo-EM)分析は、プロサスパス8タンパク質のDEDフィラメント4,6と呼ばれる糸状構造への組み立てを明らかにした。驚くべきことに、リニアプロアスパス8鎖は、最初は二量体化に従事し、続いてDISCでプロスパパス8活性化に従事することが示唆された。さて、これらの鎖は、プロカスパス-8DEDフィラメントの一部構造に過ぎず、後者は三重らせん3、4、6、7に組み立てられた3つの鎖を含むことが知られている。
DEDフィラメントでの二量体化の際、プロカスパス8a/bの立体構造変化は、プロアスパス-8の活性中心の形成と、その活性化3、8を導く。これに続いて、2つの経路を介して媒介されるprocaspase-8処理が続きます:最初のものはp43 / p41切断産物の生成を介して行き、2番目のものはp30切断産物の初期生成を介して行きます。p43/p41経路はAsp374でのプロスパパス-8a/bの切断によって開始され、p43/p41およびp12切断産物を生じる(図2)。また、これらの断片は、Asp384およびAsp210/216で自動触媒的に切断され、活性カスパーゼ-8ヘテロトラマーの形成を生じさせる、p10 2/p1829、10、11。また、p43/p41処理経路と並行して、プロカスパス-8a/bもAsp216で切断され、C末端切断生成物p30の形成につながり、続いてp10およびp1810に対するタンパク質分解が行われることが示された(図2)。
DEDフィラメントにおけるプロカスパス症-8a/b活性化はc-FLIP12というタンパク質によって厳密に調節される。c-FLIPタンパク質は、c-FLIPLong (c-FLIP L)、c-フリップショート(c-FLIPS)、c-FLIPラジ(c-FLIPR)の3つのアイソフォームで発生します。3 つのアイソフォームはいずれも、N 端子領域に 2 つの DE を含んでいます。c-FLIPLはまたC末端触媒的に不活性なカスパーゼ様ドメイン12、13を有する。c-FLIP-c-FLIPSとc-FLIPRの両方の短いアイソフォーム-DISC6、14、15でDEDフィラメント形成を妨害することによって抗アポトーシス的な方法で作用する。さらに、c-FLIPLは濃度依存的な方法でカスパーゼ-8の活性化を調節することができる。これは、プロと抗アポトーシス効果16、17、18の両方をもたらすことができます。触媒活性プロアスパスを形成することによって-8/c-FLIPLヘテロダイマー、c-FLIPLは、プロアスパス8の活性中心の安定化とその活性化をもたらす。c-FLIPLのプロまたは抗アポトーシス関数は、DEDフィラメントにおけるその量および後に組み立てられたプロスパパス症-8/c-FLIPLヘテロダイマー19の量に直接依存する。DISCでのC-FLIPLの低濃度または中間濃度は、カスパーゼ-8の活性化をサポートするDEDフィラメントで十分な量のプロスパパス酵素-8/c-FLIPLヘテロ二量体をもたらす。対照的に、c-FLIPLの増加量は、直接DISC20でその抗アポトーシス効果につながります。
まとめると、DISCでのprocaspase-8a/bの活性化と処理は、いくつかのステップを伴う高度に規制されたプロセスです。本論文では、DISCにおけるプロカスパス8処理の測定と、この複合体の組成の分析について議論する。これは、例示的なDR複合体としてCD95 DISCを使用して提示されます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12.5% SDS gel</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td>for two separating gels: 
			3.28 mL distilled H2O 
			2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 
			4.06 mL acrylamide 
			100 &#181;L 10% SDS 
			100 &#181;L 10% APS 
			7.5 &#181;L TEMED 
			 
			for two collecting gels: 
			3.1 mL distilled H2O 
			1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 
			0.5 mL acrylamide 
			50 &#181;L 10% SDS 
			25 &#181;L 10% APS 
			7.5 &#181;L TEMED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14.5 cm cell dishes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>639160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acrylamide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A124.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-actin Ab</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2103</td>
			<td>dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-APO-1 Ab</td>
			<td>provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo</td>
			<td>ALX-805-038-C100</td>
			<td>used only for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-caspase-10 Ab</td>
			<td>Biozol</td>
			<td>MBL-M059-3</td>
			<td>dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-caspase-3 Ab</td>
			<td>cell signaling</td>
			<td>9662 S</td>
			<td>dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-caspase-8 Ab C15</td>
			<td>provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO</td>
			<td>ALX-804-242-C100</td>
			<td>dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD95 Ab</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-715</td>
			<td>dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-c-FLIP NF6 Ab</td>
			<td>provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO</td>
			<td>ALX-804-961-0100</td>
			<td>dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FADD 1C4 Ab</td>
			<td>provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO</td>
			<td>ADI-AAM-212-E</td>
			<td>dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PARP Ab</td>
			<td>cell signaling</td>
			<td>9542</td>
			<td>dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9592.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4227.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford solution 
			Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>used according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD95L</td>
			<td>provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO</td>
			<td>ALX-522-020-C005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chemoluminescence detector 
			Chem Doc XRS+</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11 836 145 001</td>
			<td>prepared according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10x) w/o Ca, Mg</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-53500</td>
			<td>dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eletrophoresis buffer</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td>10x electrophoresis buffer: 
			60.6 g Tris 
			288 g glycine 
			20 g SDS 
			ad 2 L H2O 
			1:10 dilution before usage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3908.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG1 HRP</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>1070-05</td>
			<td>dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG2b</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>1090-05</td>
			<td>dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG-HRP</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>4030-05</td>
			<td>dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin-2 Human(hIL-2)</td>
			<td>Merckgroup/ Roche</td>
			<td>11011456001</td>
			<td>for activation of T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3904.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>loading buffer 
			4x Laemmli Sample Buffer,10 mL</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0747</td>
			<td>prepared according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminata Forte Western HRP substrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBLUFO500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysis buffer</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td>13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 
			27.5 mL NaCl; 5 M 
			10 mL EDTA; 2 mM 
			100 mL Triton X-100 
			add 960 mL H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine,&#160; 2,438 g/L</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-41154</td>
			<td>adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medium for primary T cells</td>
			<td>gibco by Life Technologie</td>
			<td>21875034</td>
			<td>adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>milk powder</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T145.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P030.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3957.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td>20x PBST: 
			230 g NaCl 
			8 g KCl 
			56.8 g Na2HPO4 
			8 g KH2PO4 
			20 mL Tween-20 
			ad 2 L H2O 
			dilution 1:20 before usage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST + 5% milk</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td>50 g milk powder + 1 L PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R30852801</td>
			<td>for actavation of T ells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pac HC</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Standard All Blue</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0373</td>
			<td>use between 3-5 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A Sepharose CL-4B beads</td>
			<td>Novodirect/ Th.Geyer</td>
			<td>GE 17-0780-01</td>
			<td>affinity resin beads prepared according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scraper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4360.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shaker</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K305.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>170-4270</td>
			<td>used according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>10026938</td>
			<td>prepared according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>170-4270</td>
			<td>used according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot-Turbo</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Chem Solute</td>
			<td>8,08,51,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3051.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Pan Reac Appli Chem</td>
			<td>A4974,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring composition of cd95 death-inducing signaling complex and processing of procaspase-8 in this complex

外因性アポトーシスは、CD95/Fas/APO-1または腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)受容体1/受容体2(TRAIL-R1/R2)などの死受容体(DR)の活性化によって媒介される。これらの受容体を同一性リガンドで刺激すると、死を誘発するシグナル伝達複合体(DISC)の組み立てにつながる。DISCはDR、アダプタータンパク質Fas関連タンパク質と死ドメイン(FADD)、プロサスアーゼ-8/-10、および細胞FADD様インターロイキン(IL)-1β変換酵素阻害タンパク質(c-FLIP)を含む。DISCは、プロカスパス8の処理とアクティベーションのプラットフォームとして機能します。後者 は、DISC で組み立てられたデスエフェクタードメイン(DED)フィラメントにおける二量体化/オリゴマー化によって生じる。 
procaspase-8 の活性化は、その処理が続いて、いくつかのステップで発生します。本研究では、この複合体におけるDISC形成およびプロアスパス8の処理を測定することを可能にする確立された実験ワークフローについて説明する。このワークフローは、ウェスタンブロット分析でサポートされている免疫沈降技術に基づいています。このワークフローは、DISCとその処理に対するprocaspase-8採用の異なるステップを注意深く監視することを可能にし、外因性アポトーシスの分子メカニズムを調査するために非常に関連性が高い。

本論文では、CD95 DISCにおけるDISCへのカスパーゼ-8の採用と処理を分析するために、CD95 DISCのIPとウェスタンブロット分析を組み合わせた古典的なワークフローについて説明する。これにより、CASPASE-8活性化の複数の主要な機能をDISCで検出できます:カスパーゼ-8活性化高分子プラットフォームの組み立て、PROCASAS-8のDISCへの採用、およびこのイニシエーターカスパーゼの処理(図1...

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Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex

ここでは、死誘導シグナル伝達複合体(DISC)で直接カスパーゼ-8処理を検出し、この複合体の組成を決定する実験的ワークフローを提示する。この方法論は、細胞死経路の分子機構の解明からアポトーシスネットワークの動的モデリングまで幅広い応用を有する。

CD95死誘導シグナル複合体の組成とプロスパスパーゼ-8の処理の測定

Extrinsic apoptosis is mediated by the activation of death receptors (DRs) such as CD95/Fas/APO-1 or tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ...

アポトーシス開始は、マーカー分子プラットフォームでのカスパーゼの活性化によって媒介される。カスパーゼ8活性化のプラットフォームとなる重要な開始細胞死複合体DISCの検出を提示する。この技術の利点は、この複合体におけるcaspase-8処理に関する情報を提供するとともに、アセンブリおよびDISC複合体の組成の検出を可能にすることです。80%〜90%コンフルエントで、皿に付着した細胞で実験を開始します。培地を捨て、接着細胞に新鮮な培地を加えます。次に、プレートを斜めに保持し、接着細胞に触れることなくリガンドを培地にピペット処理することで、選択したCD95L濃度で細胞を刺激します。細胞を収穫するには、氷の上に細胞皿を置きます。細胞懸濁液に冷たいPBSの10ミリリットルを加え、取り付けた細胞をプレートから削り取ります。50ミリリットルチューブに細胞懸濁液を集める。冷たいPBSの10ミリリットルで細胞皿を2回洗い、同じ50ミリリットルのチューブに洗浄液を加えます。その後、セル懸濁液を摂氏4度で5分間500倍Gで遠心分離する。上清を捨て、冷たいPBSの1ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁する。その後、細胞懸濁液を1.5ミリリットルのチューブに移します。細胞懸濁液を遠心分離し、再び冷たいPBSの1ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁する。遠心分離をもう一度繰り返し、細胞ペレットを1ミリリットルのリシスバッファーで再懸濁し、氷の上で30分間インキュベートします。インキュベーション後、最大速度でリセートを摂氏4度で15分間遠心し、上清をきれいなチューブに移します。ペレットを捨てて、タンパク質濃度を決定するために、別のチューブにライセートの50マイクロリットルのサンプルを集めます。免疫沈降の場合、2マイクロリットルの抗APO1抗体と10マイクロリットルの調製プロテインAセファロースビーズをライセートに添加します。ビーズの10マイクロリットルを、ビーズコントロールとして機能するリゼートを含む別のチューブに単独で加えます。リゼート、抗体、タンパク質Aセファローズビーズを含む混合物を穏やかな混合で摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、500倍Gで摂氏4度で4分間遠心する。上清を捨て、冷たいPBSを1ミリリットル加えてビーズを洗浄し、遠心分離後に上清を捨てます。この手順を少なくとも 3 回繰り返します。最後のPBS洗浄を廃棄した後、好ましくは50マイクロリットルのハミルトンシリンジでビーズを吸引する。ウエスタンブロットを実行するには、ビーズに20マイクロリットルの4Xローディングバッファを加え、摂氏95度で10分間加熱します。同時に、95°Cで5分間、lysateコントロールを加熱します。ライセート、免疫沈降剤、およびタンパク質標準物を12.5%SDSゲルにロードし、一定電圧80ボルトで動作します。ゲルの実行が完了したら、SDSゲルからニトロセルロース膜にタンパク質を移します。移管が完了したら、ブロット膜を箱に入れ、穏やかな攪拌の下でブロッキング溶液に1時間インキュベートし、PBSTで5分間膜を3回洗浄します。タンパク質を検出するには、示された希釈液で最初の一次抗体を膜に加え、穏やかな攪拌で摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、膜を5分間のPBST洗浄を3回洗浄し、20ミリリットルの二次抗体で膜を室温で1時間穏やかに揺らしてインキュベートします。再びPBSTで膜を3回洗います。最後のPBST洗浄を廃棄した後、約1ミリリットルの西洋ワサビペルオキシダーゼ基板を膜に加え、化学発光シグナルを検出します。CD95Lによる子宮頸癌HeLa-CD95細胞の刺激は、CD95免疫沈降を介して監視される高レベルのCD95 DISC形成をもたらした。CD95、FADD、プロカスパス-8、プロアスパス-10、およびc-フリップは、効率的なDISC形成を示すこれらのCD95免疫沈降法において観察された。p43-FLIPおよびp22-FLIPの切断産物は、カスパーゼ-8活性化を示す免疫沈降で検出された。C-FLIPを過剰発現するHeLa-CD95細胞をCD95 DISC形成の解析に用いた。親のHeLa-CD95細胞と同様に、FADD、プロカスパス-9、プロアスパス-10、c-FLIPタンパク質、およびPARP1の募集は、CD95L治療なしでこれらの細胞からの免疫沈降法で検出されなかった。活性化された一次T細胞は、抗CD95免疫沈降においてCD95、FADD、プロスパパス-8、プロアスパス-10、およびc-FLIPSの高レベルを特徴とした。この技術は、DISCでのカスパーゼ-8の処理を含む、分子DISC形成の解析を可能にする。すべての洗浄ステップは非常に重要です。また、刺激ポイントとインキュベーション時間は真剣に取り組むべきです。これは DISC 複合体上のアセンブリを測定する唯一の方法です。しかし、カスパーゼ8活性化を測定するために、カスパーゼ-8活性アッセイを実施することもできる。このアプローチは、アポトーシス開始に関する新しい洞察を得ることを可能にしました。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Cryomilled哺乳動物細胞からのタンパク質複合体の親和性のキャプチャ

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

安定同位体のトレースを使用した複雑な細胞のコミュニティのソートされた亜集団で代謝を測定する方法

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

油中水型エマルションの遠心分離により巨大ベシクルカプセル化微小球の調製

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

ラジオ標識GTP結合を介したGタンパク質共役型受容体シグナルの測定

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

異種タンパク質複合体-DNA相互作用研究のための改変酵母1ハイブリッドシステム

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

炭水化物輸送基質結合タンパク質 SP0092 の生化学的および構造特性

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

哺乳類の Mrna の翻訳開始複合体形成の Toeprinting 分析

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

結晶化を成功させるための視覚的GPCR-mini-Gタンパク質シグナル伝達複合体の戦略的スクリーニングと特性評価

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

酵素の結晶化と構造決定:多用途マイクロ流体チップにおける連続結晶学による基質複合体

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads

ガレクチン-3 - ビーズ上のU1 snRNP複合体によるスプライシング活性の相補

Classic depletion-reconstitution experiments indicate that galectin-3 is a required splicing factor in nuclear extracts. The mechanism of incorporation of ...