Name: transposon-insertion sequencing as a tool to elucidate bacterial colonization factors in a burkholderia gladioli symbiont of lagria villosa beetles
Uploaded: 2021-08-12T15:00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles at JoVE.co

نحن ممتنون لجونبوم لي لتوفير سلالة E. coli WM3064 + pRL27 للتقتران والتوجيه في الإجراء ، كاثرين هوفماير للمساعدة في استكشاف الأخطاء وإصلاحها خلال توليد مكتبة متحولة ، والبروفيسور أندريه رودريغز لدعم جمع الحشرات والحصول على تصريح. كما نشكر ريبيكا جانكي وداغمار كليبش على دعمهما في جمع وتربية الحشرات. نعترف بالسلطات البرازيلية لمنح التصاريح التالية للوصول إلى عينات الحشرات وجمعها وتصديرها: تصريح SISBIO Nr. 45742-1، 45742-7 و45742-10، عملية CNPq nº 01300.004320/2014-21 و01300.0013848/2017-33، IBAMA Nr. 14BR016151DF و20BR035212/DF). تم دعم هذا البحث بتمويل من مؤسسة العلوم الألمانية (DFG) منح البحوث FL1051/1-1 وKA2846/6-1.

<ol>
	<li>Cain, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+advances+in+transposon-insertion+sequencing.">A decade of advances in transposon-insertion sequencing.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (9), 526-540 (2020).</li><li>Chao, M. C., Abel, S., Davis, B. M., Waldor, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+design+and+analysis+of+transposon+insertion+sequencing+experiments.">The design and analysis of transposon insertion sequencing experiments.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (2), 119-128 (2016).</li><li>Barquist, L., Boinett, C. J., Cain, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+querying+bacterial+genomes+with+transposon-insertion+sequencing.">Approaches to querying bacterial genomes with transposon-insertion sequencing.</a> RNA Biology. 10 (7), 1161-1169 (2013).</li><li>Fl&#243;rez, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic-producing+symbionts+dynamically+transition+between+plant+pathogenicity+and+insect-defensive+mutualism.">Antibiotic-producing symbionts dynamically transition between plant pathogenicity and insect-defensive mutualism.</a> Nature Communications. 8 (1), 15172 (2017).</li><li>Fl&#243;rez, L. V., Kaltenpoth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbiont+dynamics+and+strain+diversity+in+the+defensive+mutualism+between+Lagria+beetles+and+Burkholderia.">Symbiont dynamics and strain diversity in the defensive mutualism between Lagria beetles and Burkholderia.</a> Environmental Microbiology. 19 (9), 3674-3688 (2017).</li><li>Fl&#243;rez, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antifungal+polyketide+associated+with+horizontally+acquired+genes+supports+symbiont-mediated+defense+in+Lagria+villosa+beetles.">An antifungal polyketide associated with horizontally acquired genes supports symbiont-mediated defense in Lagria villosa beetles.</a> Nature Communications. 9 (1), 2478 (2018).</li><li>. FastQC A quality control tool for high throughput sequence data Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2012)</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+A+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FeatureCounts:+An+efficient+general+purpose+program+for+assigning+sequence+reads+to+genomic+features.">FeatureCounts: An efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features.</a> Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Gayt&#225;n, M. O., Mart&#237;nez-Santos, V. I., Soto, E., Gonz&#225;lez-Pedrajo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+three+secretion+system+in+attaching+and+effacing+pathogens.">Type three secretion system in attaching and effacing pathogens.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 129 (2016).</li><li>Hachani, A., Wood, T. E., Filloux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+VI+secretion+and+anti-host+effectors.">Type VI secretion and anti-host effectors.</a> Current Opinion in Microbiology. 29, 81-93 (2016).</li><li>Deep, A., Chaudhary, U., Gupta, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing+and+bacterial+pathogenicity:+From+molecules+to+disease.">Quorum sensing and bacterial pathogenicity: From molecules to disease.</a> Journal of Laboratory Physicians. 3 (1), 4-11 (2011).</li><li>Silva, A. J., Benitez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+cholerae+biofilms+and+cholera+pathogenesis.">Vibrio cholerae biofilms and cholera pathogenesis.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (2), 0004330 (2016).</li><li>Navarro-Garcia, F., Ruiz-Perez, F., Cataldi, &. #. 1. 9. 3. ;., Larz&#225;bal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+VI+secretion+system+in+pathogenic+Escherichia+coli:+structure,+role+in+virulence,+and+acquisition.">Type VI secretion system in pathogenic Escherichia coli: structure, role in virulence, and acquisition.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1965 (2019).</li><li>Ribet, D., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+bacterial+pathogens+colonize+their+hosts+and+invade+deeper+tissues.">How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues.</a> Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).</li><li>Schwarz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burkholderia+Type+VI+secretion+systems+have+distinct+roles+in+eukaryotic+and+bacterial+cell+interactions.">Burkholderia Type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions.</a> PLoS Pathogens. 6 (8), 1001068 (2010).</li><li>Jones, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kill+and+cure:+genomic+phylogeny+and+bioactivity+of+Burkholderia+gladioli+bacteria+capable+of+pathogenic+and+beneficial+lifestyles.">Kill and cure: genomic phylogeny and bioactivity of Burkholderia gladioli bacteria capable of pathogenic and beneficial lifestyles.</a> Microbial Genomics. 7 (1), 000515 (2021).</li><li>Takeshita, K., Kikuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Riptortuspedestris+and+Burkholderia+symbiont:+an+ideal+model+system+for+insect-microbe+symbiotic+associations.">Riptortuspedestris and Burkholderia symbiont: an ideal model system for insect-microbe symbiotic associations.</a> Research in Microbiology. 168 (3), 175-187 (2017).</li><li>Powell, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+screen+identifies+host+colonization+determinants+in+a+bacterial+gut+symbiont.">Genome-wide screen identifies host colonization determinants in a bacterial gut symbiont.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (48), 13887-13892 (2016).</li><li>Brooks, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+discovery+of+colonization+determinants+in+the+squid+symbiont+Vibrio+fischeri.">Global discovery of colonization determinants in the squid symbiont Vibrio fischeri.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17284-17289 (2014).</li><li>Somprasong, N., McMillan, I., Karkhoff-Schweizer, R. R., Mongkolsuk, S., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+genetic+manipulation+of+Burkholderia+gladioli+pathovar+cocovenenans.">Methods for genetic manipulation of Burkholderia gladioli pathovar cocovenenans.</a> BMC Research Notes. 3 (308), (2010).</li><li>Garcia, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burkholderia+thailandensis:+Genetic+manipulation.">Burkholderia thailandensis: Genetic manipulation.</a> Current Protocols in Microbiology. 45, 1-15 (2017).</li><li>Headd, B., Bradford, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conjugation+window+in+an+Escherichia+coli+K-12+strain+with+an+IncFII+plasmid.">The conjugation window in an Escherichia coli K-12 strain with an IncFII plasmid.</a> Applied and Environmental Microbiology. 86 (17), 00948 (2020).</li><li>Van Opijnen, T., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+insertion+sequencing:+A+new+tool+for+systems-level+analysis+of+microorganisms.">Transposon insertion sequencing: A new tool for systems-level analysis of microorganisms.</a> Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 435-442 (2013).</li><li>Gallagher, L. A., Ramage, E., Patrapuvich, R., Weiss, E., Brittnacher, M., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-defined+transposon+mutant+library+of+Burkholderia+thailandensis.">Sequence-defined transposon mutant library of Burkholderia thailandensis.</a> mBio. 4 (6), 00604-00613 (2013).</li><li>Wong, Y. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candidate+essential+genes+in+Burkholderia+cenocepacia+J2315+identified+by+genome-wide+TraDIS.">Candidate essential genes in Burkholderia cenocepacia J2315 identified by genome-wide TraDIS.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1288 (2016).</li><li>Moule, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+saturation+mutagenesis+of+Burkholderia+pseudomallei+K96243+predicts+essential+genes+and+novel+targets+for+antimicrobial+development.">Genome-wide saturation mutagenesis of Burkholderia pseudomallei K96243 predicts essential genes and novel targets for antimicrobial development.</a> mBio. 5 (1), 00926 (2014).</li><li>Ding, Q., Tan, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Himar1+transposon+for+efficient+random+mutagenesis+in+Aggregatibacter+actinomycetemcomitans.">Himar1 transposon for efficient random mutagenesis in Aggregatibacter actinomycetemcomitans.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1842 (2017).</li><li>Green, B., Bouchier, C., Fairhead, C., Craig, N. L., Cormack, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+site+preference+of+Mu,+Tn5,+and+Tn7+transposons.">Insertion site preference of Mu, Tn5, and Tn7 transposons.</a> Mobile DNA. 3, 3 (2012).</li><li>Lodge, J. K., Weston-Hafer, K., Berg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+Tn5+target+specificity:+Preference+for+insertion+at+G/C+pairs.">Transposon Tn5 target specificity: Preference for insertion at G/C pairs.</a> Genetics. 120 (3), 645-650 (1988).</li><li>Ar&#225; Ujo, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequencing+and+transposon+mutagenesis+of+Burkholderia+seminalis+TC3.4.2R3+identify+genes+contributing+to+suppression+of+orchid+necrosis+caused+by+B.+gladioli.">Genome sequencing and transposon mutagenesis of Burkholderia seminalis TC3.4.2R3 identify genes contributing to suppression of orchid necrosis caused by B. gladioli.</a> Molecular Plant-microbe Interactions: MPMI. 29 (6), 435-446 (2016).</li><li>Dobritsa, A. P., Samadpour, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reclassification+of+Burkholderiainsecticola+as+Caballeroniainsecticola+comb.+nov.+and+reliability+of+conserved+signature+indels+as+molecular+synapomorphies.">Reclassification of Burkholderiainsecticola as Caballeroniainsecticola comb. nov. and reliability of conserved signature indels as molecular synapomorphies.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 69 (7), 2057-2063 (2019).</li><li>Ohbayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect's+intestinal+organ+for+symbiont+sorting.">Insect's intestinal organ for symbiont sorting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 5179-5188 (2015).</li><li>Ross, C., Scherlach, K., Kloss, F., Hertweck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+conjugated+polyyne+biosynthesis+in+phytopathogenic+bacteria.">The molecular basis of conjugated polyyne biosynthesis in phytopathogenic bacteria.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (30), 7794-7798 (2014).</li><li>Atkins, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutant+of+Burkholderia+pseudomallei,+auxotrophic+in+the+branched+chain+amino+acid+biosynthetic+pathway,+is+attenuated+and+protective+in+a+murine+model+of+melioidosis.">A mutant of Burkholderia pseudomallei, auxotrophic in the branched chain amino acid biosynthetic pathway, is attenuated and protective in a murine model of melioidosis.</a> Infection and Immunity. 70 (9), 5290-5294 (2002).</li></ol>

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم تضارب في المصالح فيما يتعلق بالدراسة.

تم إنشاء مكتبة متحولة ب. غلاديولي transposon لتحديد عوامل الاستعمار المضيف الهامة في التفاعل التكافلي بين خنافس L. villosa وبكتيريا B. gladioli. وكانت الخطوات الرئيسية في البروتوكول هي التوازم، والعدوى المضيفة، وإعداد مكتبة الحمض النووي، والتسلسل.
كما العديد من سلالات بوركهولدريا قابلة للتعديل الوراثي عن طريق اقتران24،25، تم اقتران البلازميد الذي يحمل جهاز الإرسال والاستقبال وكاسيت إدخال المضادات الحيوية بنجاح في سلالة B. gladioli Lv-StA المستهدفة من E. coli. المحاولات السابقة للتحول عن طريق الكهربوكربوهات أسفرت عن انخفاض كبير إلى ما يقرب من أي محولات B. gladioli. من المستحسن تحسين تقنية التحويل للكائن المستهدف لتحقيق عدد كبير من المحولات بكفاءة.
جولة واحدة من اقتران و 40 بقعة اقتران تعطلت 3736 الجينات في B. gladioli Lv-StA. وبعد فوات الأوان، ستكون هناك ضرورة لجولات متعددة من التلازم لتعطيل معظم الجينات ال 468 7 والحصول على مكتبة مشبعة. وتجدر الإشارة إلى أن وقت الحضانة أثناء التضمين لم يسمح له بأن يتجاوز 12-18 ساعة، وهي نهاية مرحلة النمو الأسي ل B. gladioli. السماح اقتران ما بعد مرحلة النمو الأسي للخلايا البكتيرية يقلل من فرص نجاح الحصول على محولات26. لذلك ، يجب تعديل فترة التوازم وفقا لنمو الأنواع البكتيرية.
لتنفيذ تجربة ناجحة تنطوي على عدوى المكتبات المتحولة في مضيف ، من المهم تقييم حجم عنق الزجاجة البكتيري أثناء الاستعمار وتنوع المسوخ في المكتبة قبل العدوى1و2و27. استعدادا للتجربة ، قدرنا الحد الأدنى لعدد الخنافس التي يجب أن تصاب بفرصة كبيرة أن يتم أخذ عينات من كل متحول في المكتبة والسماح له بالاستعمار. كما تم حساب التقريبي في وقت توليد البكتيريا الحية وعدد الأجيال لمدة التجربة. ثم نمت الثقافة في المختبر حتى عدد مماثل من الأجيال عن طريق تعديل وقت الحضانة. وبالنسبة لتجربة عدوى مماثلة في مضيفين آخرين غير نموذجيين، من المستحسن القدرة على الحفاظ على ثقافة مختبرية ومصدر دائم للكائنات المضيفة.
وبعد نمو المكتبة المتحولة في الجسم الحي وفي المختبر وجمع العينات، تم تنفيذ بروتوكول معدل لإعداد مكتبة الحمض النووي لتسلسل إدخال الإرسال والاستقبال. تضمن التعديل في البروتوكول تصميم مبرمجات PCR مخصصة وإضافة خطوات PCR لتحديد شظايا الحمض النووي التي تحتوي على كاسيت الإدراج. لأنه تم تخصيص البروتوكول، دورات PCR إضافية في البروتوكول زيادة خطر التضخيم الزائد والحصول على أجزاء محول محول مختلطة في المكتبات النهائية. وبالتالي، خطوة تنظيف النهائي (بدون تحديد حجم) بعد PCRs اثنين مستحسن، كما أنه يساعد في إزالة هذه الأجزاء. وكان حجم توزيع مكتبات الحمض النووي لا يزال أوسع مما كان متوقعا. غير أن زيادة عمق التسلسل وفرت بيانات كافية تمت تصفيتها أثناء تحليل المعلوماتية الأحيائية، وتوصلت إلى نتائج مرضية.
وبما أن الطفرات بوساطة الإرسال والاستقبال تولد الآلاف من عمليات الإدراج العشوائي في تجربة واحدة، فمن الممكن توليد مكتبة مشبعة من المسوخ التي تحتوي على جميع المسوخ باستثناء تلك التي تعطلت فيها الجينات الضرورية للنمو البكتيري. نحن على الأرجح لم نعمل مع مكتبة متحولة مشبعة ، بالنظر إلى تقديرات الجينات الأساسية في دراسات أخرى على Burkholderia sp. 28،29. ومع ذلك، تساعد المكتبة غير المشبعة في استكشاف جينات مرشحة مختلفة لمزيد من الدراسات باستخدام الطفرات المستهدفة. قبل التجارب ، من المهم أيضا أن نتذكر أن بعض الإرسال والاستقبال لديها مواقع محددة هدف الإدراج التي تزيد من وفرة المسوخ في بعض loci في الجينوم30. ومن المعروف أن مرسلات الرافنبوزونات مارينر تستهدف مواقع AT للإدراج31، و Tn5 transposons لها تحيز GC32،33. وسيساعد إدراج خطوات أثناء تحليل المعلوماتية الحيوية للتعرف على النقاط الساخنة لإدراج الإرسال والاستقبال في تقييم أي تحيز في التوزيع.
على الرغم من عرضة للانتكاسات، يمكن أن تكون تجربة تسلسل إدراج الإرسال والاستقبال المصممة تصميما جيدا أداة قوية لتحديد العديد من الجينات المهمة المشروطة في البكتيريا ضمن تجربة واحدة. على سبيل المثال، تم تحديد اثنتي عشرة جينة في بوركهولدريا seminalis مهمة لقمع نخر أوراق السحلية من خلال الجمع بين موتاجينيسيس الإرسال والاستقبال وعلم الجينوم34. وراء Burkholderia, وقد تم تحديد العديد من الجينات الالتصاق والحركية والنقل كعوامل استعمار هامة في Snodgrassella alvi symbionts من أبيس mellifera (نحل العسل)22, وفي symbionts Vibrio fischerii من scolopes Euprymna (الحبار ذيل هاواي)23 باستخدام نهج تولد الإرسال والادخال transposon.
وكنهج بديل، يمكن أن يتبع تكوين الإرسال والاستقبال فحص للمسوخ الفردية باستخدام وسائط انتقائية بدلا من التسلسل. الفحص الظاهري أو الفحوصات الحيوية لتحديد أوجه القصور، مثل الحركة، وإنتاج الأيض الثانوي النشط بيولوجيا، أو الأوكستروفيات المحددة، ممكنة. على سبيل المثال ، كان فحص مكتبة Burkholderia insecticola (أعيد تعيينها إلى جنس Caballeronia35)مكتبة متحولة الإرسال والاستقبال مفتاحا في تحديد أن symbionts تستخدم جينات الحركة لاستعمار ريبتورتوس باديستريس، مضيفها الحشري36. وعلاوة على ذلك، باستخدام موتاجينيسيس الإرسال والاستقبال والفحص الظاهري، تم تحديد الكتلة الجينية التركيب الحيوي للكاريونينينين المستقلب الثانوي النشط بيولوجيا في بوركهولديريا كاريوفيلي37. تم التعرف على متحولة أوكستروفيك من pseudomallei Burkholderia بعد موتاسيس transposon والفحص وهو مرشح لقاح مخفف ممكن ضد melioidosis، وهو مرض خطير في البشر والحيوانات38. وهكذا، فإن تولد وتسلسل الإرسال والاستقبال هو نهج قيم في دراسة الصفات الجزيئية للبكتيريا التي تعتبر مهمة للتفاعلات مع مضيفيهم في الجمعيات المسببة للأمراض أو المتبادلة.

Burkholderia gladioli يمكن أن تشارك في ارتباط تكافلي مع الخنافس لاغريا villosa، ولعب دورا هاما في الدفاع ضد الخصوم الميكروبية من الحشراتالمضيفة 4،5،6. الخنافس الإناث منزل عدة سلالات من B. gladioli في الغدد المتخصصة التبعي للجهاز التناسلي. عند وضع البيض، الإناث تشويه B. خلايا غلاديولي على سطح البيض حيث مركبات مضادة للميكروبات التي تنتجها B. gladioli تمنع العدوى عن طريق الفطريات entomopathogenic4،6. خلال التطور الجنيني المتأخر أو في وقت مبكر بعد فقس اليرقات ، تستعمر البكتيريا الشقوق البطينية على السطح الظهري لليرقات. على الرغم من هذا التعريب المتخصصة وطريق النقل الرأسي من symbionts، L. villosa يمكن أن يفترض أيضا الحصول على B. gladioli أفقيا من البيئة4. وعلاوة على ذلك، تم العثور على ما لا يقل عن ثلاث سلالات من B. gladioli بالاشتراك مع L. villosa4،6. من بين هذه، B. غلاديولي لف-StA هو الوحيد الذي هو قابل للزراعة في المختبر.
ب. غلاديولي Lv-StA لديها حجم الجينوم من 8.56 ميغابايت6 ويحتوي على 7468 الجينات. أي من هذه الجينات مهمة لبكتيريا B. gladioli لاستعمار مضيف الخنفساء؟ للإجابة على هذا السؤال، استخدمنا تسلسل إدراج الإرسال والاستقبال (Tn-seq)، وهي طريقة استكشافية لتحديد الجينات الميكروبية الأساسيةالمشروطة 1و2و3. تم إنشاء مكتبة متحولة من B. gladioli Lv-StA باستخدام جهاز الإرسال والاستقبال Tn5. من خلال اقتران من الخلايا المانحة الإشريكية القولونية إلى B. gladioli Lv-StA، تم نقل بلازميد pRL27 يحمل جهاز الإرسال والاستقبال Tn5 وكاسيت مقاومة المضادات الحيوية محاط بتكرار مقلوب(الشكل 1). وبالتالي، تم إنشاء مجموعة من المسوخ التي تحمل بشكل فردي اضطرابات من 3736 جينات سيمبيونت(الشكل 2).
أصيب حمام السباحة المتحول على بيض الخنفساء لتحديد عوامل الاستعمار ، وكعنصر تحكم ، تم زراعته أيضا في المختبر في وسط King's B (KB). بعد إتاحة الوقت الكافي للاستعمار ، تم جمع اليرقات المفقسة وتجميعها لاستخراج الحمض النووي. تم اختيار أجزاء من الحمض النووي تحتوي على إدراج الإرسال والاستقبال والمنطقة الجينومية المحيطة ب B. gladioli Lv-StA باستخدام بروتوكول إعداد مكتبة الحمض النووي المعدل للتسلسل. تم إجراء معالجة جودة القراءة تليها تحليل مع DESeq2 لتحديد جينات محددة حاسمة بالنسبة ل B. gladioli Lv-StA لاستعمار يرقات L. villosa عند انتقالها عبر سطح البيض.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,6- Diaminopimelic Acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B22391</td>
			<td>For E.coli WM3064+ pRL27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar - Agar</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure beads XP (magentic beads + polyethylene glycol + salts)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td>Size selection in step 6.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach (NaOCl) 12%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie2 v.2.4.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinfromatic tool for read mapping. Reference 10 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer-S</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>PEQL01-1020</td>
			<td>For PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutadapt v.2.10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatic tool for removing specific adapter sequences from the reads. Reference 8 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DESeq2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RStudio package for assessing differential mutant abundance. Usually used for RNAseq analysis. Reference 12 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder 100 bp</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T834.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>R0182</td>
			<td>PCR for confirming success of conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Di-Sodium salt</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epicentre MasterPure Complete DNA and RNA Purification Kit</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>MC85200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2218.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastQC v.0.11.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatic tool for assessing the quality of sequencing data. Reference 7 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeatureCounts v.2.0.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatic tool to obtain read counts per genomic feature. Reference 11 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>7530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Serva</td>
			<td>26899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>4936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td>Roth</td>
			<td>PO27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index primers set 1)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7335S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7645S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone (soybean)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2365</td>
			<td>For Burkholderia gladioli Lv-StA KB-medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peqGOLD &#39;Hot&#39; Taq- DNA Polymerase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PEQL01-1020</td>
			<td>PCR for confirming success of conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates - 145 x 20 mm</td>
			<td>Roth</td>
			<td>XH90.1</td>
			<td>For selecting transconjugants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates - 90 x 16 mm</td>
			<td>Roth</td>
			<td>N221.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiaxcel (StarSEQ GmbH, Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Quality check after DNA library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin beads</td>
			<td>Roth</td>
			<td>HP57.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>01-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic v.0.36</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatic tool for trimming low quality reads and also adapter sequences. Reference 9 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris -HCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9090.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2366</td>
			<td>For Escherichia coli WM3064+pRL27 LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td>Bandelin</td>
			<td>GM 70 HD</td>
			<td>For shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER enzyme (uracil DNA glycosylase + DNA glycosylase- lyase Endonuclease VIII)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7645S</td>
			<td>Ligation step 6.5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2363</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transposon-insertion sequencing as a tool to elucidate bacterial colonization factors in a burkholderia gladioli symbiont of lagria villosa beetles

والاستدلال على وظيفة الجينات عن طريق التلاعب بنشاطها أداة أساسية لفهم الأسس الوراثية لمعظم العمليات البيولوجية. وقد شهدت التطورات في علم الأحياء المجهرية الجزيئية ظهور تقنيات متنوعة للطفرات للتلاعب بالجينات. ومن بينها، فإن تسلسل إدخال الإرسال والاستقبال (Tn-seq) هو أداة قيمة لتقييم وظائف العديد من الجينات المرشحة بطريقة غير مستهدفة في وقت واحد. وكانت هذه التقنية أساسية لتحديد الآليات الجزيئية لاستعمار المضيفين eukaryotic في العديد من الميكروبات المسببة للأمراض وعدد قليل من symbionts مفيدة.
هنا ، يتم تأسيس Tn-seq كطريقة لتحديد عوامل الاستعمار في سيمبيونت Burkholderia gladioli المتبادل من خنفساء لاغريا فيلوسا. عن طريق اقتران, Tn5 يتم إدخال الإرسال والاستقبال بوساطة من كاسيت مقاومة للمضادات الحيوية في مواقع الجينوم عشوائي في B. gladioli. لتحديد تأثير اضطرابات الجينات على قدرة البكتيريا على استعمار مضيف الخنفساء ، يتم تلقيح مكتبة B. gladioli transposon-mutant المولدة على بيض الخنفساء ، في حين يتم زراعة عنصر التحكم في المختبر في وسط الثقافة السائلة. بعد إتاحة الوقت الكافي للاستعمار ، يتم استخراج الحمض النووي من المكتبات المزروعة في الجسم الحي وفي المختبر. بعد بروتوكول إعداد مكتبة الحمض النووي، يتم إعداد عينات الحمض النووي لتسلسل إدخال الإرسال والاستقبال. يتم اختيار شظايا الحمض النووي التي تحتوي على حافة إدراج الإرسال والاستقبال والحمض النووي البكتيري المحيط ، ويتم تحديد مواقع الطفرات عن طريق التسلسل بعيدا عن حافة إدراج الإرسال والاستقبال. وأخيرا ، من خلال تحليل ومقارنة ترددات كل متحولة بين المكتبات في الجسم الحي وفي المختبر ، يمكن التنبؤ بأهمية جينات سيمبيونت محددة أثناء استعمار الخنفساء.

يمكن للبكتيريا المرتبطة بالمضيف استخدام عدة عوامل لإنشاء جمعية ، بما في ذلك تلك التي تتوسط في الالتصاق ، أو الحركة ، أو chemotaxis ، أو استجابات الإجهاد ، أو ناقلات محددة. في حين تم الإبلاغ عن عوامل مهمة للتفاعلات بين مسببات الأمراض والمضيف لعدةبكتيريا 13،14،15،16،17،18، بما في ذلك أعضاء جنس Burkholderia19،20، فقد استكشفت دراسات أقل الآليات الجزيئية المستخدمة من قبل symbionts مفيدة للاستعمار21،22،23 . باستخدام تسلسل إدراج الإرسال والاستقبال ، كان الهدف هو تحديد العوامل الجزيئية التي تمكن B. gladioli من استعمار خنافس L. villosa.
تم تنفيذ تولد الأوعية بوساطة Transposon باستخدام pRL27 plasmid ، الذي يحمل جهاز الإرسال والاستقبال Tn5 وكاسيت مقاومة كاناميسين محاط بمواقع تكرار مقلوبة. تم إدخال البلازميد إلى الهدف B. غلاديولي لف-StA الخلايا عن طريق اقتران مع المتبرع البلازميد E. coli WM3064 سلالة (كما هو مبين في الشكل 1). بعد اقتران, مزيج اقتران تحتوي على B. gladioli المتلقي وE. كولاي الخلايا المانحة كانت مطلية على لوحات أجار انتقائية تحتوي على kanamycin. غياب DAP على لوحات القضاء على الخلايا E. القولونية المانحة، ووجود kanamycin مختارة لنجاح B. gladioli Lv-StA المتحولين. تم إعداد مكتبة B. gladioli Lv-StA المتحولة المجمعة التي تم الحصول عليها من حصاد المستعمرات العابرة البالغ عددها 100,000 لاستعمار للتسلسل باستخدام مجموعة إعداد معدلة لمكتبة الحمض النووي ومبرمجين مخصصين. ويبرز الشكل 2 خطوات إعداد مكتبة الحمض النووي. وأسفر التسلسل عن 4 قراءات مقترنة ب Mio؛ 3,736 الجينات من أصل 7,468 الجينات في B. غلاديولي Lv-StA تعطلت.
لتحديد المسوخ التي كانت معيبة الاستعمار في المضيف، أصيبت مكتبة B. gladioli Lv-StA متحولة على بيض الخنفساء ونمت في المختبر في KB المتوسطة كعنصر تحكم. تم حساب حجم عنق الزجاجة في استعمار الجسم الحي قبل التجربة. أصيب عدد معروف من خلايا B. gladioli Lv-StA على بيض الخنفساء ، وتم الحصول على عدد الخلايا المستعمرة في يرقات النجوم الأولى الطازجة عن طريق طلاء تعليق من كل يرقة وحساب وحدات تشكيل المستعمرة لكل فرد. وقد أجريت هذه الحسابات لضمان أن عدد الخلايا المستعمرة يكفي لتقييم كل أو نسبة عالية من المسوخ في المكتبة لقدرتها على استعمار المضيف. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطبيع وقت النمو بين ظروف المختبر وفي الجسم الحي على أساس عدد الأجيال البكتيرية لجعل هذه العينات قابلة للمقارنة.
بعد فقس البيض ، تم جمع 1296 يرقة في 13 بركة. نمت الثقافات المتحولة في المختبر المقابلة وتخزينها كمخزونات الجلسرين. تم استخراج الحمض النووي للمكتبات المتحولة في الجسم الحي وفي المختبر نمت ومجزأة في ultrasonicator. ويبين الشكل 3 حجم توزيع الحمض النووي المقص، حيث تتراوح غالبية الشظايا بين 100 و 400 نقطة أساس، كما هو متوقع. وأعقب هذه الخطوة بروتوكول إعداد مكتبة الحمض النووي المعدل للتسلسل. وفي كل خطوة من خطوات البروتوكول، تم فحص تركيز الحمض النووي المتبقي لضمان تنفيذ الخطوات بشكل صحيح وتتبع خسائر الحمض النووي. كشف فحص الجودة (انظر جدول المواد)قبل التسلسل أن مكتبات الحمض النووي تحتوي على شظايا الحمض النووي الكبيرة بشكل غير متوقع (>800 bp) ، وكان هذا أكثر وضوحا في مكتبات vivo. وبالنظر إلى صعوبة تحسين تجميع الشظايا في ممرات التسلسل، كان من الضروري زيادة عمق التسلسل إلى 10 قراءات مقترنة ب Mio في مكتبات vivo لتحقيق العدد المطلوب من القراءات. وكشف تحليل نتائج التسلسل أن ما متوسطه 4 قراءات ميو في مكتبات في الجسم الحي و 3.1 يقرأ ميو في المكتبات في المختبر تحتوي على حافة Transposon في نهاية 5 'من القراءة -1 ( الجدول 9 )، الذي كان مرضيالهذهالتجربة. يظهر توزيع 24,224 إدخال فريد عبر جينوم B. gladioli في المكتبة الأصلية في الشكل 4. وكشف تحليل أجري باستخدام DESeq2 أن وفرة 271 متحولة كانت مختلفة بشكل كبير بين الظروف في الجسم الحي وفي المختبر. 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62843/62843fig03.jpg"> الشكل 3: Agarose المواد الهلامية من مكتبات متحولة والحمض النووي. (أ) هلام Agarose مع الحمض النووي غير المفروش من متحولة في حارة x وسلم 1 كيلوبايت للمقياس. (ب) جل مع مكتبة الحمض النووي مقص. يشار إلى أحجام الفرقة من سلم في الممر الأول على الجانب الأيسر. تحتوي الممرات الثلاثة الأولى A و b و c على أجزاء الحمض النووي المقصة لمكتبات vivo. تحتوي الممرات d و e و f و g على شظايا الحمض النووي المقصة لمكتبات المختبر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62843/62843fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62843/62843fig04.jpg"> الشكل 4: موقع مواقع الإدراج فريدة من نوعها في المكتبة الأصلية عبر replicons الأربعة في الجينوم Burkholderia غلاديولي Lv-StA. يقع كل شريط على طول المحور س في موقع الإدراج. ارتفاع شريط على طول المحور ص يتوافق مع عدد القراءات المقترنة بهذا الموقع. لاحظ أن الكروموسومين واثنين من البلازميدات تظهر في الطول الكامل وبالتالي لها جداول مختلفة على المحور س. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62843/62843fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">الملك باء المتوسطة / أجار</td>
		</tr>
<tr>
<td>بيبتون (فول الصويا)</td>
			<td>20 جم/لتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>K2HPO4
</td>
			<td>1.5 غرام/لتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>مغسو4.7H2O</td>
			<td>1.5 غرام/لتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>اجار</td>
			<td>15 جم/لتر</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">يذوب في الماء المقطر</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">LB المتوسطة / أجار</td>
		</tr>
<tr>
<td>تريبتون</td>
			<td>10 جم/لتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>استخراج الخميرة</td>
			<td>5 جم/لتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>ناكل</td>
			<td>10 جم/لتر</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">يذوب في الماء المقطر</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: مكونات الوسائط.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>لا.</td>
			<td>الاشعال</td>
			<td colspan="2">تسلسل</td>
			<td>درجة الحرارة لتمين PCR (°C)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>tpnRL17-1RC</td>
			<td colspan="2">5'-CGTTACATCCCTGGCTTGTT-3'</td>
			<td rowspan="2">58.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>tpnRL13-2RC</td>
			<td colspan="2">5'-TCGTGAGGGGCTG-3'</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 2: التهيئة لتأكيد نجاح التوازم.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>مكون</td>
			<td>حجم الصوت (ميكرولتر)</td>
		</tr>
<tr>
<td>المياه النقية من HPLC</td>
			<td>4.92</td>
		</tr>
<tr>
<td>10x المخزن المؤقت S (خصوصية عالية)</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>مجكل2 (25 م م)</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTPs (2 متر)</td>
			<td>1.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>التمهيدي 1 (10 pmol / μL)</td>
			<td>0.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>التمهيدي 2 (10 pmol / ميكرولتر)</td>
			<td>0.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>تقي (5 U/μL)</td>
			<td>0.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>مجموع مادميكس</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td>قالب</td>
			<td>1</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 3: مزيج PCR الرئيسي لتأكيد نجاح التوازم. الاختصارات: HPLC = الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء؛ dNTPs = ثلاثي الفوسفات ثنائي الأكسجين.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>الخطوات</td>
			<td>درجة الحرارة °C</td>
			<td>الوقت</td>
			<td>دورات</td>
		</tr>
<tr>
<td>التسخين الأولي</td>
			<td>95</td>
			<td>3 دقائق</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>التشبع</td>
			<td>95</td>
			<td>40 ق</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>الصلب</td>
			<td>58.2</td>
			<td>40 ق</td>
			<td>من 30 إلى 35</td>
		</tr>
<tr>
<td>امتداد</td>
			<td>72</td>
			<td>1-2 دقيقة</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>التمديد النهائي</td>
			<td>72</td>
			<td>4 دقائق</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>مسك</td>
			<td>4</td>
			<td colspan="2">∞</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 4: شروط ال PCR لتأكيد نجاح التوازم.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>الاشعال</td>
			<td colspan="2">تسلسل</td>
			<td>TM °C</td>
			<td>استخدام</td>
			<td>مصدر</td>
		</tr>
<tr>
<td>التمهيدي البيوتينية الخاصة ب Transposon</td>
			<td colspan="2">5'-البيوتين-أجاجاكاكتاتاكتاككتاغاكتاتغ -3'</td>
			<td>63.5</td>
			<td>6.7.1. PCR I</td>
			<td>تقليد</td>
		</tr>
<tr>
<td>التمهيدي العالمي المعدل PCR</td>
			<td colspan="2">5'- أاتغاتاكجغاكاغاغاتك تاكاككتكتتكتاكاكجاكغاكتك TTCCجاتCTGAATTCجاتغات GGTTGAGGTGT – 3'</td>
			<td>62</td>
			<td>6.10.1. PCR الثاني</td>
			<td>تقليد</td>
		</tr>
<tr>
<td>التمهيدي للفهرس</td>
			<td colspan="3">الرجوع إلى دليل الشركة المصنعة</td>
			<td>6.7.1. PCR I و 6.10.1. PCR الثاني</td>
			<td>NEBNext متعددة أوليغوس لإلومينا (مؤشر التمهيديات تعيين 1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>محول</td>
			<td colspan="3">الرجوع إلى دليل الشركة المصنعة</td>
			<td>6.5. ربط المحول</td>
			<td>NEBNext الترا الثاني مجموعة الإعدادية مكتبة الحمض النووي لIllumina</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 5: التمهيديات والمحول ل PCR الأول والثاني أثناء إعداد مكتبة الحمض النووي. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>مزيج PCR</td>
			<td>(ميكرولتر)</td>
		</tr>
<tr>
<td>شظايا الحمض النووي ذات الربط المحول</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>NEBNext الترا الثاني Q5 مزيج رئيسي</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>التمهيدي مؤشر (10 pmol / μL)</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>جهاز الإرسال والاستقبال التمهيدي البيوتينية محددة (10 pmol / μL)</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>إجمالي حجم الصوت</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 6: إعداد مكتبة الحمض النووي -PCR I مزيج رئيسي.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>الخطوات</td>
			<td>درجة الحرارة</td>
			<td>الوقت</td>
			<td>دورات</td>
		</tr>
<tr>
<td>التسخين الأولي</td>
			<td>98 درجة مئوية</td>
			<td>30 ق</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>التشبع</td>
			<td>98 درجة مئوية</td>
			<td>10 ق</td>
			<td rowspan="3">من 6 إلى 12</td>
		</tr>
<tr>
<td>الصلب</td>
			<td>65 درجة مئوية</td>
			<td>30 ق</td>
		</tr>
<tr>
<td>امتداد</td>
			<td>72 درجة مئوية</td>
			<td>30 ق</td>
		</tr>
<tr>
<td>التمديد النهائي</td>
			<td>72 درجة مئوية</td>
			<td>دقيقتان</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>مسك</td>
			<td>16 درجة مئوية</td>
			<td colspan="2">∞</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 7: إعداد مكتبة الحمض النووي -شروط PCR I و II.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>مزيج PCR</td>
			<td>(ميكرولتر)</td>
		</tr>
<tr>
<td>الحمض النووي المختار من قبل الخرز</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>NEBNext الترا الثاني Q5 مزيج رئيسي</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>التمهيدي للفهرس</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>التمهيدي العالمي المعدل ل PCR</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>إجمالي حجم الصوت</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 8: إعداد مكتبة الحمض النووي -مزيج رئيسي PCR II.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">مكتبات</td>
			<td>إنفيفو-1</td>
			<td>إنفيفو-2</td>
			<td>إنفيفو-3</td>
			<td>إنفيترو-1</td>
			<td>إنفيترو-2</td>
			<td>إنفيترو-3</td>
			<td>المكتبة الأصلية</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">لا. من يقرأ (PE)</td>
			<td>56,57,710</td>
			<td>39,19,051</td>
			<td>30,65,849</td>
			<td>35,73,494</td>
			<td>28,83,440</td>
			<td>36,61,956</td>
			<td>46,09,410</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">لا. من القراءات التي تحتوي على Tn – حافة على 5 'نهاية القراءة-1</td>
			<td>54,15,880</td>
			<td>37,31,169</td>
			<td>29,36,247</td>
			<td>33,00,499</td>
			<td>27,35,705</td>
			<td>33,50,402</td>
			<td>41,53,270</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Bowtie2 معدل المحاذاة الإجمالي (٪) (القراءة-1 فقط)</td>
			<td>95.53%</td>
			<td>83.71%</td>
			<td>89.87%</td>
			<td>80.79%</td>
			<td>78.00%</td>
			<td>73.06%</td>
			<td>74.92%</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">عدد عمليات الإدراج الفريدة</td>
			<td>8,539</td>
			<td>4,134</td>
			<td>7,183</td>
			<td>18,930</td>
			<td>18,421</td>
			<td>20,438</td>
			<td>24,224</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">عدد الجينات التي ضربت</td>
			<td>1575</td>
			<td>993</td>
			<td>1450</td>
			<td>2793</td>
			<td>2597</td>
			<td>3037</td>
			<td>3736</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 9: موجز للتسلسل الناتج وتكرار إدراج الإرسال والاستقبال لكل مكتبة. اختصار: PE = نهاية مقترنة.

Watch this Scientific Journal Video about Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles at JoVE.co

Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles

هذه طريقة مكيفة لتحديد عوامل استعمار الحشرات المرشحة في سيمبيونت مفيد Burkholderia. يتم إصابة مضيف الخنفساء بمكتبة متحولة عشوائية تم إنشاؤها عبر تولد الإرسال والاستقبال ، ويتم مقارنة تعقيد المكتبة بعد الاستعمار بعنصر تحكم ينمو في المختبر.

تسلسل إدراج الإرسال والاستقبال كأداة لتوضيح عوامل الاستعمار البكتيرية في بيركهولدريا غلاديولي سيمبيونت من خنافس لاغريا فيلوسا

Inferring the function of genes by manipulating their activity is an essential tool for understanding the genetic underpinnings of most biological ...

هذا البروتوكول مفيد لإجراء التلاعب الجيني على البكتيريا التكافلية ، في هذه الحالة ، وتحديدا على Burkholderia ، وتحديد الجينات الضرورية لاستعمار مضيف الحشرات. تسلسل الإدراج Transposon هو أداة قوية لتحديد عدد كبير من الجينات الأساسية مشروط في وقت واحد في تجربة واحدة. تبدأ عن طريق تلقيح ثقافة مانحة جديدة من المانحين E.coli في 10 ملليلتر من LB المتوسطة تكملها Kanamycin وDAP تحت غطاء محرك السيارة العقيمة.تلقيح Burkholderia gladioli سلالة الخلايا المتلقية في خمسة ملليلتر من المتوسط كيلوبايت. احتضان الثقافات في 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها على شاكر في 250 دورة في الدقيقة. بعد النمو بين عشية وضحاها، والطرد المركزي أربعة ملليلتر من كل من الثقافات في 9، 600 مرة G لمدة ست دقائق بيليه الخلايا والتخلص من supernatant.تحت غطاء محرك السيارة العقيم، اغسل ثقافات الخلايا الحبيبية في وسيط KB يحتوي على DAP. وأخيرا، إعادة إنفاق الثقافات بشكل منفصل في أربعة ملليلترات من كيلوبايت بالإضافة إلى DAP المتوسطة. في أنبوب جديد 15 ملليلتر، مزيج 250 ميكرولتر من الخلايا المانحة E.coli غسلها مع ملليلتر واحد من سلالة بوركيهولديريا غلاديولي غسلها الخلايا المتلقية.بقعة 10 ميكرولتر من هذا خليط خلايا اقتران على لوحات أجار كيلو بايت التي تحتوي على DAP. السماح للوح للراحة دون عائق في غطاء محرك السيارة العقيمة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. احتضان لوحات مع البقع اقتران في 30 درجة مئوية لمدة 12 إلى 18 ساعة.بعد الحضانة، إضافة 2-4 ملليلتر من برنامج تلفزيوني 1X على لوحات تحت غطاء محرك السيارة العقيمة واستخدام مكشطة الخلية للافراج عن البقع اقتران البكتيرية نمت من أجار. ثم ماصة مزيج الخلية المترافقة في اثنين من أنابيب الميكروفون ملليلتر. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 9، 600 مرة G لمدة دقيقتين.تجاهل supernatant وغسل بيليه مرتين في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني 1X عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. Resuspend بيليه النهائي في 1، 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X. تخلط جيدا وتنتشر 100 ميكرولتر من خليط الخلية على لوحات كبيرة كيلوبايت أجار تكملها Kanamycin واحتضان في 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها.عد العدد الإجمالي للمستعمرات العابرة على الصفائح الثلاث واستقراء لحساب العدد التقريبي للمسوخ التي تم الحصول عليها في جميع الصفائح. لزيادة فرص الحصول على مكتبة تمثيلية، تأكد من أن العدد الإجمالي للمستعمرات أعلى بعدة أضعاف من العدد الإجمالي للجينات في الجينوم. لتأكيد نجاح عملية التواؤم، قم بإجراء PCR يستهدف كاسيت الإدراج باستخدام 10 إلى 20 مستعمرة عينة كما هو موضح في المخطوطة.تحت غطاء محرك السيارة العقيم، كشط المستعمرات من لوحات بإضافة 1 إلى اثنين من ملليلتر من برنامج تلفزيوني 1X على أجار. تجمع خليط الخلية كشط قبالة من لوحات في أنابيب 50 ملليلتر. دوامة المكتبة لخلط جيدا، ومن ثم تقسيم ملليلتر واحد من مكتبة متحولة مجمعة في عدة أنابيب التبريد.إضافة ملليلتر واحد من 70٪ الجليسيرول إلى الأنابيب وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية. حدد مخلب البيض L.villosa وعدد البيض المستمر إذا كان القابض يحتوي على أكثر من 100 بيضة. لتعقيم مخلب البيض بأكمله، أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 70٪، واغسل البيض برفق لمدة خمس دقائق، ثم أزيل الإيثانول واغسل البيض مرتين بالماء المعبئ.أضف 200 ميكرولتر من التبييض بنسبة 12٪، واغسل البيض برفق لمدة 30 ثانية. إزالة التبييض على الفور وغسل البيض مرة أخرى ثلاث مرات مع 200 ميكرولتر من الماء autoclaved. تصيب البيض في مخلب البيض المعقم باستخدام مرتين 10 إلى الخلايا الست لكل ميكرولتر من مكتبة متحولة غسلها في برنامج تلفزيوني.بعد يومين من فتحة يرقات الخنفساء المصابة ، اجمع 100 يرقات نجم ثانية لكل أنبوب ميكروفوجي 1.5 ملليلتر وتخزينها عند ناقص 80 درجة مئوية. لتوليد مكتبة التحكم في المختبر، تلقيح 250 ميكرولتر من مرتين 10 إلى ست خلايا لكل ميكرولتر من المكتبة المتحولة في 10 ملليلتر من متوسط KB يحتوي على كاناميسين. بعد استخراج الحمض النووي من في الجسم الحي وفي المختبر نمت المكتبات متحولة، وتبادل الحمض النووي مع ultrasonicator.للتحقق مما إذا كان الحمض النووي قد تم قصه إلى نطاق الحجم المطلوب ، قم بتحميل خمسة ميكرولترات من الحمض النووي غير المقص والمقص بعد خلطه مع صبغة تحميل الجل بنسبة واحد إلى واحد على هلام agarose 1.6٪ يعمل عند 250 فولت لمدة 40 دقيقة. لإعداد نهايات الجزء المطلوبة ربط محول، تبدأ بإضافة ثلاثة ميكرولترات من مزيج الانزيم وسبعة ميكرولترات من العازلة رد فعل إلى 50 ميكرولتر من الحمض النووي القص وتخلط بشكل جيد عن طريق pipetting. تعيين thermocycler مع غطاء ساخن في أكبر من أو يساوي 75 درجة مئوية واحتضان العينات لمدة 30 دقيقة في 20 درجة مئوية و 30 دقيقة في 65 درجة مئوية، ثم عقد درجة الحرارة في أربع درجات مئوية.ربط محول، إضافة 30 ميكرولتر من مزيج الربط الرئيسي، ميكرولتر واحد من محسن الربط، و 2.5 ميكرولتر من محول المخفف لمنتجات خطوة إعداد نهاية. تخلط جيدا عن طريق pipetting واحتضان العينة لمدة 15 دقيقة في 20 درجة مئوية في thermocycler مع غطاء ساخنة قبالة. بعد 15 دقيقة، أضف ثلاثة ميكرولترات من الإنزيم.تخلط جيدا عن طريق pipetting واحتضان العينة لمدة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية في thermocycler مع غطاء ساخنة في أكبر من أو يساوي 47 درجة مئوية. لتحديد حجم محول الحمض النووي ربط استهداف شظايا من 250 أزواج قاعدة، تبدأ دوامة حل حبة المغناطيسي ووضعه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام. إضافة 0.3 مرات من الخرز إلى 96.5 ميكرولتر من خليط الحمض النووي ربطها وتخلط عن طريق الأنابيب جيدا.احتضان خليط الخرز لمدة خمس دقائق. ضع الأنابيب على حامل مغناطيسي لسحب الخرز وإزالة شظايا الحمض النووي من الحجم غير المرغوب فيه. دع الخرز يستقر لمدة خمس دقائق ثم نقل النافورة واضحة إلى أنبوب ميكروفوج جديدة.إضافة 0.15 مرات من الخرز الطازج إلى supernatant وتخلط عن طريق pipetting جيدا. احتضان خليط الخرز لمدة خمس دقائق ومن ثم وضع الأنابيب على موقف المغناطيسي لسحب أسفل الخرز ملزمة الحمض النووي الهدف. انتظر لمدة خمس دقائق ثم تجاهل supernatant، والحفاظ على الخرز.مع الخرز على المنصة المغناطيسية، إضافة 200 ميكرولتر من الإيثانول الطازجة 80٪، وانتظر لمدة 30 ثانية قبل التخلص من الإيثانول دون إزعاج الخرز. إزالة الأنابيب من المنصة وإضافة 17 ميكرولتر من 0.1X TE أو TE منخفضة، ثم مزيج عن طريق pipetting 10 مرات واحتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين. ضع الأنبوب على الحامل المغناطيسي و خذ 15 ميكرولتر من الحمض النووي المحدد بالحجم ل PCR-1.دوامة حبات streptavidin ووضعها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل. خذ 32 ميكرولتر من الخرز واغسلها ب 500 ميكرولتر من 1X ربط وغسل العازلة. إضافة 32 ميكرولتر من 2X ربط وغسل العازلة وإعادة إنفاق الخرز.لهذا، إضافة 32 ميكرولتر من منتجات PCR-1 تنظيفها. تخلط جيدا واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. ضع خليط الحمض النووي حبة على موقف المغناطيسي لمدة دقيقتين.ماصة من supernatant كما الحمض النووي البيوتين الموسومة التي تحتوي على حافة الإدراج يربط إلى streptavidin على الخرز. غسل الخرز مع 500 ميكرولتر من ربط 1X وغسل العازلة، ومن ثم غسل الخرز مع 200 ميكرولتر من TE منخفضة. Resuspend حبات الحمض النووي ملزمة في 17 ميكرولتر من TE منخفضة. الحمض النووي للمكتبات المتحولة في الجسم الحي وفي المختبر نمت استخراج ومجزأة في ultrasonicator أظهرت غالبية شظايا تمتد بين 100 و 400 أزواج قاعدة. يمكن ملاحظة موقع عمليات الإدراج بوساطة الإرسال والاستقبال عبر أربعة replicons من سلالة Burkholderia gladioli الجينوم A في جراب.ويمكن ملاحظة ملخص لإخراج التسلسل وعدد عمليات الإدراج والجينات الفريدة التي ضربت في التكاثر الثلاث في المكتبات الحية وفي المختبر في الجدول. الشيء المهم هو أن نتذكر لحساب حجم عنق الزجاجة السكان خلال الاستعمار المضيف للحصول على تمثيل مناسب للمكتبة أثناء العدوى. أيضا، ضبط لعدد متوافق من الأجيال البكتيرية في المختبر وفي المضيف.بعد إنشاء مكتبة متحولة transposon ، يمكن فحصها على وسائل الإعلام الانتقائية لاستعادة المسوخ على أساس الاختلافات الظاهرية. وبالتالي يمكن تحديد جينات محددة مهمة لحالة ما.

Research

JoVE Journal

Biology

Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

استخدام Rotorod كأسلوب للتحليل النوعي من المشي في الجرذ

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

جهاز ميكروفلويديك الانجذاب الكيميائي لقياس تركيز البكتيريا في التدرجات مستقرة

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

ضوء مترابط والمجهر الإلكتروني (CLEM) كأداة لتصور الجزيئات Microinjected وحقيقية النواة من الأهداف الفرعية الخلوية


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Electroantennographic الأحيائي كأداة فحص لمواد متطايرة النبات المضيف

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

باستخدام SecM تسلسل توقيف كأداة لعزل البروتينية منضم ريبوسوم

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

BEST: Barcode Enabled Sequencing of Tetrads

أفضل: الباركود تمكين تسلسل Tetrads

Tetrad analysis is a valuable tool for yeast genetics, but the laborious manual nature of the process has hindered its application on large scales. ...

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

بروتين ج-FOS كشف Immunohistological: أداة مفيدة كعلامة للممرات الوسطى تشارك في الاستجابات الفسيولوجية محددة<em&gt; في فيفو</em&gt; و<em&gt; فيفو السابقين</em

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

والأحيائي بسيط لتقييم العوامل الأوعية الدموية غشائي النمو

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

بمساعدة الليزر تسليخ مجهري (لام) كأداة للالترانسكربتي التنميط من أنواع الخلايا الفردية

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...