Name: transposon-insertion sequencing as a tool to elucidate bacterial colonization factors in a burkholderia gladioli symbiont of lagria villosa beetles
Uploaded: 2021-08-12T15:00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles at JoVE.co

Vi er taknemmelige for Junbeom Lee for at give E. coli WM3064 + pRL27 stamme til bøjning og vejledning i proceduren, Kathrin Hüffmeier for at hjælpe med fejlfinding under mutant bibliotek generation, og Prof. André Rodrigues for at støtte insekt indsamling og tilladelse erhvervelse. Vi takker også Rebekka Janke og Dagmar Klebsch for støtte i indsamlingen og opdræt af insekterne. Vi anerkender de brasilianske myndigheder for at give følgende tilladelser til adgang, indsamling og eksport af insektprøver: SISBIO-godkendelse Nr. 45742-1, 45742-7 og 45742-10, CNPq-proces nº 01300.004320/2014-21 og 01300.0013848/2017-33, IBAMA Nr. 14BR016151DF og 20BR035212/DF). Denne forskning blev støttet af midler fra German Science Foundation (DFG) Research Grants FL1051/1-1 og KA2846/6-1.

<ol>
	<li>Cain, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+advances+in+transposon-insertion+sequencing.">A decade of advances in transposon-insertion sequencing.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (9), 526-540 (2020).</li><li>Chao, M. C., Abel, S., Davis, B. M., Waldor, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+design+and+analysis+of+transposon+insertion+sequencing+experiments.">The design and analysis of transposon insertion sequencing experiments.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (2), 119-128 (2016).</li><li>Barquist, L., Boinett, C. J., Cain, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+querying+bacterial+genomes+with+transposon-insertion+sequencing.">Approaches to querying bacterial genomes with transposon-insertion sequencing.</a> RNA Biology. 10 (7), 1161-1169 (2013).</li><li>Fl&#243;rez, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic-producing+symbionts+dynamically+transition+between+plant+pathogenicity+and+insect-defensive+mutualism.">Antibiotic-producing symbionts dynamically transition between plant pathogenicity and insect-defensive mutualism.</a> Nature Communications. 8 (1), 15172 (2017).</li><li>Fl&#243;rez, L. V., Kaltenpoth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbiont+dynamics+and+strain+diversity+in+the+defensive+mutualism+between+Lagria+beetles+and+Burkholderia.">Symbiont dynamics and strain diversity in the defensive mutualism between Lagria beetles and Burkholderia.</a> Environmental Microbiology. 19 (9), 3674-3688 (2017).</li><li>Fl&#243;rez, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antifungal+polyketide+associated+with+horizontally+acquired+genes+supports+symbiont-mediated+defense+in+Lagria+villosa+beetles.">An antifungal polyketide associated with horizontally acquired genes supports symbiont-mediated defense in Lagria villosa beetles.</a> Nature Communications. 9 (1), 2478 (2018).</li><li>. FastQC A quality control tool for high throughput sequence data Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2012)</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+A+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FeatureCounts:+An+efficient+general+purpose+program+for+assigning+sequence+reads+to+genomic+features.">FeatureCounts: An efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features.</a> Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Gayt&#225;n, M. O., Mart&#237;nez-Santos, V. I., Soto, E., Gonz&#225;lez-Pedrajo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+three+secretion+system+in+attaching+and+effacing+pathogens.">Type three secretion system in attaching and effacing pathogens.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 129 (2016).</li><li>Hachani, A., Wood, T. E., Filloux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+VI+secretion+and+anti-host+effectors.">Type VI secretion and anti-host effectors.</a> Current Opinion in Microbiology. 29, 81-93 (2016).</li><li>Deep, A., Chaudhary, U., Gupta, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing+and+bacterial+pathogenicity:+From+molecules+to+disease.">Quorum sensing and bacterial pathogenicity: From molecules to disease.</a> Journal of Laboratory Physicians. 3 (1), 4-11 (2011).</li><li>Silva, A. J., Benitez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+cholerae+biofilms+and+cholera+pathogenesis.">Vibrio cholerae biofilms and cholera pathogenesis.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (2), 0004330 (2016).</li><li>Navarro-Garcia, F., Ruiz-Perez, F., Cataldi, &. #. 1. 9. 3. ;., Larz&#225;bal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+VI+secretion+system+in+pathogenic+Escherichia+coli:+structure,+role+in+virulence,+and+acquisition.">Type VI secretion system in pathogenic Escherichia coli: structure, role in virulence, and acquisition.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1965 (2019).</li><li>Ribet, D., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+bacterial+pathogens+colonize+their+hosts+and+invade+deeper+tissues.">How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues.</a> Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).</li><li>Schwarz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burkholderia+Type+VI+secretion+systems+have+distinct+roles+in+eukaryotic+and+bacterial+cell+interactions.">Burkholderia Type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions.</a> PLoS Pathogens. 6 (8), 1001068 (2010).</li><li>Jones, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kill+and+cure:+genomic+phylogeny+and+bioactivity+of+Burkholderia+gladioli+bacteria+capable+of+pathogenic+and+beneficial+lifestyles.">Kill and cure: genomic phylogeny and bioactivity of Burkholderia gladioli bacteria capable of pathogenic and beneficial lifestyles.</a> Microbial Genomics. 7 (1), 000515 (2021).</li><li>Takeshita, K., Kikuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Riptortuspedestris+and+Burkholderia+symbiont:+an+ideal+model+system+for+insect-microbe+symbiotic+associations.">Riptortuspedestris and Burkholderia symbiont: an ideal model system for insect-microbe symbiotic associations.</a> Research in Microbiology. 168 (3), 175-187 (2017).</li><li>Powell, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+screen+identifies+host+colonization+determinants+in+a+bacterial+gut+symbiont.">Genome-wide screen identifies host colonization determinants in a bacterial gut symbiont.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (48), 13887-13892 (2016).</li><li>Brooks, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+discovery+of+colonization+determinants+in+the+squid+symbiont+Vibrio+fischeri.">Global discovery of colonization determinants in the squid symbiont Vibrio fischeri.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17284-17289 (2014).</li><li>Somprasong, N., McMillan, I., Karkhoff-Schweizer, R. R., Mongkolsuk, S., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+genetic+manipulation+of+Burkholderia+gladioli+pathovar+cocovenenans.">Methods for genetic manipulation of Burkholderia gladioli pathovar cocovenenans.</a> BMC Research Notes. 3 (308), (2010).</li><li>Garcia, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burkholderia+thailandensis:+Genetic+manipulation.">Burkholderia thailandensis: Genetic manipulation.</a> Current Protocols in Microbiology. 45, 1-15 (2017).</li><li>Headd, B., Bradford, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conjugation+window+in+an+Escherichia+coli+K-12+strain+with+an+IncFII+plasmid.">The conjugation window in an Escherichia coli K-12 strain with an IncFII plasmid.</a> Applied and Environmental Microbiology. 86 (17), 00948 (2020).</li><li>Van Opijnen, T., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+insertion+sequencing:+A+new+tool+for+systems-level+analysis+of+microorganisms.">Transposon insertion sequencing: A new tool for systems-level analysis of microorganisms.</a> Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 435-442 (2013).</li><li>Gallagher, L. A., Ramage, E., Patrapuvich, R., Weiss, E., Brittnacher, M., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-defined+transposon+mutant+library+of+Burkholderia+thailandensis.">Sequence-defined transposon mutant library of Burkholderia thailandensis.</a> mBio. 4 (6), 00604-00613 (2013).</li><li>Wong, Y. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candidate+essential+genes+in+Burkholderia+cenocepacia+J2315+identified+by+genome-wide+TraDIS.">Candidate essential genes in Burkholderia cenocepacia J2315 identified by genome-wide TraDIS.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1288 (2016).</li><li>Moule, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+saturation+mutagenesis+of+Burkholderia+pseudomallei+K96243+predicts+essential+genes+and+novel+targets+for+antimicrobial+development.">Genome-wide saturation mutagenesis of Burkholderia pseudomallei K96243 predicts essential genes and novel targets for antimicrobial development.</a> mBio. 5 (1), 00926 (2014).</li><li>Ding, Q., Tan, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Himar1+transposon+for+efficient+random+mutagenesis+in+Aggregatibacter+actinomycetemcomitans.">Himar1 transposon for efficient random mutagenesis in Aggregatibacter actinomycetemcomitans.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1842 (2017).</li><li>Green, B., Bouchier, C., Fairhead, C., Craig, N. L., Cormack, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+site+preference+of+Mu,+Tn5,+and+Tn7+transposons.">Insertion site preference of Mu, Tn5, and Tn7 transposons.</a> Mobile DNA. 3, 3 (2012).</li><li>Lodge, J. K., Weston-Hafer, K., Berg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+Tn5+target+specificity:+Preference+for+insertion+at+G/C+pairs.">Transposon Tn5 target specificity: Preference for insertion at G/C pairs.</a> Genetics. 120 (3), 645-650 (1988).</li><li>Ar&#225; Ujo, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequencing+and+transposon+mutagenesis+of+Burkholderia+seminalis+TC3.4.2R3+identify+genes+contributing+to+suppression+of+orchid+necrosis+caused+by+B.+gladioli.">Genome sequencing and transposon mutagenesis of Burkholderia seminalis TC3.4.2R3 identify genes contributing to suppression of orchid necrosis caused by B. gladioli.</a> Molecular Plant-microbe Interactions: MPMI. 29 (6), 435-446 (2016).</li><li>Dobritsa, A. P., Samadpour, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reclassification+of+Burkholderiainsecticola+as+Caballeroniainsecticola+comb.+nov.+and+reliability+of+conserved+signature+indels+as+molecular+synapomorphies.">Reclassification of Burkholderiainsecticola as Caballeroniainsecticola comb. nov. and reliability of conserved signature indels as molecular synapomorphies.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 69 (7), 2057-2063 (2019).</li><li>Ohbayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect's+intestinal+organ+for+symbiont+sorting.">Insect's intestinal organ for symbiont sorting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 5179-5188 (2015).</li><li>Ross, C., Scherlach, K., Kloss, F., Hertweck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+conjugated+polyyne+biosynthesis+in+phytopathogenic+bacteria.">The molecular basis of conjugated polyyne biosynthesis in phytopathogenic bacteria.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (30), 7794-7798 (2014).</li><li>Atkins, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutant+of+Burkholderia+pseudomallei,+auxotrophic+in+the+branched+chain+amino+acid+biosynthetic+pathway,+is+attenuated+and+protective+in+a+murine+model+of+melioidosis.">A mutant of Burkholderia pseudomallei, auxotrophic in the branched chain amino acid biosynthetic pathway, is attenuated and protective in a murine model of melioidosis.</a> Infection and Immunity. 70 (9), 5290-5294 (2002).</li></ol>

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikt vedrørende undersøgelsen.

En B. gladioli transposon mutant bibliotek blev genereret for at identificere vigtige værts kolonisering faktorer i symbiotiske samspil mellem L. villosa biller og B. gladioli bakterier. De vigtigste skridt i protokollen var bøjning, host-infektion, DNA-bibliotek forberedelse, og sekventering.
Da mange stammer af Burkholderia er modtagelige for genetisk modifikation vedbøjning 24,25, plasmid transporterer transposon og antibiotika indsættelse kassette blev konjugeret med succes i målet B. gladioli Lv-StA stamme fra E. coli. Tidligere forsøg på transformation ved elektroporation gav meget lav til næsten ingen B. gladioli transformanter. Det er tilrådeligt at optimere transformationsteknikken for målorganismen til effektivt at give et stort antal transformanter.
En runde af bøjning og 40 bøjning pletter forstyrret 3.736 gener i B. gladioli Lv-StA. Set i bakspejlet, flere runder af bøjning ville være nødvendigt at forstyrre de fleste af de 7.468 gener og få et mættet bibliotek. Især inkubationstiden under bøjningen fik ikke lov til at overstige 12-18 timer, hvilket er afslutningen på den eksponentielle vækstfase af B. gladioli. Hvis du tillader bøjning ud over den eksponentielle vækstfase af bakterieceller reducerer chancerne for succes for at opnå transkonjuganter26. Derfor bør bøjningsperioden justeres i henhold til bakterieartens vækst.
For at kunne udføre et eksperiment, der involverer infektion af mutant biblioteker i en vært, er det vigtigt at vurdere den bakterielle befolkning flaskehals størrelse under kolonisering og mangfoldigheden af mutanter i biblioteket før infektion1,2,27. Som forberedelse til eksperimentet anslog vi det mindste antal biller, der skal inficeret, for at have en stor chance for, at hver mutant i biblioteket prøves og får lov til at kolonisere. Den omtrentlige in vivo bakterieproduktionstid og antallet af generationer for eksperimentets varighed blev også beregnet. In vitro-kulturen blev derefter vokset op til et sammenligneligt antal generationer ved at justere inkubationstiden. For et lignende infektionseksperiment hos andre ikke-modelværter er evnen til at opretholde en laboratoriekultur og en konstant kilde til værtsorganismerne ønskelig.
Efter væksten af det mutante bibliotek in vivo og in vitro og prøvesamling blev der udført en modificeret DNA-biblioteksforberedelsesprotokol til transposon indsættelsessekvensering. Ændringen i protokollen involverede design af brugerdefinerede PCR-primere og tilføjelse af PCR-trin for at vælge dna-fragmenter, der indeholder indsætningskassetten. Da protokollen blev tilpasset, øgede yderligere PCR-cyklusser i protokollen risikoen for overamplificering og opnåelse af hybridiserede adapterkortfragmenter i slutbibliotekerne. Derfor anbefales et sidste oprydningstrin (uden størrelsesvalg) efter de to PCR'er, da det hjælper med at fjerne disse fragmenter. Størrelsen fordeling af DNA-biblioteker var stadig bredere end forventet. En forøgelse af sekventeringsdybden gav imidlertid tilstrækkelige data, der blev filtreret under bioinformatikanalysen, hvilket gav tilfredsstillende resultater.
Som transposon-medieret mutagenese genererer tusindvis af tilfældige indsættelser i et enkelt eksperiment, er det muligt at generere et mættet bibliotek af mutanter, der indeholder alle undtagen de mutanter, hvor gener afgørende for bakterievækst er blevet forstyrret. Vi sandsynligvis ikke arbejde med en mættet mutant bibliotek, i betragtning af skøn over væsentlige gener i andre undersøgelser på Burkholderia sp. 28,29. Et ikke-mættet bibliotek hjælper ikke desto mindre med at udforske forskellige kandidatgener til yderligere undersøgelser ved hjælp af målrettet mutagenese. Før forsøgene er det også vigtigt at huske, at nogle transposoner har specifikke indsætningsmålsteder, der øger overfloden af mutanter på visse loci i genomet30. Mariner transposoner er kendt for at målrette AT steder for indsættelse31, og Tn5 transposons har en GC bias32,33. Herunder trin under bioinformatik analyse til at genkende hotspots for transposon indsættelser vil hjælpe med at vurdere enhver fordeling bias.
Selvom tilbøjelige til tilbageslag, en veldesignet transposon indsættelse sekventering eksperiment kan være et kraftfuldt værktøj til at identificere mange betinget vigtige gener i bakterier inden for et enkelt eksperiment. For eksempel blev et dusin gener i Burkholderia seminalis vigtige for undertrykkelsen af orkidéblad nekrose identificeret ved at kombinere transposon mutagenese og genomforskning34. Ud over Burkholderia, flere vedhæftning og motilitet gener og transportører er blevet identificeret som vigtige kolonisering faktorer i Snodgrassella alvi symbionts af Apis mellifera (Honeybee)22, og i Vibrio fischerii symbionter af Euprymna scolopes (Hawaiian bobtail blæksprutte)23 ved hjælp af transposon-indsættelse mutagenese tilgang.
Som en alternativ tilgang, transposon mutagenese kan efterfølges af screening for de enkelte mutanter ved hjælp af selektive medier i stedet for sekventering. Fænotypisk screening eller bioassays at identificere mangler, såsom motilitet, produktion af bioaktive sekundære metabolitter, eller specifikke auxotrophies, er mulige. For eksempel har screening af et Burkholderia insecticola (omfordelt til slægten Caballeronia35) transposon mutantbibliotek været nøglen til at identificere, at symbionterne anvender motilitetsgener til kolonisering af Riptortus pedestris, deres insektvært36. Desuden blev den biosynetiske genklynge til den bioaktive sekundære metabolitcaryoynencin identificeret i Burkholderia caryophylli37ved hjælp af transposon mutagenese og fænotypisk screening. En auxotrofisk mutant af Burkholderia pseudomallei blev identificeret efter transposon mutagenese og screening og er en mulig svækket vaccine kandidat mod melioidosis, en farlig sygdom hos mennesker og dyr38. Således transposon mutagenese og sekventering er en værdifuld tilgang til at studere de molekylære træk af bakterier, der er vigtige for samspillet med deres respektive værter i patogene eller mutualistiske foreninger.

Burkholderia gladioli kan engagere sig i en symbiotisk tilknytning til Lagria villosa biller, der spiller en vigtig rolle i forsvaret mod mikrobielle antagonister af insektværten4,5,6. Kvindelige biller huser flere stammer af B. gladioli i specialiseret kirtler tilbehør til det reproduktive system. Ved æglægning smører hunnerne B. gladioli-celler på ægoverfladen, hvor antimikrobielle forbindelser produceret af B. gladioli hæmmer infektioner ved entomopatogene svampe4,6. Under sen embryonal udvikling eller tidligt efter larverne luge koloniserer bakterierne cuticular invaginationer på larvernes dorsale overflade. På trods af denne specialiserede lokaliserings- og vertikale transmissionsrute for symbionterne kan L. villosa formentlig også erhverve B. gladioli vandret fra miljøet4. Desuden er mindst tre stammer af B. gladioli blevet fundet i samarbejde med L. villosa4,6. Blandt disse er B. gladioli Lv-StA den eneste, der er modtagelig for dyrkning in vitro.
B. gladioli Lv-StA har et genomstørrelse på 8,56 Mb6 og indeholder 7.468 gener. Hvilke af disse gener er vigtige for B. gladioli bakterier at kolonisere bille vært? For at besvare dette spørgsmål brugte vi transposon-indsættelse sekventering (Tn-seq), en udforskende metode til at identificere betinget væsentlige mikrobielle gener1,2,3. Et mutant bibliotek af B. gladioli Lv-StA blev oprettet ved hjælp af en Tn5 transposon. Gennem bøjning fra Escherichia coli donorceller til B. gladioli Lv-StA, en pRL27 plasmid transporterer Tn5 transposon og en antibiotikaresistens kassette flankeret af omvendte gentagelser blev overført (figur 1). Derved blev der genereret et sæt mutanter, der individuelt bærer forstyrrelser af 3.736 symbiontgener (Figur 2).
Den mutante pool blev inficeret på billeæg for at identificere koloniseringsfaktorerne og blev som kontrol også dyrket in vitro i King's B (KB) medium. Efter at have givet tilstrækkelig tid til kolonisering blev udklækkede larver indsamlet og samlet til DNA-ekstraktion. Dna-fragmenter, der indeholder transposonindsatsen og den flankerende genomiske region B. gladioli Lv-StA, blev udvalgt ved hjælp af en modificeret DNA-biblioteksforberedelsesprotokol til sekventering. Læs kvalitetsbehandling efterfulgt af analyse med DESeq2 blev udført for at identificere specifikke gener, der er afgørende for B. gladioli Lv-StA for at kolonisere L. villosa larver, når de overføres via ægoverfladen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,6- Diaminopimelic Acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B22391</td>
			<td>For E.coli WM3064+ pRL27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar - Agar</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure beads XP (magentic beads + polyethylene glycol + salts)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td>Size selection in step 6.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach (NaOCl) 12%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie2 v.2.4.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinfromatic tool for read mapping. Reference 10 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer-S</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>PEQL01-1020</td>
			<td>For PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutadapt v.2.10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatic tool for removing specific adapter sequences from the reads. Reference 8 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DESeq2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RStudio package for assessing differential mutant abundance. Usually used for RNAseq analysis. Reference 12 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder 100 bp</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T834.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>R0182</td>
			<td>PCR for confirming success of conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Di-Sodium salt</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epicentre MasterPure Complete DNA and RNA Purification Kit</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>MC85200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2218.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastQC v.0.11.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatic tool for assessing the quality of sequencing data. Reference 7 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeatureCounts v.2.0.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatic tool to obtain read counts per genomic feature. Reference 11 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>7530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Serva</td>
			<td>26899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>4936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td>Roth</td>
			<td>PO27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index primers set 1)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7335S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7645S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone (soybean)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2365</td>
			<td>For Burkholderia gladioli Lv-StA KB-medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peqGOLD &#39;Hot&#39; Taq- DNA Polymerase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PEQL01-1020</td>
			<td>PCR for confirming success of conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates - 145 x 20 mm</td>
			<td>Roth</td>
			<td>XH90.1</td>
			<td>For selecting transconjugants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates - 90 x 16 mm</td>
			<td>Roth</td>
			<td>N221.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiaxcel (StarSEQ GmbH, Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Quality check after DNA library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin beads</td>
			<td>Roth</td>
			<td>HP57.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>01-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic v.0.36</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatic tool for trimming low quality reads and also adapter sequences. Reference 9 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris -HCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9090.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2366</td>
			<td>For Escherichia coli WM3064+pRL27 LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td>Bandelin</td>
			<td>GM 70 HD</td>
			<td>For shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER enzyme (uracil DNA glycosylase + DNA glycosylase- lyase Endonuclease VIII)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7645S</td>
			<td>Ligation step 6.5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2363</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transposon-insertion sequencing as a tool to elucidate bacterial colonization factors in a burkholderia gladioli symbiont of lagria villosa beetles

Udlede funktionen af gener ved at manipulere deres aktivitet er et vigtigt redskab til at forstå de genetiske fundamenter af de fleste biologiske processer. Fremskridt inden for molekylær mikrobiologi har set fremkomsten af forskellige mutagenese teknikker til manipulation af gener. Blandt dem er transposon-indsættelse sekventering (Tn-seq) et værdifuldt værktøj til samtidig at vurdere funktionaliteten af mange kandidat gener i en uformålt måde. Teknikken har været nøglen til at identificere molekylære mekanismer til kolonisering af eukaryote værter i flere patogene mikrober og et par gavnlige symbionter.
Her er Tn-seq etableret som en metode til at identificere koloniseringsfaktorer i en mutualistisk Burkholderia gladioli symbiont af billen Lagria villosa. Ved bøjning udføres Tn5 transposon-medieret indsættelse af en antibiotikaresistenskassette på tilfældige genomiske steder i B. gladioli. For at identificere effekten af genforstyrrelser på bakteriernes evne til at kolonisere billeværten podes det genererede B. gladioli transposon-mutant bibliotek på billeægene, mens en kontrol dyrkes in vitro i et flydende kulturmedium. Efter at have givet tilstrækkelig tid til kolonisering, dna er udvundet fra in vivo og in vitro dyrkede biblioteker. Efter en DNA-bibliotek forberedelse protokol, dna-prøverne er forberedt til transposon-indsættelse sekventering. DNA-fragmenter, der indeholder transposon-insert kant og flankerende bakteriel DNA er valgt, og mutation steder bestemmes ved sekventering væk fra transposon-insert kant. Endelig, ved at analysere og sammenligne frekvenserne af hver mutant mellem in vivo og in vitro biblioteker, betydningen af specifikke symbiont gener under bille kolonisering kan forudsiges.

Host-associerede bakterier kan anvende flere faktorer til at etablere en forening, herunder dem, der formidler vedhæftning, motilitet, chemotaxis, stressresponser eller specifikke transportører. Mens faktorer, der er vigtige for patogen-værtsinteraktioner, er blevet rapporteret for flere bakterier13,14,15,16,17,18, herunder medlemmer af slægten Burkholderia19,20, har færre undersøgelser undersøgt de molekylære mekanismer, der anvendes af gavnlige symbionter til kolonisering21,22,23 . Ved hjælp af transposon indsættelse sekventering, var målet at identificere molekylære faktorer, der gør det muligt for B. gladioli at kolonisere L. villosa biller.
Transposon-medieret mutagenese blev udført ved hjælp af pRL27 plasmid, som bærer en Tn5 transposon og en kanamycin modstand kassette flankeret af invertere gentagne steder. Plasmiden blev indført i mål B. gladioli Lv-StA-cellerne ved bøjning med plasmiddonor E. coli WM3064-stammen (som vist i figur 1). Efter bøjning blev bøjningsblandingen, der indeholder B. gladioli-modtager og E. coli-donorceller, forgyldt på selektive agarplader, der indeholder kanamycin. Fraværet af DAP på pladerne eliminerede donor E. coli-cellerne, og tilstedeværelsen af kanamycin udvalgt til vellykket B. gladioli Lv-StA transkonjuganter. Det samlede B. gladioli Lv-StA mutantbibliotek opnået ved at høste de 100.000 transkonjugankolonier blev forberedt til sekventering ved hjælp af et modificeret DNA-biblioteksforberedelsessæt og tilpassede primere. Figur 2 fremhæver DNA-bibliotekets forberedelsestrin. Sekventering gav 4 Mio parret læser; 3.736 gener ud af 7.468 gener i B. gladioli Lv-StA blev forstyrret.
For at identificere mutanter, der var koloniserings-defekte i værten, blev B. gladioli Lv-StA mutant biblioteket inficeret på billeæg og dyrket in vitro i KB medium som en kontrol. In vivo kolonisering flaskehals størrelse blev beregnet før eksperimentet. Et kendt antal B. gladioli Lv-StA-celler blev inficeret på billeæg, og antallet af koloniserende celler i friskklækkede første instar larver blev opnået ved at plating en suspension fra hver larve og tælle kolonidannende enheder pr. Individ. Disse beregninger blev gjort for at sikre, at antallet af koloniserende celler er nok til at vurdere alle eller en høj procentdel af mutanterne i biblioteket for deres evne til at kolonisere værten. Derudover blev væksttiden mellem in vitro- og in vivo-tilstande normaliseret baseret på antallet af bakteriegenerationer for at gøre disse prøver sammenlignelige.
Efter æggene blev udklækket, blev 1.296 larver indsamlet i 13 pools. De tilsvarende in vitro mutant kulturer blev dyrket og opbevaret som glycerol bestande. DNA af in vivo og in vitro dyrkede mutant biblioteker blev ekstraheret og fragmenteret i en ultralydsenhed. Figur 3 viser størrelsen fordeling af den forskydnings-DNA, hvor størstedelen af fragmenterne spænder mellem 100 og 400 bp, som forventet. Dette trin blev efterfulgt af den ændrede DNA-bibliotek forberedelse protokol til sekventering. Ved hvert trin i protokollen blev koncentrationen af resterende DNA kontrolleret for at sikre, at trinene blev udført korrekt og for at spore tab af DNA. Et kvalitetskontrol (se Materialetabellen)før sekventering afslørede, at DNA-bibliotekerne indeholdt uventet store DNA-fragmenter (>800 bp), og dette var mere udtalt i in vivobibliotekerne. I betragtning af vanskeligheden ved at optimere klyngedannelsen af fragmenter i sekventeringsbanerne var det nødvendigt at øge sekventeringsdybden til 10 Mio parrede aflæsninger i in vivobibliotekerne for at nå det ønskede antal aflæsninger. Analysen af sekventeringsresultaterne viste, at gennemsnitligt 4 Mio læser i in vivobibliotekerne, og 3,1 Mio. Fordelingen af de 24.224 unikke indsættelser på tværs af B. gladioli genomet i det oprindelige bibliotek er vist i figur 4. En analyse foretaget ved hjælp af DESeq2 viste, at overfloden af 271 mutanter var signifikant forskellig mellem in vivo- og in vitro-forholdene. 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62843/62843fig03.jpg"> Figur 3: Agarose geler af en mutant og DNA-biblioteker. (A) Agarose gel med uhørt DNA af en mutant i bane x og en 1 kbp stige til skala. (B) Gel med klippet DNA-bibliotek. Stigens båndstørrelser i første vognbane er angivet i venstre side. De første tre baner a, b og c indeholder forskydning DNA-fragmenter af in vivo biblioteker. Baner d, e, f og g indeholder forskydede DNA-fragmenter af in vitro-bibliotekerne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62843/62843fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62843/62843fig04.jpg"> Figur 4: Placering af unikke indsættelsessteder i det oprindelige bibliotek på tværs af de fire replikoner i Burkholderia gladioli Lv-StA genomet. Hver søjle langs x-aksen er placeret på et indsættelsessted. Højden af en søjle langs y-aksen svarer til antallet af aflæsninger, der er knyttet til det pågældende websted. Bemærk, at de to kromosomer og to plasmider er vist i fuld længde og dermed har forskellige skalaer på x-aksen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62843/62843fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Kongens B medium / agar</td>
		</tr>
<tr>
<td>Peptone (sojabønner)</td>
			<td>20 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>K2HPO4
</td>
			<td>1,5 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td>1,5 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Agar</td>
			<td>15 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Opløst i destilleret vand</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">LB medium/agar</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tryptone</td>
			<td>10 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gærekstrakt</td>
			<td>5 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>10 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Opløst i destilleret vand</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Mediekomponenter.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nej.</td>
			<td>Primere</td>
			<td colspan="2">Sekvens</td>
			<td>PCR-udglødning temp. (°C)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>tpnRL17–1RC</td>
			<td colspan="2">5'-CGTTACATCCCTGGCTTGTT-3'</td>
			<td rowspan="2">58.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>tpnRL13-2RC</td>
			<td colspan="2">5'-TCGTGAAGAAGGTGTTGCTG-3'</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Primere til at bekræfte succesen med bøjning.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Komponent</td>
			<td>Volumen (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HPLC-renset vand</td>
			<td>4.92</td>
		</tr>
<tr>
<td>10x Buffer S (høj specificitet)</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2 (25 mM)</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTPs (2 mM)</td>
			<td>1.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer 1 (10 pmol/μL)</td>
			<td>0.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer 2 (10 pmol/μL)</td>
			<td>0.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Taq (5 U/μL)</td>
			<td>0.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mastermix total</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Skabelon</td>
			<td>1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 3: PCR master mix for at bekræfte succesen af bøjning. Forkortelser: HPLC = højtydende flydende kromatografi; dNTPs = deoxynucleoside triphosphat.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Trin</td>
			<td>Temperatur °C</td>
			<td>Tidspunkt</td>
			<td>Cykler</td>
		</tr>
<tr>
<td>Indledende denaturering</td>
			<td>95</td>
			<td>3 min.</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Denaturering</td>
			<td>95</td>
			<td>40 s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Udglødning</td>
			<td>58.2</td>
			<td>40 s</td>
			<td>30 til 35</td>
		</tr>
<tr>
<td>Forlængelse</td>
			<td>72</td>
			<td>1-2 min</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Endelig forlængelse</td>
			<td>72</td>
			<td>4 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Holde</td>
			<td>4</td>
			<td colspan="2">∞</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 4: PCR-betingelser for at bekræfte bøjningens succes.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Primere</td>
			<td colspan="2">Sekvens</td>
			<td>Tm °C</td>
			<td>Brug</td>
			<td>Kilde</td>
		</tr>
<tr>
<td>Transposon-specifik biotinyleret primer</td>
			<td colspan="2">5'-Biotin-ACAGGAACACTTAACGGCTGACATG -3'</td>
			<td>63.5</td>
			<td>6.7.1. PCR I</td>
			<td>Sædvane</td>
		</tr>
<tr>
<td>Modificeret Universal PCR-primer</td>
			<td colspan="2">5'- AATGATACGGCGACCACCGAGATC TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCCCCCCCCCCC TTCCGATCTGAATTCATCGATGAT GGTTGAGATGTGT – 3'</td>
			<td>62</td>
			<td>6.10.1. PCR II</td>
			<td>Sædvane</td>
		</tr>
<tr>
<td>Indeksprimer</td>
			<td colspan="3">Se producentens manual</td>
			<td>6.7.1. PCR I & 6.10.1. PCR II</td>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Indeks primere sæt 1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Adapter</td>
			<td colspan="3">Se producentens manual</td>
			<td>6.5. Adapter ligation</td>
			<td>NEBNext Ultra II DNA-bibliotek prep kit til Illumina</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 5: Primere og adapter til PCR I og II under forberedelse af DNA-biblioteket. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>PCR mix</td>
			<td>(μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Adapter-ligated DNA-fragmenter</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>NEBNext Ultra II Q5 master mix</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Indeksprimer (10 pmol/ μL)</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Transposon specifik biotinyleret primer (10 pmol/ μL)</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Samlet volumen</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 6: FORBEREDELSE AF DNA-bibliotek-PCR I master mix.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Trin</td>
			<td>Temperatur</td>
			<td>Tidspunkt</td>
			<td>Cykler</td>
		</tr>
<tr>
<td>Indledende denaturering</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>30 s</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Denaturering</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>10 s</td>
			<td rowspan="3">6 til 12</td>
		</tr>
<tr>
<td>Udglødning</td>
			<td>65 °C</td>
			<td>30 s</td>
		</tr>
<tr>
<td>Forlængelse</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>30 s</td>
		</tr>
<tr>
<td>Endelig forlængelse</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>2 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Holde</td>
			<td>16 °C</td>
			<td colspan="2">∞</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 7: Forberedelse af DNA-bibliotek-PCR I og II-forhold.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>PCR mix</td>
			<td>(μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Perlevalgt DNA</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>NEBNext Ultra II Q5 master mix</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Indeksprimer</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Modificeret universel PCR-primer</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Samlet volumen</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 8: Forberedelse af DNA-bibliotek-PCR II master mix.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Biblioteker</td>
			<td>Invivo-1</td>
			<td>Invivo-2</td>
			<td>Invivo-3</td>
			<td>Invitro-1</td>
			<td>Invitro-2</td>
			<td>Invitro-3</td>
			<td>Oprindeligt bibliotek</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Nej. af læser (PE)</td>
			<td>56,57,710</td>
			<td>39,19,051</td>
			<td>30,65,849</td>
			<td>35,73,494</td>
			<td>28,83,440</td>
			<td>36,61,956</td>
			<td>46,09,410</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Nej. aflæsninger indeholdende Tn – kant på 5 ' slutningen af Read-1</td>
			<td>54,15,880</td>
			<td>37,31,169</td>
			<td>29,36,247</td>
			<td>33,00,499</td>
			<td>27,35,705</td>
			<td>33,50,402</td>
			<td>41,53,270</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Bowtie2 samlede justeringshastighed (%) (skrivebeskyttet kun)</td>
			<td>95.53%</td>
			<td>83.71%</td>
			<td>89.87%</td>
			<td>80.79%</td>
			<td>78.00%</td>
			<td>73.06%</td>
			<td>74.92%</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Antal entydige indsættelser</td>
			<td>8,539</td>
			<td>4,134</td>
			<td>7,183</td>
			<td>18,930</td>
			<td>18,421</td>
			<td>20,438</td>
			<td>24,224</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Antal gener ramt</td>
			<td>1575</td>
			<td>993</td>
			<td>1450</td>
			<td>2793</td>
			<td>2597</td>
			<td>3037</td>
			<td>3736</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 9: Oversigt over rækkefølgen af output og transposon indsættelse frekvens pr bibliotek. Forkortelse: PE = paired-end.

Watch this Scientific Journal Video about Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles at JoVE.co

Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles

Dette er en tilpasset metode til at identificere kandidat insekt kolonisering faktorer i en Burkholderia gavnlig symbiont. Billeværten er inficeret med et tilfældigt mutantbibliotek genereret via transposon mutagenese, og bibliotekets kompleksitet efter kolonisering sammenlignes med en kontrol dyrket in vitro.

Transposon-indsættelse Sekventering som et redskab til at belyse bakterielle kolonisering faktorer i en Burkholderia gladioli Symbiont af Lagria villosa Biller

Inferring the function of genes by manipulating their activity is an essential tool for understanding the genetic underpinnings of most biological ...

Denne protokol er nyttig til at udføre genetisk manipulation på symbiotiske bakterier, i dette tilfælde specifikt på Burkholderia, og identificere de gener, der er afgørende for kolonisering af en insektvært. Transposon indsættelse sekventering er et kraftfuldt værktøj til at identificere et stort antal betinget væsentlige gener samtidigt i et enkelt eksperiment. Begynd med at vaccinere en frisk donorkultur af E.coli donor i 10 milliliter LB medium suppleret med Kanamycin og DAP under en steril hætte.Pode Burkholderia gladioli stamme En modtager celler i fem milliliter af KB medium. Inkuber kulturer ved 30 grader Celsius natten over på en shaker ved 250 RPM. Efter natten vækst, centrifuge fire milliliter af hver af de kulturer på 9,600 gange G i seks minutter at pellet cellerne og kassere supernatant.Under en steril hætte vaskes de pelleterede cellekulturer i KB-medium, der indeholder DAP. Og endelig, genbruge kulturer separat i fire milliliter af KB plus DAP medium. I et friskt 15 milliliterrør blandes 250 mikroliter af de vaskede E.coli-donorceller med en milliliter af den vaskede Burkholderia gladioli-stamme A-modtagerceller.Spot 10 mikroliter af denne bøjningscelleblanding på KB agarplader, der indeholder DAP. Lad pladen hvile uforstyrret i den sterile hætte ved stuetemperatur i en time. Inkuber pladerne med bøjningspunkterne ved 30 grader Celsius i 12 til 18 timer.Efter inkubation tilsættes to til fire milliliter 1X PBS på pladerne under en steril hætte og bruger en celleskraber til at frigive de dyrkede bakterielle bøjningspunkter fra agaren. Derefter pipette den konjugeret celle blandes i to milliliter mikrofuge rør. Pellet cellerne ved centrifugering ved 9, 600 gange G i to minutter.Kassér supernatanten, og vask pelleten to gange i en milliliter på 1X PBS ved at pipetter op og ned. Resuspend den endelige pellet i 1.200 mikroliter af 1X PBS. Bland godt og spred 100 mikroliter af celleblandingen på store KB agarplader suppleret med Kanamycin og inkuber ved 30 grader Celsius natten over.Tæl det samlede antal transkonjugankolonier på de tre plader og ekstrapoler for at beregne det omtrentlige antal mutanter, der er opnået i alle pladerne. For at øge chancerne for at få et repræsentativt bibliotek skal du sikre dig, at det samlede antal kolonier er flere gange højere end det samlede antal gener i genomet. For at bekræfte bøjningens succes skal du udføre en PCR, der er rettet mod indsættelseskassetten ved hjælp af 10 til 20 prøvekolonier som beskrevet i manuskriptet.Under en steril hætte skrabes kolonierne fra pladerne ved at tilføje en til to milliliter 1X PBS på agaren. Pool celleblandingen skrabet af pladerne i 50 milliliterrør. Vortex biblioteket til at blande grundigt, og derefter opdele en milliliter af den poolede mutant bibliotek i flere cryo rør.Tilsæt en milliliter på 70% glycerol til rørene og opbevares ved minus 80 grader Celsius. Vælg en L.villosa æg kobling og tælle antallet af æg fortsætter, hvis koblingen indeholder mere end 100 æg. For at sterilisere hele ægkoblingen tilsættes 200 mikroliter af 70% ethanol og vask forsigtigt æggene i fem minutter, fjern derefter ethanolen og vask æggene to gange med autoklavet vand.Tilsæt 200 mikroliter af 12% blegemiddel og vask forsigtigt æggene i 30 sekunder. Fjern blegemidlet straks og vask æggene igen tre gange med 200 mikroliter autoklavet vand. Inficere æggene i den steriliserede æg kobling ved hjælp af to gange 10 til de seks celler pr mikroliter af vasket mutant bibliotek i PBS.To dage efter at de inficerede bille larver lukker, opsamles 100 sekunders instar larver pr. 1,5 milliliter mikrofugerør og opbevares ved minus 80 grader Celsius. For at generere in vitro-kontrolbiblioteket podes 250 mikroliter på to gange 10 til de seks celler pr. mikroliter i det mutante bibliotek i 10 milliliter KB-medium, der indeholder Kanamycin. Efter at have udvundet DNA fra in vivo og in vitro-dyrkede mutantbiblioteker, del DNA'et med en ultralydsprocessor.For at kontrollere, om DNA'et blev skåret til det ønskede størrelsesområde, skal du indlæse fem mikroliter af det uhørte og forsaklede DNA efter blanding med gelbelastningsfarve i et en-til-en-forhold på en 1,6% agarosegel, der løber ved 250 volt i 40 minutter. For at forberede de fragmentendere, der kræves til adapter ligation, skal du starte med at tilføje tre mikroliter af enzymblandingen og syv mikroliters reaktionsbuffer til 50 mikroliter af det forsakne DNA og blandes godt ved pipettering. Indstil en termocykel med et opvarmet låg på større end eller lig med 75 grader Celsius og inkubere prøverne i 30 minutter ved 20 grader Celsius og 30 minutter ved 65 grader Celsius, derefter holde temperaturen på fire grader Celsius.Til adapter ligation tilsættes 30 mikroliter ligation master mix, en mikroliter af ligation forstærker og 2,5 mikroliter af fortyndet adapter til produkterne i slutforberedelsestrinnet. Bland grundigt ved at pipettere og inkuberes prøven i 15 minutter ved 20 grader Celsius i termocyklussen med det opvarmede låg af. Efter 15 minutter tilsættes tre mikroliter af enzymet.Bland godt ved pipettering og inkuber prøven i 15 minutter ved 37 grader Celsius i en termocykel med låget opvarmet på større end eller lig med 47 grader Celsius. Hvis du vil vælge størrelsen af adapter ligated DNA rettet mod fragmenter af 250 basepar, skal du starte med at hvirvle den magnetiske perleopløsning og placere den ved stuetemperatur i 30 minutter før brug. Tilsæt 0,3 gange perler til 96,5 mikroliter af den ligated DNA-blanding og blandes ved pipetter grundigt.Inkuber perleblandingen i fem minutter. Placer rørene på en magnetisk stativ til at trække ned perlerne og fjerne DNA-fragmenter af uønsket størrelse. Lad perlerne nøjes i fem minutter og overfør derefter det klare supernatant til et nyt mikrofugerør.Tilsæt 0,15 gange friske perler til supernatanten og bland ved pipettering godt. Inkuber perleblandingen i fem minutter og læg derefter rørene på et magnetisk stativ for at trække perlerne bundet til mål-DNA'et. Vent i fem minutter og kassér derefter supernatanten og hold perlerne.Med perlerne på det magnetiske stativ tilsættes 200 mikroliter frisklavet 80% ethanol og vent i 30 sekunder, før du kasserer ethanolen uden at forstyrre perlerne. Fjern rørene fra stativet, og tilsæt 17 mikroliter på 0,1X TE eller lavt TE, bland derefter ved at pipettere 10 gange og inkuberes blandingen ved stuetemperatur i to minutter. Placer røret på det magnetiske stativ og tag 15 mikroliter af det størrelsesvalgte DNA til PCR-1.Vortex streptavidin perler og placere dem ved stuetemperatur i mindst 30 minutter. Tag 32 mikroliter af perlerne og vask dem med 500 mikroliter af 1X binde og vask buffer. Tilsæt 32 mikroliter af 2X binde og vask buffer og genbruge perlerne.Til dette tilsættes 32 mikroliter af de ryddede PCR-1-produkter. Bland grundigt og inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter. Placer perle DNA-blandingen på et magnetisk stativ i to minutter.Pipette ud supernatant som biotin-tagged DNA, der indeholder indsættelse kant binder sig til streptavidin på perlerne. Vask perlerne med 500 mikroliter af 1X binde og vask buffer, og vask derefter perlerne med 200 mikroliter af lav TE. Resuspend DNA bundet perler i 17 mikroliter af lav TE. DNA'et fra in vivo- og in vitro-dyrkede mutantbiblioteker, der er udvundet og fragmenteret i en ultralydsenhed, viste, at størstedelen af fragmenterne spænder mellem 100 og 400 basispar. Placeringen af transposon-medierede indsættelser på tværs af de fire replicons af Burkholderia gladioli stamme Et genom kan observeres i pod.En oversigt over sekventering output og antallet af unikke indsættelser og gener ramt i de tre replika in vivo og in vitro biblioteker kan observeres i tabellen. Det vigtige at huske er at beregne befolkningen flaskehals størrelse under vært kolonisering for at få en passende repræsentation af biblioteket under infektion. Juster også for et kompatibelt antal bakteriegenerationer in vitro og i værten.Efter at have genereret transposon mutant bibliotek, kan det screenes på selektive medier til at inddrive mutanter baseret på fænotypiske forskelle. Specifikke gener, der er vigtige for en tilstand, kan således identificeres.

Research

JoVE Journal

Biology

Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Electroantennographic Biotest som et screeningsværktøj for værtsplante Flygtige

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Brug SecM Arrest Sequence som et redskab til at isolere ribo bundne polypeptider

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

BEST: Barcode Enabled Sequencing of Tetrads

BEDSTE: Stregkode Enabled Sekventering af Tetrads

Tetrad analysis is a valuable tool for yeast genetics, but the laborious manual nature of the process has hindered its application on large scales. ...

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

C-FOS Protein Immunohistologisk Detection: Et nyttigt værktøj som en markør for Central involverede veje i specifikke fysiologiske reaktioner<em&gt; In vivo</em&gt; og<em&gt; Ex vivo</em

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

En simpel Bioassay for Vurdering af Vascular endotelvækstfaktorer

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisteret mikrodissektion (LAM) som værktøj for transskriptionsprofilering af enkelte celle Typer

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...