Name: measuring composition of cd95 death-inducing signaling complex and processing of procaspase-8 in this complex
Uploaded: 2021-08-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex at JoVE.com

Vi anerkjenner Wilhelm Sander-Foundation (2017.008.02), Center of Dynamic Systems (CDS), finansiert av EU-programmet ERDF (European Regional Development Fund) og DFG (LA 2386) for å støtte vårt arbeid. Vi takker Karina Guttek for at han støttet eksperimentene våre. Vi anerkjenner prof. Dirk Reinhold (OvGU, Magdeburg) for å gi oss primære T-celler.

T-celleeksperimenter ble utført i henhold til den etiske avtalen 42502-2-1273 Uni MD.
1. Forbereder celler for eksperimentet
MERK: Gjennomsnittlig antall celler for denne immunseffreringen er 1 × 107. Adherent celler må frøs en dag før eksperimentet slik at det er 1 × 107 celler på dagen for eksperimentet.
<ol><li>Forbereder tilhengerceller for eksperimentet<ol>
<li>Frø 5-8 × 106 adherentceller i 20 ml medium (...

<ol>
	<li>Lavrik, I. N., Krammer, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+CD95/Fas+signaling+at+the+DISC.">Regulation of CD95/Fas signaling at the DISC.</a> Cell Death and Differentiation. 19 (1), 36-41 (2012).</li><li>Krammer, P. H., Arnold, R., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+and+death+in+peripheral+T+cells.">Life and death in peripheral T cells.</a> Nature Reviews Immunology. 7 (7), 532-542 (2007).</li><li>Dickens, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+death+effector+domain+chain+DISC+model+reveals+a+crucial+role+for+caspase-8+chain+assembly+in+mediating+apoptotic+cell+death.">A death effector domain chain DISC model reveals a crucial role for caspase-8 chain assembly in mediating apoptotic cell death.</a> Molecular Cell. 47 (2), 291-305 (2012).</li><li>Fu, T. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+caspase-8+tandem+DED+filament+reveals+assembly+and+regulation+mechanisms+of+the+death-inducing+signaling+complex.">Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex.</a> Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).</li><li>Scaffidi, C., Medema, J. P., Krammer, P. H., Peter, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLICE+is+predominantly+expressed+as+two+functionally+active+isoforms,+caspase-8/a+and+caspase-8/b.">FLICE is predominantly expressed as two functionally active isoforms, caspase-8/a and caspase-8/b.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 26953-26958 (1997).</li><li>Fox, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structural+analysis+of+FADD:Caspase-8+complexes+defines+the+catalytic+dimer+architecture+for+co-ordinated+control+of+cell+fate.">Cryo-EM structural analysis of FADD:Caspase-8 complexes defines the catalytic dimer architecture for co-ordinated control of cell fate.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).</li><li>Schleich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+of+the+CD95+death-inducing+signaling+complex:+experimental+and+modeling+evidence+for+a+death+effector+domain+chain+model.">Stoichiometry of the CD95 death-inducing signaling complex: experimental and modeling evidence for a death effector domain chain model.</a> Molecular Cell. 47 (2), 306-319 (2012).</li><li>Hughes, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+death-inducing+signaling+complex+reveals+a+substrate+switch+that+determines+CD95-mediated+death+or+survival.">Reconstitution of the death-inducing signaling complex reveals a substrate switch that determines CD95-mediated death or survival.</a> Molecular Cell. 35 (3), 265-279 (2009).</li><li>Lavrik, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+active+caspase-8+heterotetramer+is+formed+at+the+CD95+DISC+[2].">The active caspase-8 heterotetramer is formed at the CD95 DISC [2].</a> Cell Death and Differentiation. 10 (1), 144-145 (2003).</li><li>Hoffmann, J. C., Pappa, A., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+C-terminal+cleavage+product+of+procaspase-8,+p30,+defines+an+alternative+pathway+of+procaspase-8+activation.">A new C-terminal cleavage product of procaspase-8, p30, defines an alternative pathway of procaspase-8 activation.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (16), 4431-4440 (2009).</li><li>Golks, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+CAP3+in+CD95+signaling:+New+insights+into+the+mechanism+of+procaspase-8+activation.">The role of CAP3 in CD95 signaling: New insights into the mechanism of procaspase-8 activation.</a> Cell Death and Differentiation. 13 (3), 489-498 (2006).</li><li>Ozt&#252;rk, S., Schleich, K., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+FLICE-like+inhibitory+proteins+(c-FLIPs):+Fine-tuners+of+life+and+death+decisions.">Cellular FLICE-like inhibitory proteins (c-FLIPs): Fine-tuners of life and death decisions.</a> Experimental Cell Research. 318 (11), 1324-1331 (2012).</li><li>Golks, A., Brenner, D., Fritsch, C., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-FLIPR,+a+new+regulator+of+death+receptor-induced+apoptosis.">c-FLIPR, a new regulator of death receptor-induced apoptosis.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 14507-14513 (2005).</li><li>Hughes, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-operative+and+hierarchical+binding+of+c-FLIP+and+caspase-8:+A+unified+model+defines+how+c-FLIP+isoforms+differentially+control+cell+fate.">Co-operative and hierarchical binding of c-FLIP and caspase-8: A unified model defines how c-FLIP isoforms differentially control cell fate.</a> Molecular Cell. 61 (6), 834-849 (2016).</li><li>Hillert, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+and+short+isoforms+of+c-FLIP+act+as+control+checkpoints+of+DED+filament+assembly.">Long and short isoforms of c-FLIP act as control checkpoints of DED filament assembly.</a> Oncogene. 39 (8), 1756-1772 (2020).</li><li>Yu, J. W., Jeffrey, P. D., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+procaspase-8+activation+by+c-FLIPL.">Mechanism of procaspase-8 activation by c-FLIPL.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8169-8174 (2009).</li><li>Micheau, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long+form+of+FLIP+is+an+activator+of+caspase-8+at+the+Fas+death-inducing+signaling+complex.">The long form of FLIP is an activator of caspase-8 at the Fas death-inducing signaling complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 45162-45171 (2002).</li><li>Chang, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-FLIPL+is+a+dual+function+regulator+for+caspase-8+activation+and+CD95-mediated+apoptosis.">C-FLIPL is a dual function regulator for caspase-8 activation and CD95-mediated apoptosis.</a> EMBO Journal. 21 (14), 3704-3714 (2002).</li><li>Hillert, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+DISC+regulation+via+pharmacological+targeting+of+caspase-8/c-FLIPL+heterodimer.">Dissecting DISC regulation via pharmacological targeting of caspase-8/c-FLIPL heterodimer.</a> Cell Death and Differentiation. 27 (7), 2117-2130 (2020).</li><li>Fricker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+dissection+of+CD95+signaling+dynamics+reveals+both+a+pro-+and+antiapoptotic+role+of+c-FLIPL.">Model-based dissection of CD95 signaling dynamics reveals both a pro- and antiapoptotic role of c-FLIPL.</a> Journal of Cell Biology. 190 (3), 377-389 (2010).</li><li>Arndt, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+TCR+activation+kinetics+in+primary+human+T+cells+upon+focal+or+soluble+stimulation.">Analysis of TCR activation kinetics in primary human T cells upon focal or soluble stimulation.</a> Journal of Immunological Methods. 387 (1-2), 276-283 (2013).</li><li>Pietkiewicz, S., Eils, R., Krammer, P. H., Giese, N., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+treatment+of+CD95L+and+gemcitabine+in+pancreatic+cancer+cells+induces+apoptotic+and+RIP1-mediated+necroptotic+cell+death+network.">Combinatorial treatment of CD95L and gemcitabine in pancreatic cancer cells induces apoptotic and RIP1-mediated necroptotic cell death network.</a> Experimental Cell Research. 339 (1), 1-9 (2015).</li><li>Schleich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+DED+chains+at+the+DISC:+regulation+of+procaspase-8+activation+by+short+DED+proteins+c-FLIP+and+procaspase-8+prodomain.">Molecular architecture of the DED chains at the DISC: regulation of procaspase-8 activation by short DED proteins c-FLIP and procaspase-8 prodomain.</a> Cell Death and Differentiation. 23 (4), 681-694 (2016).</li><li>Lavrik, I. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+CD95+threshold+signaling:+Triggering+of+CD95+(FAS/APO-1)+at+low+concentrations+primarily+results+in+survival+signaling.">Analysis of CD95 threshold signaling: Triggering of CD95 (FAS/APO-1) at low concentrations primarily results in survival signaling.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13664-13671 (2007).</li><li>Sprick, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-10+is+recruited+to+and+activated+at+the+native+TRAIL+and+CD95+death-inducing+signalling+complexes+in+a+FADD-dependent+manner+but+can+not+functionally+substitute+caspase-8.">Caspase-10 is recruited to and activated at the native TRAIL and CD95 death-inducing signalling complexes in a FADD-dependent manner but can not functionally substitute caspase-8.</a> EMBO Journal. 21 (17), 4520-4530 (2002).</li><li>Neumann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+within+the+CD95+death-inducing+signaling+complex+decide+life+and+death+of+cells.">Dynamics within the CD95 death-inducing signaling complex decide life and death of cells.</a> Molecular Systems Biology. 6 (1), 352 (2010).</li><li>Kischkel, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity-dependent+APO-1+(Fas/CD95)-associated+proteins+form+a+death-inducing+signaling+complex+(DISC)+with+the+receptor.">Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor.</a> EMBO Journal. 14 (22), 5579-5588 (1995).</li><li>Seyrek, K., Richter, M., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+the+sweet+regulation+of+apoptosis:+the+role+of+glycosylation+and+galectins+in+apoptotic+signaling+pathways.">Decoding the sweet regulation of apoptosis: the role of glycosylation and galectins in apoptotic signaling pathways.</a> Cell Death and Differentiation. 26 (6), 981-993 (2019).</li><li>Kallenberger, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-+and+interdimeric+caspase-8+self-cleavage+controls+strength+and+timing+of+CD95-induced+apoptosis.">Intra- and interdimeric caspase-8 self-cleavage controls strength and timing of CD95-induced apoptosis.</a> Science Signaling. 7 (316), 23 (2014).</li></ol>

Denne tilnærmingen ble først beskrevet av Kischkel et al.27 og har blitt utviklet siden da av flere grupper. Flere viktige problemstillinger må vurderes for effektiv DISC-immunoprecipitation og overvåking caspase-8 behandling i dette komplekset.
For det første er det viktig å følge alle vasketrinn under immunoprecipitation. Spesielt viktig er de siste vasketrinnene til sepharose perler og tørking av sepharose perler. Dette må gjøres riktig for å øke signal-/...

En av de best studerte dødsreseptorene (DRs) er CD95 (Fas, APO-1). Den ekstrinsiske apoptotiske banen starter med samspillet mellom DR og konjakkligaden, det vil si at CD95L samhandler med CD95 eller TRAIL binder seg til TRAIL-Rs. Dette resulterer i dannelsen av DISC ved tilsvarende DR. DISC består av CD95, FADD, procaspase-8/-10 og c-FLIP proteiner1,2. Videre er DISC montert ved interaksjoner mellom dødsdomene (DD)-inneholdende proteiner, for eksempel CD95 og FADD, og DED-inneholdende proteiner som FADD, procaspase-8/-10 og c-FLIP (Figur 1). Procaspase-8 gjennomgår oligomerisering via assosiasjon av sine DED-er, noe som resulterer i dannelse av DED-filamenter, etterfulgt av procaspase-8 aktivering og behandling. Dette utløser en kaspasekaskade, som fører til celledød (Figur 1)3,4. Dermed er procaspase-8 en sentral initiator caspase av den ekstrinsiske apoptosebanen mediert av CD95 eller TRAIL-Rs, aktivert på den tilsvarende makromolekylære plattformen, DISC.
To isoformer av procaspase-8, nemlig procaspase-8a (p55) og -8b (p53), er kjent for å bli rekruttert til DISC5. Begge isoformene består av to DED-er. DED1 og DED2 er plassert på N-terminaldelen av procaspase-8a/b etterfulgt av katalytiske p18- og p10-domener. Detaljert kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) analyse av procaspase-8 DEDs avslørte montering av procaspase-8 proteiner i filamentøse strukturer kalt DED filamenter4,6. Bemerkelsesverdig nok ble de lineære procaspase-8-kjedene opprinnelig foreslått å være engasjert i dimeriseringen etterfulgt av procaspase-8-aktivering ved DISC. Nå er det kjent at disse kjedene bare er en understruktur av procaspase-8 DED-filamentet, sistnevnte består av tre kjeder samlet i en trippel helix3,4,6,7.
Ved dimerisering ved DED-filamentet fører konformasjonsendringer i procaspase-8a/b til dannelsen av det aktive sentrum av procaspase-8 ogaktiveringen 3,8. Dette etterfølges av procaspase-8-behandling, som formidles via to veier: den første går via genereringen av et p43 / p41 spaltingsprodukt og den andre via den første generasjonen av et p30 spaltingsprodukt. p43/p41-banen initieres av spaltingen av procaspase-8a/b ved Asp374, noe som resulterer i p43/p41- og p12-spaltingsprodukter (Figur 2). Videre er disse fragmentene automatisk katalytisk spaltet på Asp384 og Asp210/216, noe som gir opphav til dannelsen av den aktive caspase-8 heterotetramer, p102/p1829,10,11. I tillegg ble det vist at parallelt med p43/p41-behandlingsforløpet, er procaspase-8a/b også spaltet på Asp216, noe som fører til dannelsen av C-terminal spaltingsproduktet p30, etterfulgt av proteolyse til p10 og p1810 (Figur 2).
Procaspase-8a/b-aktivering ved DED-filamentet er strengt regulert av proteiner kalt c-FLIPer12. c-FLIP-proteinene forekommer i tre isoformer: c-FLIPLong (c-FLIPL), c-FLIPShort (c-FLIPS) og c-FLIPRaji (c-FLIPR). Alle tre isoformene inneholder to DED-er i N-terminalområdet. c-FLIPL har også et C-terminal katalytisk inaktivt caspase-lignende domene12,13. Både korte isoformer av c-FLIP-c-FLIPS og c-FLIPR-virker på en anti-apoptotisk måte ved å forstyrre DED-filamentformasjonen ved DISC6,14,15. I tillegg kan c-FLIPL regulere caspase-8-aktivering på en konsentrasjonsavhengig måte. Dette kan resultere i både pro- og anti-apoptotiske effekter16,17,18. Ved å danne den katalytisk aktive procaspase-8/c-FLIP L-heterodimeren, fører c-FLIPL til stabilisering av det aktive sentrum av procaspase-8 og aktiveringen. Den pro- eller anti-apoptotiske funksjonen til c-FLIPL er direkte avhengig av mengden ved DED-filamentene og den påfølgende mengden montert procaspase-8/c-FLIPL heterodimers19. Lave eller mellomliggende konsentrasjoner av c-FLIPL ved DISC resulterer i tilstrekkelige mengder procaspase-8/c-FLIP L-heterodimere ved DED-filamentet, som støtter aktivering av caspase-8. I motsetning fører økte mengder c-FLIPL direkte til sine anti-apoptotiske effekter ved DISC20.
Samlet sett er aktivering og behandling av procaspase-8a/b på DISC en svært regulert prosess som involverer flere trinn. Dette dokumentet diskuterer måling av procaspase-8-behandling direkte på DISC, samt analysen av sammensetningen av dette komplekset. Dette vil bli presentert ved hjelp av CD95 DISC som det eksemplariske DR-komplekset.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12.5% SDS gel</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td>for two separating gels: 
			3.28 mL distilled H2O 
			2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 
			4.06 mL acrylamide 
			100 &#181;L 10% SDS 
			100 &#181;L 10% APS 
			7.5 &#181;L TEMED 
			 
			for two collecting gels: 
			3.1 mL distilled H2O 
			1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 
			0.5 mL acrylamide 
			50 &#181;L 10% SDS 
			25 &#181;L 10% APS 
			7.5 &#181;L TEMED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14.5 cm cell dishes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>639160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acrylamide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A124.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-actin Ab</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2103</td>
			<td>dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-APO-1 Ab</td>
			<td>provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo</td>
			<td>ALX-805-038-C100</td>
			<td>used only for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-caspase-10 Ab</td>
			<td>Biozol</td>
			<td>MBL-M059-3</td>
			<td>dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-caspase-3 Ab</td>
			<td>cell signaling</td>
			<td>9662 S</td>
			<td>dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-caspase-8 Ab C15</td>
			<td>provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO</td>
			<td>ALX-804-242-C100</td>
			<td>dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD95 Ab</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-715</td>
			<td>dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-c-FLIP NF6 Ab</td>
			<td>provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO</td>
			<td>ALX-804-961-0100</td>
			<td>dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FADD 1C4 Ab</td>
			<td>provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO</td>
			<td>ADI-AAM-212-E</td>
			<td>dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PARP Ab</td>
			<td>cell signaling</td>
			<td>9542</td>
			<td>dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9592.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4227.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford solution 
			Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>used according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD95L</td>
			<td>provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO</td>
			<td>ALX-522-020-C005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chemoluminescence detector 
			Chem Doc XRS+</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11 836 145 001</td>
			<td>prepared according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10x) w/o Ca, Mg</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-53500</td>
			<td>dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eletrophoresis buffer</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td>10x electrophoresis buffer: 
			60.6 g Tris 
			288 g glycine 
			20 g SDS 
			ad 2 L H2O 
			1:10 dilution before usage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3908.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG1 HRP</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>1070-05</td>
			<td>dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG2b</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>1090-05</td>
			<td>dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG-HRP</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>4030-05</td>
			<td>dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin-2 Human(hIL-2)</td>
			<td>Merckgroup/ Roche</td>
			<td>11011456001</td>
			<td>for activation of T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3904.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>loading buffer 
			4x Laemmli Sample Buffer,10 mL</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0747</td>
			<td>prepared according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminata Forte Western HRP substrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBLUFO500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysis buffer</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td>13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 
			27.5 mL NaCl; 5 M 
			10 mL EDTA; 2 mM 
			100 mL Triton X-100 
			add 960 mL H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine,&#160; 2,438 g/L</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-41154</td>
			<td>adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medium for primary T cells</td>
			<td>gibco by Life Technologie</td>
			<td>21875034</td>
			<td>adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>milk powder</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T145.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P030.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3957.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td>20x PBST: 
			230 g NaCl 
			8 g KCl 
			56.8 g Na2HPO4 
			8 g KH2PO4 
			20 mL Tween-20 
			ad 2 L H2O 
			dilution 1:20 before usage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST + 5% milk</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td>50 g milk powder + 1 L PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R30852801</td>
			<td>for actavation of T ells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pac HC</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Standard All Blue</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0373</td>
			<td>use between 3-5 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A Sepharose CL-4B beads</td>
			<td>Novodirect/ Th.Geyer</td>
			<td>GE 17-0780-01</td>
			<td>affinity resin beads prepared according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scraper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4360.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shaker</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K305.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>170-4270</td>
			<td>used according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>10026938</td>
			<td>prepared according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>170-4270</td>
			<td>used according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot-Turbo</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Chem Solute</td>
			<td>8,08,51,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3051.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Pan Reac Appli Chem</td>
			<td>A4974,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring composition of cd95 death-inducing signaling complex and processing of procaspase-8 in this complex

Ekstrinsisk apoptose formidles ved aktivering av dødsreseptorer (DRs) som CD95/Fas/APO-1 eller tumornekrosefaktorrelatert apoptoseinduserende ligand (TRAIL)-reseptor 1/reseptor 2 (TRAIL-R1/R2). Stimulering av disse reseptorene med deres cognate ligander fører til montering av dødsinduserende signalkompleks (DISC). DISC består av DR, adapterproteinet Fas-assosiert protein med dødsdomene (FADD), procaspases-8/-10 og cellulære FADD-lignende interleukin (IL)-1β-konverterende enzymhemmende proteiner (c-FLIPer). DISC fungerer som en plattform for procaspase-8-behandling og aktivering. Sistnevnte skjer via dimerisering/oligomerisering i dødseffektordomenet (DED) filamenter samlet på DISC. 
Aktivering av procaspase-8 etterfølges av behandlingen, som skjer i flere trinn. I dette arbeidet beskrives en etablert eksperimentell arbeidsflyt som tillater måling av DISC-dannelse og behandling av procaspase-8 i dette komplekset. Arbeidsflyten er basert på immunoprecipitation teknikker støttet av vestlige blot analyse. Denne arbeidsflyten tillater nøye overvåking av ulike trinn i procaspase-8 rekruttering til DISC og dens behandling og er svært relevant for å undersøke molekylære mekanismer for ekstrinsisk apoptose.

For å analysere caspase-8-rekruttering til DISC og dens behandling på CD95 DISC, beskriver dette dokumentet en klassisk arbeidsflyt, som kombinerer IP av CD95 DISC med vestlig blotanalyse. Dette gjør det mulig å oppdage flere viktige funksjoner ved caspase-8-aktivering ved DISC: montering av caspase-8-aktiverende makromolekylær plattform, rekruttering av procaspase-8 til DISC, og behandling av denne initiator caspase (figur 1 og figur 2). Denne arbeidsflyte...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex at JoVE.com

Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex

Her presenteres en eksperimentell arbeidsflyt som muliggjør deteksjon av caspase-8-behandling direkte ved det dødsinduserende signalkomplekset (DISC) og bestemmer sammensetningen av dette komplekset. Denne metodikken har brede anvendelser, fra å avdekke molekylære mekanismer for celledødsveier til dynamisk modellering av apoptosenettverk.

Målesammensetning av CD95 Dødsinduserende signalkompleks og behandling av Procaspase-8 i dette komplekset

Extrinsic apoptosis is mediated by the activation of death receptors (DRs) such as CD95/Fas/APO-1 or tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ...

Apoptoseinitiering formidles ved aktivering av caspaser på markørmolekylplattformer. Vi presenterer deteksjonen av nøkkelinitieringscelledødskomplekset DISC, som fungerer som en plattform for caspase-8-aktivering. Fordelen med denne teknikken er at den tillater deteksjon av samlingen og sammensetningen av DISC-komplekset sammen med å gi informasjon om caspase-8-behandling i dette komplekset.Begynn eksperimentet med celler som er 80% til 90% sammenfallende og tilhenger av parabolen. Kast mediet og legg til friskt medium til tilhengercellene. Stimulere deretter cellene med den valgte konsentrasjonen av CD95L ved å holde platen i en vinkel og pipettere liganden inn i mediet uten å berøre de tilhørende cellene.For å høste cellene, plasser celleretten på is. Tilsett 10 milliliter kald PBS i celleopphenget og skrap de vedlagte cellene av platen. Samle cellefjæringen i et 50 milliliterrør.Vask cellefatet med 10 milliliter kald PBS to ganger og tilsett vaskeoppløsningen i samme 50 milliliterrør. Sentrifuger deretter cellefjæringen ved 500 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius. Etter å ha kastet supernatanten, resuspend cellepellet i en milliliter kald PBS.Overfør deretter cellefjæringen til et 1,5 milliliterrør. Sentrifuger cellefjæringen og resuspender cellepelleten i en milliliter kald PBS igjen. Gjenta sentrifugeringen igjen, og resuspender deretter cellepellet i en milliliter lysisbuffer og inkuber den i 30 minutter på is.Etter inkubasjon, sentrifuger lysatet med maksimal hastighet i 15 minutter ved fire grader Celsius, og overfør deretter supernatanten til et rent rør. Kast pelletsen og samle en 50 mikroliterprøve av lysatet i et annet rør for å bestemme proteinkonsentrasjonen. For immunrecipitation, tilsett to mikroliter anti-APO1 antistoff og 10 mikroliter av tilberedt Protein A Sepharose perler til lysatet.Tilsett 10 mikroliter av perlene alene til et eget rør som inneholder lysatet for å fungere som en perlekontroll. Inkuber blandingen som inneholder lysatet, antistoffene og Protein A Sepharose perler over natten ved fire grader Celsius med skånsom blanding. Neste dag sentrifugerer du blandingen ved 500 ganger G i fire minutter ved fire grader Celsius.Etter å ha kastet supernatanten, vask perlene ved å legge til en milliliter kald PBS og kast supernatanten etter sentrifugering. Gjenta dette trinnet minst tre ganger. Etter å ha kastet den siste PBS-vasken, aspirer perlene helst med en 50 mikroliter Hamilton-sprøyte.For å utføre den vestlige blotten, legg til 20 mikroliter 4X lastebuffer til perlene og varme ved 95 grader Celsius i 10 minutter. Varm samtidig lysatekontrollene ved 95 grader Celsius i fem minutter. Last lysates, immunoprecipitants og en proteinstandard på en 12,5% SDS gel og kjør med en konstant spenning på 80 volt.Etter at gelløpet er fullført, overfør proteinene fra SDS gel til en nitrocellulosemembran. Etter at overføringen er fullført, plasser den flekkete membranen i en boks og inkuber den i en time i blokkeringsløsning under mild agitasjon, og vask deretter membranen tre ganger i fem minutter med PBST. For å oppdage proteinene, legg til det første primære antistoffet ved den angitte fortynning til membranen og inkuber det over natten ved fire grader Celsius med mild agitasjon.Neste dag, vask membranen med tre fem minutters PBST-vasker, og inkuber deretter membranen med 20 milliliter sekundært antistoff med forsiktig risting i en time ved romtemperatur. Vask membranen tre ganger med PBST igjen. Etter å ha kastet den siste PBST-vasken, tilsett omtrent en milliliter pepperrotperoksidase substrat til membranen og oppdag kjemoluminescenssignalet.Stimulering av livmorhalskreft HeLa-CD95 celler med CD95L resulterte i et høyt nivå av CD95 DISC formasjon overvåket via CD95 immunoprecipitation. CD95, FADD, procaspase-8, procaspase-10 og c-FLIPS ble observert i disse CD95 immunoprecipitations som indikerer effektiv DISC-dannelse. Spaltningsproduktene p43-FLIP og p22-FLIP ble påvist i immunoprecipitations, noe som indikerer caspase-8-aktivering.HeLa-CD95 celler som over-express c-FLIP lang ble brukt til analyse av CD95 DISC formasjon. I likhet med foreldre HeLa-CD95 celler, ingen rekruttering av FADD, procaspase-9, procaspase-10, c-FLIP proteiner, og PARP1 ble oppdaget i immunoprecipitations fra disse cellene uten CD95L behandling. Aktiverte primære T-celler var preget av høye nivåer av CD95, FADD, procaspase-8, procaspase-10 og c-FLIPS i anti-CD95 immunoprecipitations.Denne teknikken tillater analyse av molekylær DISC-dannelse, inkludert behandling av caspase-8 ved DISC. Alle vasketrinn er veldig viktige. I tillegg bør stimuleringspunkter og inkubasjonstider tas på alvor.Dette er den eneste måten å måle monteringen på DISC-komplekset på. For å måle caspase-8-aktivering kan man imidlertid også implementere caspase-8 aktivitetsanalyser. Denne tilnærmingen tillot oss å få ny innsikt i apoptoseinitiering.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture fra Cryomilled pattedyrceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

En metode for å måle metabolismen i sortert subpopulasjoner av komplekse Cell Communities Bruke stabile isotoper Tracing

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

Utarbeidelse av Giant vesikler innkapsle mikrosfære ved sentrifugering av en vann-i-olje emulsjon

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Måling av G-proteinkoblet reseptor-signalering via radiomerket GTP-binding

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

Et modifisert gjær-ett hybrid system for Heteromer Proteinkompleks-DNA-interaksjonsstudier

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biokjemiske og strukturelle karakteristikk av karbohydrater Transport substrat-binding-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Toeprinting analyse av oversettelse innvielsen komplekse formasjon på pattedyr mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Strategisk screening og karakterisering av Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for vellykket krystallisering

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Krystallisering og strukturell bestemmelse av et enzym:Substrat kompleks av seriell krystallografi i en allsidig mikrofluidisk chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads

Komplementering av skjøteaktivitet av et Galectin-3 - U1 snRNP-kompleks på perler

Classic depletion-reconstitution experiments indicate that galectin-3 is a required splicing factor in nuclear extracts. The mechanism of incorporation of ...