Name: measuring composition of cd95 death-inducing signaling complex and processing of procaspase-8 in this complex
Uploaded: 2021-08-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex at JoVE.com

Çalışmalarımızı desteklediği için AB programı ERDF (Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu) ve DFG (LA 2386) tarafından finanse edilen Wilhelm Sander Vakfı (2017.008.02), Dinamik Sistemler Merkezi 'ni (CDS) kabul ediyoruz. Karina Guttek'e deneylerimizi desteklediği için teşekkür ederiz. Prof. Dirk Reinhold'u (OvGU, Magdeburg) bize birincil T hücreleri sağladığı için kabul ediyoruz.

T hücre deneyleri 42502-2-1273 Uni MD etik anlaşmasına göre gerçekleştirilmiştir.
1. Deney için hücrelerin hazırlanması
NOT: Bu immün önkseçasyon için ortalama hücre sayısı 1 × 107'dir. Yapışan hücrelerin deneyden bir gün önce tohumlanması gerekir, böylece deney gününde 1 ×10 7 hücre vardır.
<ol><li>Yapışan hücreleri deneye hazırlama<ol>
<li>Tohum 5-8 ×10 6 yapışan hücre 20 mL orta ...

<ol>
	<li>Lavrik, I. N., Krammer, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+CD95/Fas+signaling+at+the+DISC.">Regulation of CD95/Fas signaling at the DISC.</a> Cell Death and Differentiation. 19 (1), 36-41 (2012).</li><li>Krammer, P. H., Arnold, R., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+and+death+in+peripheral+T+cells.">Life and death in peripheral T cells.</a> Nature Reviews Immunology. 7 (7), 532-542 (2007).</li><li>Dickens, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+death+effector+domain+chain+DISC+model+reveals+a+crucial+role+for+caspase-8+chain+assembly+in+mediating+apoptotic+cell+death.">A death effector domain chain DISC model reveals a crucial role for caspase-8 chain assembly in mediating apoptotic cell death.</a> Molecular Cell. 47 (2), 291-305 (2012).</li><li>Fu, T. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+caspase-8+tandem+DED+filament+reveals+assembly+and+regulation+mechanisms+of+the+death-inducing+signaling+complex.">Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex.</a> Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).</li><li>Scaffidi, C., Medema, J. P., Krammer, P. H., Peter, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLICE+is+predominantly+expressed+as+two+functionally+active+isoforms,+caspase-8/a+and+caspase-8/b.">FLICE is predominantly expressed as two functionally active isoforms, caspase-8/a and caspase-8/b.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 26953-26958 (1997).</li><li>Fox, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structural+analysis+of+FADD:Caspase-8+complexes+defines+the+catalytic+dimer+architecture+for+co-ordinated+control+of+cell+fate.">Cryo-EM structural analysis of FADD:Caspase-8 complexes defines the catalytic dimer architecture for co-ordinated control of cell fate.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).</li><li>Schleich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+of+the+CD95+death-inducing+signaling+complex:+experimental+and+modeling+evidence+for+a+death+effector+domain+chain+model.">Stoichiometry of the CD95 death-inducing signaling complex: experimental and modeling evidence for a death effector domain chain model.</a> Molecular Cell. 47 (2), 306-319 (2012).</li><li>Hughes, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+death-inducing+signaling+complex+reveals+a+substrate+switch+that+determines+CD95-mediated+death+or+survival.">Reconstitution of the death-inducing signaling complex reveals a substrate switch that determines CD95-mediated death or survival.</a> Molecular Cell. 35 (3), 265-279 (2009).</li><li>Lavrik, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+active+caspase-8+heterotetramer+is+formed+at+the+CD95+DISC+[2].">The active caspase-8 heterotetramer is formed at the CD95 DISC [2].</a> Cell Death and Differentiation. 10 (1), 144-145 (2003).</li><li>Hoffmann, J. C., Pappa, A., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+C-terminal+cleavage+product+of+procaspase-8,+p30,+defines+an+alternative+pathway+of+procaspase-8+activation.">A new C-terminal cleavage product of procaspase-8, p30, defines an alternative pathway of procaspase-8 activation.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (16), 4431-4440 (2009).</li><li>Golks, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+CAP3+in+CD95+signaling:+New+insights+into+the+mechanism+of+procaspase-8+activation.">The role of CAP3 in CD95 signaling: New insights into the mechanism of procaspase-8 activation.</a> Cell Death and Differentiation. 13 (3), 489-498 (2006).</li><li>Ozt&#252;rk, S., Schleich, K., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+FLICE-like+inhibitory+proteins+(c-FLIPs):+Fine-tuners+of+life+and+death+decisions.">Cellular FLICE-like inhibitory proteins (c-FLIPs): Fine-tuners of life and death decisions.</a> Experimental Cell Research. 318 (11), 1324-1331 (2012).</li><li>Golks, A., Brenner, D., Fritsch, C., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-FLIPR,+a+new+regulator+of+death+receptor-induced+apoptosis.">c-FLIPR, a new regulator of death receptor-induced apoptosis.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 14507-14513 (2005).</li><li>Hughes, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-operative+and+hierarchical+binding+of+c-FLIP+and+caspase-8:+A+unified+model+defines+how+c-FLIP+isoforms+differentially+control+cell+fate.">Co-operative and hierarchical binding of c-FLIP and caspase-8: A unified model defines how c-FLIP isoforms differentially control cell fate.</a> Molecular Cell. 61 (6), 834-849 (2016).</li><li>Hillert, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+and+short+isoforms+of+c-FLIP+act+as+control+checkpoints+of+DED+filament+assembly.">Long and short isoforms of c-FLIP act as control checkpoints of DED filament assembly.</a> Oncogene. 39 (8), 1756-1772 (2020).</li><li>Yu, J. W., Jeffrey, P. D., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+procaspase-8+activation+by+c-FLIPL.">Mechanism of procaspase-8 activation by c-FLIPL.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8169-8174 (2009).</li><li>Micheau, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long+form+of+FLIP+is+an+activator+of+caspase-8+at+the+Fas+death-inducing+signaling+complex.">The long form of FLIP is an activator of caspase-8 at the Fas death-inducing signaling complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 45162-45171 (2002).</li><li>Chang, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-FLIPL+is+a+dual+function+regulator+for+caspase-8+activation+and+CD95-mediated+apoptosis.">C-FLIPL is a dual function regulator for caspase-8 activation and CD95-mediated apoptosis.</a> EMBO Journal. 21 (14), 3704-3714 (2002).</li><li>Hillert, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+DISC+regulation+via+pharmacological+targeting+of+caspase-8/c-FLIPL+heterodimer.">Dissecting DISC regulation via pharmacological targeting of caspase-8/c-FLIPL heterodimer.</a> Cell Death and Differentiation. 27 (7), 2117-2130 (2020).</li><li>Fricker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+dissection+of+CD95+signaling+dynamics+reveals+both+a+pro-+and+antiapoptotic+role+of+c-FLIPL.">Model-based dissection of CD95 signaling dynamics reveals both a pro- and antiapoptotic role of c-FLIPL.</a> Journal of Cell Biology. 190 (3), 377-389 (2010).</li><li>Arndt, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+TCR+activation+kinetics+in+primary+human+T+cells+upon+focal+or+soluble+stimulation.">Analysis of TCR activation kinetics in primary human T cells upon focal or soluble stimulation.</a> Journal of Immunological Methods. 387 (1-2), 276-283 (2013).</li><li>Pietkiewicz, S., Eils, R., Krammer, P. H., Giese, N., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+treatment+of+CD95L+and+gemcitabine+in+pancreatic+cancer+cells+induces+apoptotic+and+RIP1-mediated+necroptotic+cell+death+network.">Combinatorial treatment of CD95L and gemcitabine in pancreatic cancer cells induces apoptotic and RIP1-mediated necroptotic cell death network.</a> Experimental Cell Research. 339 (1), 1-9 (2015).</li><li>Schleich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+DED+chains+at+the+DISC:+regulation+of+procaspase-8+activation+by+short+DED+proteins+c-FLIP+and+procaspase-8+prodomain.">Molecular architecture of the DED chains at the DISC: regulation of procaspase-8 activation by short DED proteins c-FLIP and procaspase-8 prodomain.</a> Cell Death and Differentiation. 23 (4), 681-694 (2016).</li><li>Lavrik, I. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+CD95+threshold+signaling:+Triggering+of+CD95+(FAS/APO-1)+at+low+concentrations+primarily+results+in+survival+signaling.">Analysis of CD95 threshold signaling: Triggering of CD95 (FAS/APO-1) at low concentrations primarily results in survival signaling.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13664-13671 (2007).</li><li>Sprick, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-10+is+recruited+to+and+activated+at+the+native+TRAIL+and+CD95+death-inducing+signalling+complexes+in+a+FADD-dependent+manner+but+can+not+functionally+substitute+caspase-8.">Caspase-10 is recruited to and activated at the native TRAIL and CD95 death-inducing signalling complexes in a FADD-dependent manner but can not functionally substitute caspase-8.</a> EMBO Journal. 21 (17), 4520-4530 (2002).</li><li>Neumann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+within+the+CD95+death-inducing+signaling+complex+decide+life+and+death+of+cells.">Dynamics within the CD95 death-inducing signaling complex decide life and death of cells.</a> Molecular Systems Biology. 6 (1), 352 (2010).</li><li>Kischkel, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity-dependent+APO-1+(Fas/CD95)-associated+proteins+form+a+death-inducing+signaling+complex+(DISC)+with+the+receptor.">Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor.</a> EMBO Journal. 14 (22), 5579-5588 (1995).</li><li>Seyrek, K., Richter, M., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+the+sweet+regulation+of+apoptosis:+the+role+of+glycosylation+and+galectins+in+apoptotic+signaling+pathways.">Decoding the sweet regulation of apoptosis: the role of glycosylation and galectins in apoptotic signaling pathways.</a> Cell Death and Differentiation. 26 (6), 981-993 (2019).</li><li>Kallenberger, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-+and+interdimeric+caspase-8+self-cleavage+controls+strength+and+timing+of+CD95-induced+apoptosis.">Intra- and interdimeric caspase-8 self-cleavage controls strength and timing of CD95-induced apoptosis.</a> Science Signaling. 7 (316), 23 (2014).</li></ol>

Bu yaklaşım ilk olarak Kischkel ve ark.27 tarafından tanımlanmıştır ve o zamandan beri birkaç grup tarafından başarıyla geliştirilmiştir. Bu komplekste etkili DISC-immün önsepitasyon ve izleme kaspaz-8 işleme için birkaç önemli konu göz önünde bulundurulmalıdır.
İlk olarak, immün önseçme sırasında tüm yıkama adımlarını takip etmek önemlidir. Özellikle önemli olan sepharose boncuklarının son yıkama adımları ve sepharose boncukla...

En iyi çalışılan ölüm reseptörlerinden (DR) biri CD95'tir (Fas, APO-1). Dışsal apoptotik yol, DR'nin konyak ligand ile etkileşimi ile başlar, yani CD95L, CD95 veya TRAIL-Rs'ye bağlanır. Bu, ilgili DR. DISC'de DİSK oluşumu ile sonuçlanır CD95, FADD, procaspaz-8/-10 ve c-FLIP proteinleri1,2'den oluşur. Ayrıca, DISC, CD95 ve FADD gibi ölüm alanı (DD) içeren proteinler ile FADD, procaspase-8/-10 ve c-FLIP gibi DED içeren proteinler arasındaki etkileşimlerle bir araya getirilir (Şekil 1). Procaspase-8, DED'lerinin ilişkilendirilmesi yoluyla oligomerizasyondan geçer, bu da DED filamentlerinin oluşumuna ve ardından prokaspaz-8 aktivasyonu ve işlenmesine neden olarak ortaya çıkır. Bu, hücre ölümüne yol açan bir kaspaz kaskad tetikler (Şekil 1)3,4. Bu nedenle, prokaspaz-8, ILGILI makromoleküler platform DISC'de etkinleştirilen CD95 veya TRAIL-Rs tarafından aracılık edilen dış apoptoz yolunun merkezi bir başlatıcı kaspazıdır.
İki procaspase-8 izoformunun, yani procaspase-8a (p55) ve -8b 'nin (p53), DISC5'ealındığı bilinmektedir. Her iki izoform da iki DED'den oluşur. DED1 ve DED2, prokaspaz-8a/b'nın N-terminal kısmında ve ardından katalitik p18 ve p10 etki alanlarında bulunur. Prokaspaz-8 DED'lerin detaylı kriyo-elektron mikroskopisi (kriyo-EM) analizi, prokaspaz-8 proteinlerinin DED filamentleri4,6adı verilen filamentli yapılara bir araya topladığını ortaya koydu. Dikkat çekici bir şekilde, doğrusal prokaspaz-8 zincirlerinin başlangıçta dimerizasyon ve ardından DISC'de prokaspaz-8 aktivasyonu ile meşgul olduğu öne sürüldü. Şimdi, bu zincirlerin prokaspaz-8 DED filamentinin sadece bir alt yapısı olduğu bilinmektedir, ikincisi üçlü sarmal3, 4,6,7içine monte edilmiş üç zincirden oluşur.
DED filamentinde küçültme üzerine, prokaspaz-8a/b'daki konformasyonel değişiklikler prokaspaz-8'in aktif merkezinin oluşumuna ve aktivasyonuna yol açar3,8. Bunu, iki yoldan aracılık edilen procaspase-8 işleme takip eder: birincisi bir p43 / p41 dekolte ürününün üretimi ve ikincisi bir p30 dekolte ürününün ilk neslinden geçer. p43/p41 yolu, Asp374'te prokaspaz-8a/b'nın bölünmesiyle başlatılır ve p43/p41 ve p12 bölünme ürünleriyle sonuçlanır (Şekil 2). Ayrıca, bu parçalar Asp384 ve Asp210/216'da otomatik olarak bölünür ve aktif kaspaz-8 heterotetramer, p102/p18 29,10,11oluşumuna neden olarak. Ek olarak, p43/p41 işleme yoluna paralel olarak, Procaspase-8a/b'nın da Asp216'da bölündlüğü, bu da C-terminal bölünme ürünü p30'un oluşumuna yol açar, ardından proteolizi p10 ve p1810'a (Şekil 2).
DED filamentinde procaspase-8a/b aktivasyonu kesinlikle c-FLIPs12adlı proteinler tarafından düzenlenir. c-FLIP proteinleri üç izoformda oluşur: c-FLIPLong (c-FLIPL),c-FLIPShort (c-FLIPS)ve c-FLIPRaji (c-FLIPR). Her üç izoform da N-terminal bölgelerinde iki DED içerir. c-FLIPL ayrıca C-terminal katalitik olarak aktif olmayan kaspaz benzeri etki alanı12,13 'esahiptir. C-FLIP-c-FLIPS ve c-FLIPR'ninher iki kısa izoformu da DISC6, 14,15'teDED filament oluşumunu bozarak anti-apoptotik bir şekilde hareket eder. Ek olarak, c-FLIPL kaspaz-8 aktivasyonunu konsantrasyona bağlı bir şekilde düzenleyebilir. Bu hem pro- hem de anti-apoptotik etkilere neden olabilir16,17,18. Katalitik olarak aktif prokaspaz-8/c-FLIPL heterodimerini oluşturan c-FLIPL, prokaspaz-8'in aktif merkezinin stabilizasyonuna ve aktivasyonuna yol açar. c-FLIPL'nin pro-veya anti-apoptotik işlevi doğrudan DED filamentlerindeki miktarına ve sonraki monte edilmiş prokaspaz-8/c-FLIPL heterodimers19miktarına bağlıdır. DISC'deki düşük veya ara c-FLIPL konsantrasyonları, kaspaz-8'in aktivasyonunu destekleyen DED filamentinde yeterli miktarda prokaspaz-8/c-FLIPL heterodimer ile sonuçlanır. Buna karşılık, artan c-FLIPL miktarları doğrudan DISC20'deanti-apoptotik etkilerine yol açar.
Birlikte ele alındığında, DISC'de procaspase-8a/b'nın etkinleştirilmesi ve işlenmesi, birkaç adımı içeren son derece düzenlenmiş bir süreçtir. Bu makalede, prokaspaz-8 işleminin doğrudan DISC'de ölçülmesi ve bu kompleksin bileşiminin analizi tartışılmaktadır. Bu, örnek DR kompleksi olarak CD95 DISC kullanılarak sunulacaktır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12.5% SDS gel</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td>for two separating gels: 
			3.28 mL distilled H2O 
			2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 
			4.06 mL acrylamide 
			100 &#181;L 10% SDS 
			100 &#181;L 10% APS 
			7.5 &#181;L TEMED 
			 
			for two collecting gels: 
			3.1 mL distilled H2O 
			1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 
			0.5 mL acrylamide 
			50 &#181;L 10% SDS 
			25 &#181;L 10% APS 
			7.5 &#181;L TEMED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14.5 cm cell dishes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>639160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acrylamide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A124.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-actin Ab</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2103</td>
			<td>dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-APO-1 Ab</td>
			<td>provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo</td>
			<td>ALX-805-038-C100</td>
			<td>used only for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-caspase-10 Ab</td>
			<td>Biozol</td>
			<td>MBL-M059-3</td>
			<td>dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-caspase-3 Ab</td>
			<td>cell signaling</td>
			<td>9662 S</td>
			<td>dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-caspase-8 Ab C15</td>
			<td>provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO</td>
			<td>ALX-804-242-C100</td>
			<td>dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD95 Ab</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-715</td>
			<td>dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-c-FLIP NF6 Ab</td>
			<td>provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO</td>
			<td>ALX-804-961-0100</td>
			<td>dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FADD 1C4 Ab</td>
			<td>provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO</td>
			<td>ADI-AAM-212-E</td>
			<td>dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PARP Ab</td>
			<td>cell signaling</td>
			<td>9542</td>
			<td>dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9592.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4227.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford solution 
			Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>used according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD95L</td>
			<td>provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO</td>
			<td>ALX-522-020-C005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chemoluminescence detector 
			Chem Doc XRS+</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11 836 145 001</td>
			<td>prepared according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10x) w/o Ca, Mg</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-53500</td>
			<td>dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eletrophoresis buffer</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td>10x electrophoresis buffer: 
			60.6 g Tris 
			288 g glycine 
			20 g SDS 
			ad 2 L H2O 
			1:10 dilution before usage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3908.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG1 HRP</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>1070-05</td>
			<td>dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG2b</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>1090-05</td>
			<td>dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG-HRP</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>4030-05</td>
			<td>dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin-2 Human(hIL-2)</td>
			<td>Merckgroup/ Roche</td>
			<td>11011456001</td>
			<td>for activation of T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3904.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>loading buffer 
			4x Laemmli Sample Buffer,10 mL</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0747</td>
			<td>prepared according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminata Forte Western HRP substrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBLUFO500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysis buffer</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td>13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 
			27.5 mL NaCl; 5 M 
			10 mL EDTA; 2 mM 
			100 mL Triton X-100 
			add 960 mL H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine,&#160; 2,438 g/L</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-41154</td>
			<td>adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medium for primary T cells</td>
			<td>gibco by Life Technologie</td>
			<td>21875034</td>
			<td>adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>milk powder</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T145.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P030.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3957.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td>20x PBST: 
			230 g NaCl 
			8 g KCl 
			56.8 g Na2HPO4 
			8 g KH2PO4 
			20 mL Tween-20 
			ad 2 L H2O 
			dilution 1:20 before usage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST + 5% milk</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td>50 g milk powder + 1 L PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R30852801</td>
			<td>for actavation of T ells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pac HC</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Standard All Blue</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0373</td>
			<td>use between 3-5 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A Sepharose CL-4B beads</td>
			<td>Novodirect/ Th.Geyer</td>
			<td>GE 17-0780-01</td>
			<td>affinity resin beads prepared according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scraper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4360.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shaker</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K305.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>170-4270</td>
			<td>used according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>10026938</td>
			<td>prepared according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>170-4270</td>
			<td>used according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot-Turbo</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Chem Solute</td>
			<td>8,08,51,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3051.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Pan Reac Appli Chem</td>
			<td>A4974,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring composition of cd95 death-inducing signaling complex and processing of procaspase-8 in this complex

Dış apoptoz, CD95/Fas/APO-1 veya tümör nekroz faktörüne bağlı apoptoz indükleyici ligand (TRAIL)-reseptör 1/reseptör 2 (TRAIL-R1/R2) gibi ölüm reseptörlerinin (DR) aktivasyonu ile aracılık eder. Bu reseptörlerin konyak ligandları ile uyarılması, ölüme neden olan sinyal kompleksinin (DISC) montajına yol açar. DISC, ölüm etki alanı (FADD), prokaspazlar-8/-10 ve hücresel FADD benzeri interlökin (IL)-1β dönüştürücü enzim inhibitör proteinleri (c-FLIP'ler) ile Fas ilişkili protein olan DR'den oluşur. DISC, procaspase-8 işleme ve etkinleştirme için bir platform görevi görür. İkincisi, DISC'de bir araya getirilen ölüm efektörü etki alanı (DED) filamentlerinde küçültme/oligomerizasyon yoluyla gerçekleşir. 
Procaspase-8'in aktivasyonu, birkaç adımda gerçekleşen işlenmesi ile takip edilir. Bu çalışmada, bu komplekste DISC oluşumunun ölçülmesine ve procaspaz-8'in işlenmesine olanak sağlayan yerleşik bir deneysel iş akışı açıklanmaktadır. İş akışı, batı blot analizi tarafından desteklenen immün önksepitasyon tekniklerine dayanmaktadır. Bu iş akışı, DISC'ye prokaspaz-8 işe alımının farklı adımlarının ve işlenmesinin dikkatli bir şekilde izlenmesine izin verir ve dışsal apoptozun moleküler mekanizmalarını araştırmak için son derece önemlidir.

Diske caspase-8 işe alımını ve CD95 DISC'deki işlenmesini analiz etmek için, bu makalede CD95 DISC'nin IP'sini batı blot analiziyle birleştiren klasik bir iş akışı açıklanmaktadır. Bu, DISC'de caspase-8 aktivasyonunun birkaç temel özelliğin algılanmasını sağlar: caspase-8-aktive edici makromoleküler platformun montajı, DISC'ye procaspase-8'in işe alınması ve bu başlatıcı caspazın işlenmesi (Şekil 1 ve Şekil 2). Bu iş akışı, ...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex at JoVE.com

Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex

Burada, doğrudan ölüme neden olan sinyal kompleksinde (DISC) caspase-8 işlemenin algılanmasını sağlayan ve bu kompleksin bileşimini belirleyen deneysel bir iş akışı sunulmaktadır. Bu metodoloji, hücre ölüm yollarının moleküler mekanizmalarının çözülmesinden apoptoz ağlarının dinamik modellemesine kadar geniş uygulamalara sahiptir.

CD95 Ölüme Neden Olan SinyalIzasyon Kompleksinin Bileşiminin Ölçülmesi ve Procaspase-8'in Bu Komplekste İşleniş

Extrinsic apoptosis is mediated by the activation of death receptors (DRs) such as CD95/Fas/APO-1 or tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ...

Apoptozun başlatılması, marker moleküler platformlarda kaspazların aktivasyonu ile aracılık eder. Caspase-8 aktivasyonu için bir platform görevi gören anahtar başlatma hücre ölüm kompleksi DISC'nin tespitini sunuyoruz. Bu tekniğin avantajı, bu komplekste kaspaz-8 işleme hakkında bilgi sağlamanın yanı sıra montajın ve DISC kompleksinin bileşiminin algılanmasını sağlamasıdır.Deneye% 80 ila% 90 birleştiği ve çanağa yapışan hücrelerle başlayın. Ortamı atın ve yapışık hücrelere taze ortam ekleyin. Daha sonra plakayı bir açıyla tutarak ve ligand'ı yapışık hücrelere dokunmadan ortama pipetleyerek hücreleri seçilen CD95L konsantrasyonu ile uyarın.Hücreleri toplamak için hücre kabını buza yerleştirin. Hücre süspansiyonu içine 10 mililitre soğuk PBS ekleyin ve ekli hücreleri plakadan kazıyın. Hücre süspansiyonu 50 mililitrelik bir tüpte toplayın.Hücre kabını 10 mililitre soğuk PBS ile iki kez yıkayın ve yıkama çözeltisini aynı 50 mililitrelik tüpe ekleyin. Daha sonra hücre süspansiyonu 500 kez G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Üstnatant attıktan sonra, hücre peletini bir mililitre soğuk PBS'de yeniden depola.Daha sonra hücre süspansiyonu 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücre süspansiyonu santrifüj ve tekrar soğuk PBS bir mililitre hücre pelet resuspend. Santrifüjü bir kez daha tekrarlayın, ardından hücre peletini bir mililitrelik lizis tamponunda yeniden ıslatın ve buzda 30 dakika kuluçkaya bırakın.Kuluçkadan sonra, lisatı dört santigrat derecede 15 dakika boyunca maksimum hızda santrifüjleyin, ardından süpernatantı temiz bir tüpe aktarın. Peletin atılması ve protein konsantrasyonunun belirlenmesi için başka bir tüpte 50 mikroliterlik bir lysate örneği toplayın. İmmün önkseçim için, iki mikrolitre anti-APO1 antikoru ve 10 mikrolitre hazırlanmış Protein A Sepharose boncuklarını lisate ekleyin.Boncuk kontrolü görevi görmek için lysate içeren ayrı bir tüpe sadece boncukların 10 mikrolitresini ekleyin. Lysate, antikorlar ve Protein A Sepharose boncuklarını içeren karışımı hafif karıştırma ile dört santigrat derecede bir gecede kuluçkaya bırakın. Ertesi gün, karışımı dört santigrat derecede dört dakika boyunca 500 kez G'de santrifüjleyin.Süpernatantı attıktan sonra, bir mililitre soğuk PBS ekleyerek ve santrifüjü takiben süpernatantı atarak boncukları yıkayın. Bu adımı en az üç kez tekrarlayın. Son PBS yıkamayı attıktan sonra, boncukları tercihen 50 mikroliter Hamilton şırıngası ile aspire edin.Batı lekesini gerçekleştirmek için boncuklara 20 mikrolitre 4X yükleme tamponu ekleyin ve 10 dakika boyunca 95 santigrat derecede ısıtın. Aynı anda, lisat kontrollerini 95 santigrat derecede beş dakika ısıtın. Lysates, immün önkupitantlar ve bir protein standardını %12,5 SDS jeline yükleyin ve 80 volt sabit voltajla çalıştırın.Jel çalışması tamamlandıktan sonra, proteinleri SDS jelinden nitroselüloz bir zara aktarın. Aktarım tamamlandıktan sonra, şişmiş zarı bir kutuya yerleştirin ve nazik ajitasyon altında blokaj çözeltisinde bir saat kuluçkaya yatırın, ardından membranı PBST ile beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Proteinleri tespit etmek için, belirtilen seyreltmedeki ilk birincil antikoru zara ekleyin ve hafif ajitasyonla dört santigrat derecede bir gecede kuluçkaya bırakın.Ertesi gün, zarı üç beş dakikalık PBST yıkama ile yıkayın, ardından membranı oda sıcaklığında bir saat boyunca hafifçe sallanarak 20 mililitre ikincil antikorla kuluçkaya yatırın. Membranı pbst ile tekrar üç kez yıkayın. Son PBST yıkamasını attıktan sonra, zara yaklaşık bir mililitre yaban turpu peroksidaz substratı ekleyin ve kemomünsans sinyalini algılayın.Serviks kanseri HeLa-CD95 hücrelerinin CD95L ile uyarılması, CD95 immün önkekipitasyon yoluyla izlenen yüksek düzeyde CD95 DISC oluşumuna neden oldu. Bu CD95 immünopipitasyonlarında etkili DISC oluşumunu gösteren CD95, FADD, procaspase-8, procaspase-10 ve c-FLIPS gözlenmiştir. İmmün önkupitasyonlarda p43-FLIP ve p22-FLIP'in kaspaz-8 aktivasyonunu gösteren dekolteli ürünleri tespit edildi.CD95 DISC oluşumunun analizi için c-FLIP uzun uzun uzun ifade eden HeLa-CD95 hücreleri kullanılmıştır. Ebeveyn HeLa-CD95 hücrelerine benzer şekilde, CD95L tedavisi olmayan bu hücrelerden immün önkupitasyonlarda FADD, procaspase-9, procaspase-10, c-FLIP proteinleri ve PARP1 alımı saptanmamıştır. Aktif primer T hücreleri anti-CD95 immünöteniasyonlarda yüksek düzeyde CD95, FADD, procaspase-8, procaspase-10 ve c-FLIPS ile karakterize edildi.Bu teknik, DISC'de caspase-8'in işlenmesi de dahil olmak üzere moleküler DISC oluşumunun analizini sağlar. Tüm yıkama adımları çok önemlidir. Ayrıca stimülasyon noktaları ve kuluçka süreleri de ciddiye alınmalıdır.Disc kompleksindeki derlemeyi ölçmenin tek yolu budur. Bununla birlikte, caspase-8 aktivasyonunu ölçmek için, caspase-8 aktivite tahlilleri de uygulanabilir. Bu yaklaşım, apoptozun başlatılması hakkında yeni içgörüler elde etmemizi sağladı.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Cryomilled memeli hücrelerinden protein kompleksi olan ele geçirme kapasitesini

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

Kararlı İzotop izlemeyi kullanma Kompleks Hücre Toplulukları Sıralama alt popülasyonlar Metabolizma Ölçme Bir Yöntem

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

bir su-içinde-yağ emülsiyonu santrifüj Dev veziküller Kapsüllenen Mikrokürelerin hazırlanması

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Radyo-etiketli GTP Bağlanması vasıtasıyla G-protein ile birleşmiş Reseptör Sinyalizasyonunun Ölçümü

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

Heteromerik Protein Kompleksi-DNA Etkileşim Çalışmaları İçin Modifiye Maya-Bir Hibrid Sistem

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Karbonhidrat taşıma substrat-bağlayıcı-protein SP0092 biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonu

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Çeviri başlatma karmaşık oluşumu memeli mRNA'ların Toeprinting analizi

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Başarılı Kristalizasyon Için Görsel GPCR-mini-G Protein Sinyal Kompleksi Stratejik Tarama ve Karakterizasyonu

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Çok Yönlü Bir Mikroakışkan Çipte Seri Kristalografi ile Bir Enzim:Substrat Kompleksinin Kristalizasyonu ve Yapısal Belirlenmesi

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads

Boncuklar Üzerinde Galectin-3 - U1 snRNP Kompleksi ile Birleştirme Etkinliğinin Tamamlayıcısı

Classic depletion-reconstitution experiments indicate that galectin-3 is a required splicing factor in nuclear extracts. The mechanism of incorporation of ...