Name: transposon-insertion sequencing as a tool to elucidate bacterial colonization factors in a burkholderia gladioli symbiont of lagria villosa beetles
Uploaded: 2021-08-12T15:00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles at JoVE.co

We zijn Junbeom Lee dankbaar voor het leveren van de E. coli WM3064 + pRL27-stam voor conjugatie en begeleiding in de procedure, Kathrin Hüffmeier voor het helpen bij het oplossen van problemen tijdens het genereren van mutantenbibliotheken en Prof. André Rodrigues voor het ondersteunen van insectenverzameling en vergunningsverwerving. Ook bedanken we Rebekka Janke en Dagmar Klebsch voor de ondersteuning bij het verzamelen en kweken van de insecten. We erkennen de Braziliaanse autoriteiten voor het verlenen van de volgende vergunningen voor toegang, verzameling en export van insectenspecimens: SISBIO-autorisatie nr. 45742-1, 45742-7 en 45742-10, CNPq-proces nr. 01300.004320/2014-21 en 01300.0013848/2017-33, IBAMA Nr. 14BR016151DF en 20BR035212/DF). Dit onderzoek werd ondersteund door financiering van de German Science Foundation (DFG) Research Grants FL1051/1-1 en KA2846/6-1.

<ol>
	<li>Cain, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+advances+in+transposon-insertion+sequencing.">A decade of advances in transposon-insertion sequencing.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (9), 526-540 (2020).</li><li>Chao, M. C., Abel, S., Davis, B. M., Waldor, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+design+and+analysis+of+transposon+insertion+sequencing+experiments.">The design and analysis of transposon insertion sequencing experiments.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (2), 119-128 (2016).</li><li>Barquist, L., Boinett, C. J., Cain, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+querying+bacterial+genomes+with+transposon-insertion+sequencing.">Approaches to querying bacterial genomes with transposon-insertion sequencing.</a> RNA Biology. 10 (7), 1161-1169 (2013).</li><li>Fl&#243;rez, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic-producing+symbionts+dynamically+transition+between+plant+pathogenicity+and+insect-defensive+mutualism.">Antibiotic-producing symbionts dynamically transition between plant pathogenicity and insect-defensive mutualism.</a> Nature Communications. 8 (1), 15172 (2017).</li><li>Fl&#243;rez, L. V., Kaltenpoth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbiont+dynamics+and+strain+diversity+in+the+defensive+mutualism+between+Lagria+beetles+and+Burkholderia.">Symbiont dynamics and strain diversity in the defensive mutualism between Lagria beetles and Burkholderia.</a> Environmental Microbiology. 19 (9), 3674-3688 (2017).</li><li>Fl&#243;rez, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antifungal+polyketide+associated+with+horizontally+acquired+genes+supports+symbiont-mediated+defense+in+Lagria+villosa+beetles.">An antifungal polyketide associated with horizontally acquired genes supports symbiont-mediated defense in Lagria villosa beetles.</a> Nature Communications. 9 (1), 2478 (2018).</li><li>. FastQC A quality control tool for high throughput sequence data Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2012)</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+A+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FeatureCounts:+An+efficient+general+purpose+program+for+assigning+sequence+reads+to+genomic+features.">FeatureCounts: An efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features.</a> Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Gayt&#225;n, M. O., Mart&#237;nez-Santos, V. I., Soto, E., Gonz&#225;lez-Pedrajo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+three+secretion+system+in+attaching+and+effacing+pathogens.">Type three secretion system in attaching and effacing pathogens.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 129 (2016).</li><li>Hachani, A., Wood, T. E., Filloux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+VI+secretion+and+anti-host+effectors.">Type VI secretion and anti-host effectors.</a> Current Opinion in Microbiology. 29, 81-93 (2016).</li><li>Deep, A., Chaudhary, U., Gupta, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing+and+bacterial+pathogenicity:+From+molecules+to+disease.">Quorum sensing and bacterial pathogenicity: From molecules to disease.</a> Journal of Laboratory Physicians. 3 (1), 4-11 (2011).</li><li>Silva, A. J., Benitez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+cholerae+biofilms+and+cholera+pathogenesis.">Vibrio cholerae biofilms and cholera pathogenesis.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (2), 0004330 (2016).</li><li>Navarro-Garcia, F., Ruiz-Perez, F., Cataldi, &. #. 1. 9. 3. ;., Larz&#225;bal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+VI+secretion+system+in+pathogenic+Escherichia+coli:+structure,+role+in+virulence,+and+acquisition.">Type VI secretion system in pathogenic Escherichia coli: structure, role in virulence, and acquisition.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1965 (2019).</li><li>Ribet, D., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+bacterial+pathogens+colonize+their+hosts+and+invade+deeper+tissues.">How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues.</a> Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).</li><li>Schwarz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burkholderia+Type+VI+secretion+systems+have+distinct+roles+in+eukaryotic+and+bacterial+cell+interactions.">Burkholderia Type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions.</a> PLoS Pathogens. 6 (8), 1001068 (2010).</li><li>Jones, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kill+and+cure:+genomic+phylogeny+and+bioactivity+of+Burkholderia+gladioli+bacteria+capable+of+pathogenic+and+beneficial+lifestyles.">Kill and cure: genomic phylogeny and bioactivity of Burkholderia gladioli bacteria capable of pathogenic and beneficial lifestyles.</a> Microbial Genomics. 7 (1), 000515 (2021).</li><li>Takeshita, K., Kikuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Riptortuspedestris+and+Burkholderia+symbiont:+an+ideal+model+system+for+insect-microbe+symbiotic+associations.">Riptortuspedestris and Burkholderia symbiont: an ideal model system for insect-microbe symbiotic associations.</a> Research in Microbiology. 168 (3), 175-187 (2017).</li><li>Powell, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+screen+identifies+host+colonization+determinants+in+a+bacterial+gut+symbiont.">Genome-wide screen identifies host colonization determinants in a bacterial gut symbiont.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (48), 13887-13892 (2016).</li><li>Brooks, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+discovery+of+colonization+determinants+in+the+squid+symbiont+Vibrio+fischeri.">Global discovery of colonization determinants in the squid symbiont Vibrio fischeri.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17284-17289 (2014).</li><li>Somprasong, N., McMillan, I., Karkhoff-Schweizer, R. R., Mongkolsuk, S., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+genetic+manipulation+of+Burkholderia+gladioli+pathovar+cocovenenans.">Methods for genetic manipulation of Burkholderia gladioli pathovar cocovenenans.</a> BMC Research Notes. 3 (308), (2010).</li><li>Garcia, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burkholderia+thailandensis:+Genetic+manipulation.">Burkholderia thailandensis: Genetic manipulation.</a> Current Protocols in Microbiology. 45, 1-15 (2017).</li><li>Headd, B., Bradford, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conjugation+window+in+an+Escherichia+coli+K-12+strain+with+an+IncFII+plasmid.">The conjugation window in an Escherichia coli K-12 strain with an IncFII plasmid.</a> Applied and Environmental Microbiology. 86 (17), 00948 (2020).</li><li>Van Opijnen, T., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+insertion+sequencing:+A+new+tool+for+systems-level+analysis+of+microorganisms.">Transposon insertion sequencing: A new tool for systems-level analysis of microorganisms.</a> Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 435-442 (2013).</li><li>Gallagher, L. A., Ramage, E., Patrapuvich, R., Weiss, E., Brittnacher, M., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-defined+transposon+mutant+library+of+Burkholderia+thailandensis.">Sequence-defined transposon mutant library of Burkholderia thailandensis.</a> mBio. 4 (6), 00604-00613 (2013).</li><li>Wong, Y. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candidate+essential+genes+in+Burkholderia+cenocepacia+J2315+identified+by+genome-wide+TraDIS.">Candidate essential genes in Burkholderia cenocepacia J2315 identified by genome-wide TraDIS.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1288 (2016).</li><li>Moule, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+saturation+mutagenesis+of+Burkholderia+pseudomallei+K96243+predicts+essential+genes+and+novel+targets+for+antimicrobial+development.">Genome-wide saturation mutagenesis of Burkholderia pseudomallei K96243 predicts essential genes and novel targets for antimicrobial development.</a> mBio. 5 (1), 00926 (2014).</li><li>Ding, Q., Tan, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Himar1+transposon+for+efficient+random+mutagenesis+in+Aggregatibacter+actinomycetemcomitans.">Himar1 transposon for efficient random mutagenesis in Aggregatibacter actinomycetemcomitans.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1842 (2017).</li><li>Green, B., Bouchier, C., Fairhead, C., Craig, N. L., Cormack, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+site+preference+of+Mu,+Tn5,+and+Tn7+transposons.">Insertion site preference of Mu, Tn5, and Tn7 transposons.</a> Mobile DNA. 3, 3 (2012).</li><li>Lodge, J. K., Weston-Hafer, K., Berg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+Tn5+target+specificity:+Preference+for+insertion+at+G/C+pairs.">Transposon Tn5 target specificity: Preference for insertion at G/C pairs.</a> Genetics. 120 (3), 645-650 (1988).</li><li>Ar&#225; Ujo, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequencing+and+transposon+mutagenesis+of+Burkholderia+seminalis+TC3.4.2R3+identify+genes+contributing+to+suppression+of+orchid+necrosis+caused+by+B.+gladioli.">Genome sequencing and transposon mutagenesis of Burkholderia seminalis TC3.4.2R3 identify genes contributing to suppression of orchid necrosis caused by B. gladioli.</a> Molecular Plant-microbe Interactions: MPMI. 29 (6), 435-446 (2016).</li><li>Dobritsa, A. P., Samadpour, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reclassification+of+Burkholderiainsecticola+as+Caballeroniainsecticola+comb.+nov.+and+reliability+of+conserved+signature+indels+as+molecular+synapomorphies.">Reclassification of Burkholderiainsecticola as Caballeroniainsecticola comb. nov. and reliability of conserved signature indels as molecular synapomorphies.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 69 (7), 2057-2063 (2019).</li><li>Ohbayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect's+intestinal+organ+for+symbiont+sorting.">Insect's intestinal organ for symbiont sorting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 5179-5188 (2015).</li><li>Ross, C., Scherlach, K., Kloss, F., Hertweck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+conjugated+polyyne+biosynthesis+in+phytopathogenic+bacteria.">The molecular basis of conjugated polyyne biosynthesis in phytopathogenic bacteria.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (30), 7794-7798 (2014).</li><li>Atkins, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutant+of+Burkholderia+pseudomallei,+auxotrophic+in+the+branched+chain+amino+acid+biosynthetic+pathway,+is+attenuated+and+protective+in+a+murine+model+of+melioidosis.">A mutant of Burkholderia pseudomallei, auxotrophic in the branched chain amino acid biosynthetic pathway, is attenuated and protective in a murine model of melioidosis.</a> Infection and Immunity. 70 (9), 5290-5294 (2002).</li></ol>

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflict hebben met betrekking tot de studie.

Een B. gladiolen transposon mutant bibliotheek werd gegenereerd om belangrijke gastheer kolonisatie factoren in de symbiotische interactie tussen L. villosa kevers en B. gladiolen bacteriën te identificeren. De belangrijkste stappen in het protocol waren conjugatie, gastheer-infectie, DNA-bibliotheekvoorbereiding en sequencing.
Omdat veel stammen van Burkholderia vatbaar zijn voor genetische modificatie door conjugatie24,25,werd het plasmide met de transposon- en antibioticuminbrengcassette met succes geconjugeerd in de doel B. gladiolen Lv-StA-stam van E. coli. Eerdere pogingen tot transformatie door elektroporatie leverden zeer lage tot bijna geen B. gladiolentransformaties op. Het is raadzaam om de transformatietechniek voor het doelorganisme te optimaliseren om efficiënt een groot aantal transformanten op te leveren.
Eén conjugatieronde en 40 conjugatievlekken verstoorden 3.736 genen in B. gladiolen Lv-StA. Achteraf gezien zouden meerdere conjugatierondes nodig zijn om de meeste van de 7.468 genen te verstoren en een verzadigde bibliotheek te verkrijgen. Met name de incubatietijd tijdens conjugatie mocht niet langer zijn dan 12-18 uur, wat het einde is van de exponentiële groeifase van B. gladiolen. Het toestaan van conjugatie voorbij de exponentiële groeifase van bacteriële cellen vermindert de kans op succes van het verkrijgen van transconjuganten26. Daarom moet de conjugatieperiode worden aangepast aan de groei van de bacteriesoort.
Om met succes een experiment uit te voeren met de infectie van mutantenbibliotheken in een gastheer, is het belangrijk om de knelpuntgrootte van de bacteriële populatie tijdens kolonisatie en de diversiteit van mutanten in de bibliotheek vóór infectie te beoordelen1,2,27. Ter voorbereiding op het experiment schatten we het minimale aantal kevers dat moet worden geïnfecteerd om een grote kans te hebben dat elke mutant in de bibliotheek wordt bemonsterd en mag koloniseren. De geschatte in vivo bacteriële generatietijd en het aantal generaties voor de duur van het experiment werden ook berekend. De in vitro kweek werd vervolgens tot een vergelijkbaar aantal generaties opgekweekt door de incubatietijd aan te passen. Voor een vergelijkbaar infectie-experiment in andere niet-modelgastheren is het vermogen om een laboratoriumcultuur en een constante bron van de gastheerorganismen te behouden wenselijk.
Na de groei van de mutantenbibliotheek in vivo en in vitro en monsterverzameling, werd een aangepast DNA-bibliotheekvoorbereidingsprotocol voor transposon insertie sequencing uitgevoerd. De wijziging in het protocol omvatte het ontwerpen van aangepaste PCR-primers en het toevoegen van PCR-stappen om te selecteren op DNA-fragmenten die de inbrengcassette bevatten. Omdat het protocol was aangepast, verhoogden extra PCR-cycli in het protocol het risico op oververmplificatie en het verkrijgen van gehybridiseerde adapter-adapterfragmenten in de eindbibliotheken. Daarom wordt een laatste opschoningsstap (zonder grootteselectie) na de twee PCR's aanbevolen, omdat dit helpt bij het verwijderen van deze fragmenten. De grootteverdeling van de DNA-bibliotheken was nog steeds breder dan verwacht. Het verhogen van de sequencingdiepte leverde echter voldoende gegevens op die werden gefilterd tijdens bioinformatica-analyse, waardoor bevredigende resultaten werden verkregen.
Omdat transposon-gemedieerde mutagenese duizenden willekeurige inserties genereert in een enkel experiment, is het mogelijk om een verzadigde bibliotheek van mutanten te genereren die alle behalve die mutanten bevat waar genen die essentieel zijn voor bacteriegroei zijn verstoord. We hebben hoogstwaarschijnlijk niet gewerkt met een verzadigde mutantenbibliotheek, gezien de schattingen van essentiële genen in andere studies over Burkholderia sp. 28,29. Een niet-verzadigde bibliotheek helpt niettemin bij het verkennen van verschillende kandidaat-genen voor verdere studies met behulp van gerichte mutagenese. Vóór de experimenten is het ook belangrijk om te onthouden dat sommige transposons specifieke insertiedoelplaatsen hebben die de overvloed aan mutanten bij bepaalde loci in het genoom verhogen30. Van marinertranspononen is bekend dat ze zich richten op AT-locaties voor insertie31,en Tn5-transposons hebben een GC-bias32,33. Het opnemen van stappen tijdens bioinformatica-analyse om hotspots voor transposon-inserties te herkennen, zal helpen bij het beoordelen van eventuele distributiebias.
Hoewel gevoelig voor tegenslagen, kan een goed ontworpen transposon insertion sequencing-experiment een krachtig hulpmiddel zijn om veel voorwaardelijk belangrijke genen in bacteriën binnen één experiment te identificeren. Bijvoorbeeld, een dozijn genen in Burkholderia seminalis belangrijk voor de onderdrukking van orchideeblad necrose werden geïdentificeerd door transposon mutagenese en genomics te combineren34. Naast Burkholderiazijn verschillende adhesie- en motiliteitsgenen en transporters geïdentificeerd als belangrijke kolonisatiefactoren in Snodgrassella alvi-symbionten van Apis mellifera (Honeybee)22en in de Vibrio fischerii-symbionten van Euprymna-scolopes (Hawaiiaanse bobtailinktvis)23 met behulp van de transposon-insertie mutagenese-benadering.
Als alternatieve benadering kan transposonmutagenese worden gevolgd door screening op individuele mutanten met behulp van selectieve media in plaats van sequencing. Fenotypische screening of bioassays om tekortkomingen te identificeren, zoals beweeglijkheid, productie van bioactieve secundaire metabolieten of specifieke auxotrofieën, zijn haalbaar. Bijvoorbeeld, screening van een Burkholderia insecticola (opnieuw toegewezen aan het geslacht Caballeronia35)transposon mutant bibliotheek is de sleutel geweest bij het identificeren dat de symbionten motiliteitsgenen gebruiken voor het koloniseren van Riptortus pedestris, hun insectengastheer36. Bovendien werd met behulp van transposonmutagenese en fenotypische screening het biosynthetische genencluster voor de bioactieve secundaire metaboliet caryoynencine geïdentificeerd in Burkholderia caryophylli37. Een auxotrofische mutant van Burkholderia pseudomallei werd geïdentificeerd na transposon mutagenese en screening en is een mogelijk verzwakt vaccinkandidaat tegen melioidosis, een gevaarlijke ziekte bij mens en dier38. Transposon mutagenese en sequencing is dus een waardevolle benadering bij het bestuderen van de moleculaire eigenschappen van bacteriën die belangrijk zijn voor de interacties met hun respectieve gastheren in pathogene of mutualistische associaties.

Burkholderia gladiolen kunnen een symbiotische associatie aangaan met Lagria villosa-kevers en een belangrijke rol spelen bij de verdediging tegen microbiële antagonisten van de insectengastheer4,5,6. Vrouwelijke kevers huisvesten verschillende stammen van B. gladiolen in gespecialiseerde klieren die accessoire zijn voor het voortplantingssysteem. Bij het leggen van eieren smeren vrouwtjes B. gladiolencellen op het eioppervlak waar antimicrobiële verbindingen geproduceerd door B. gladiolen infecties door entomopathogene schimmels remmen4,6. Tijdens de late embryonale ontwikkeling of vroeg nadat de larven uitkomen, koloniseren de bacteriën cuticulaire invaginaties op het dorsale oppervlak van de larven. Ondanks deze gespecialiseerde lokalisatie en verticale transmissieroute van de symbionten, kan L. villosa vermoedelijk ook B. gladiolen horizontaal uit de omgeving verkrijgen4. Verder zijn ten minste drie stammen van B. gladiolen gevonden in verband met L. villosa4,6. Onder deze, B. gladiolen Lv-StA is de enige die vatbaar is voor teelt in vitro.
B. gladiolen Lv-StA heeft een genoomgrootte van 8,56 Mb6 en bevat 7.468 genen. Welke van deze genen zijn belangrijk voor B. gladiolenbacteriën om de kevergastheer te koloniseren? Om deze vraag te beantwoorden, gebruikten we transposon-insertion sequencing (Tn-seq), een exploratieve methode om voorwaardelijk essentiële microbiële genen1,2,3te identificeren. Een mutantenbibliotheek van B. gladiolen Lv-StA werd gemaakt met behulp van een Tn5-transposon. Door conjugatie van Escherichia coli donorcellen naar B. gladiolen Lv-StA werd een pRL27 plasmide met het Tn5 transposon en een antibioticaresistentiecassette geflankeerd door omgekeerde herhalingen overgebracht(Figuur 1). Daarbij werd een set mutanten gegenereerd die individueel verstoringen van 3.736 symbiontengenen dragen(figuur 2).
De mutantenpool werd geïnfecteerd op kevereieren om de kolonisatiefactoren te identificeren en werd als controle ook in vitro gekweekt in King's B (KB) medium. Na voldoende tijd voor kolonisatie te hebben gegeven, werden uitgekomen larven verzameld en samengevoegd voor DNA-extractie. Fragmenten van DNA met de transposon insert en het flankerende genomische gebied van B. gladiolen Lv-StA werden geselecteerd met behulp van een gemodificeerd DNA-bibliotheekpreparaatprotocol voor sequencing. Lees kwaliteitsverwerking gevolgd door analyse met DESeq2 werd uitgevoerd om specifieke genen te identificeren die cruciaal zijn voor B. gladiolen Lv-StA om L. villosa-larven te koloniseren wanneer ze via het eioppervlak worden overgedragen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,6- Diaminopimelic Acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B22391</td>
			<td>For E.coli WM3064+ pRL27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar - Agar</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure beads XP (magentic beads + polyethylene glycol + salts)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td>Size selection in step 6.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach (NaOCl) 12%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie2 v.2.4.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinfromatic tool for read mapping. Reference 10 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer-S</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>PEQL01-1020</td>
			<td>For PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutadapt v.2.10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatic tool for removing specific adapter sequences from the reads. Reference 8 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DESeq2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RStudio package for assessing differential mutant abundance. Usually used for RNAseq analysis. Reference 12 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder 100 bp</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T834.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>R0182</td>
			<td>PCR for confirming success of conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Di-Sodium salt</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epicentre MasterPure Complete DNA and RNA Purification Kit</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>MC85200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2218.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastQC v.0.11.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatic tool for assessing the quality of sequencing data. Reference 7 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeatureCounts v.2.0.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatic tool to obtain read counts per genomic feature. Reference 11 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>7530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Serva</td>
			<td>26899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>4936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td>Roth</td>
			<td>PO27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index primers set 1)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7335S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7645S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone (soybean)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2365</td>
			<td>For Burkholderia gladioli Lv-StA KB-medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peqGOLD &#39;Hot&#39; Taq- DNA Polymerase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PEQL01-1020</td>
			<td>PCR for confirming success of conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates - 145 x 20 mm</td>
			<td>Roth</td>
			<td>XH90.1</td>
			<td>For selecting transconjugants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates - 90 x 16 mm</td>
			<td>Roth</td>
			<td>N221.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiaxcel (StarSEQ GmbH, Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Quality check after DNA library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin beads</td>
			<td>Roth</td>
			<td>HP57.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>01-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic v.0.36</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatic tool for trimming low quality reads and also adapter sequences. Reference 9 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris -HCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9090.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2366</td>
			<td>For Escherichia coli WM3064+pRL27 LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td>Bandelin</td>
			<td>GM 70 HD</td>
			<td>For shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER enzyme (uracil DNA glycosylase + DNA glycosylase- lyase Endonuclease VIII)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7645S</td>
			<td>Ligation step 6.5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2363</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transposon-insertion sequencing as a tool to elucidate bacterial colonization factors in a burkholderia gladioli symbiont of lagria villosa beetles

Het afleiden van de functie van genen door hun activiteit te manipuleren is een essentieel hulpmiddel voor het begrijpen van de genetische onderbouwing van de meeste biologische processen. Vooruitgang in de moleculaire microbiologie heeft geleid tot de opkomst van diverse mutagenesetechnieken voor de manipulatie van genen. Onder hen is transposon-insertion sequencing (Tn-seq) een waardevol hulpmiddel om tegelijkertijd de functionaliteit van veel kandidaatgenen op een ongerichte manier te beoordelen. De techniek is de sleutel geweest om moleculaire mechanismen te identificeren voor de kolonisatie van eukaryote gastheren in verschillende pathogene microben en een paar nuttige symbionten.
Hier is Tn-seq vastgesteld als een methode om kolonisatiefactoren te identificeren in een mutualistische Burkholderia gladiolensymbiont van de kever Lagria villosa. Door conjugatie wordt Tn5 transposon-gemedieerde insertie van een antibioticaresistentiecassette uitgevoerd op willekeurige genomische locaties in B. gladiolen. Om het effect van genverstoringen op het vermogen van de bacteriën om de kevergastheer te koloniseren te identificeren, wordt de gegenereerde B. gladiolen transposon-mutantbibliotheek ingeënt op de kevereieren, terwijl een controle in vitro wordt gekweekt in een vloeibaar kweekmedium. Na voldoende tijd voor kolonisatie wordt DNA geëxtraheerd uit de in vivo en in vitro gekweekte bibliotheken. Volgens een DNA-bibliotheekvoorbereidingsprotocol worden de DNA-monsters voorbereid voor transposon-insertiesequentie. DNA-fragmenten die de transposon-insert rand en flankerend bacterieel DNA bevatten, worden geselecteerd en de mutatieplaatsen worden bepaald door sequencing weg van de transposon-insert rand. Ten slotte kan door het analyseren en vergelijken van de frequenties van elke mutant tussen de in vivo en in vitro bibliotheken, het belang van specifieke symbiontgenen tijdens keverkolonisatie worden voorspeld.

Gastheer-geassocieerde bacteriën kunnen verschillende factoren gebruiken om een associatie tot stand te brengen, waaronder die welke adhesie, motiliteit, chemotaxis, stressreacties of specifieke transporters bemiddelen. Hoewel factoren die belangrijk zijn voor pathogene-gastheerinteracties zijn gemeld voor verschillende bacteriën13,14,15,16,17,18,waaronder leden van het geslacht Burkholderia19,20,hebben minder studies de moleculaire mechanismen onderzocht die door gunstige symbionten worden gebruikt voor kolonisatie21,22,23 . Met behulp van transposon insertion sequencing was het doel om moleculaire factoren te identificeren die B. gladiolen in staat stellen om L. villosa-kevers te koloniseren.
Transposon-gemedieerde mutagenese werd uitgevoerd met behulp van het pRL27-plasmide, dat een Tn5-transposon en een kanamycineresistentiecassette draagt, geflankeerd door omgekeerde herhalingsplaatsen. Het plasmide werd ingebracht in de doel B. gladiolen Lv-StA-cellen door conjugatie met de plasmidedonor E. coli WM3064-stam (zoals weergegeven in figuur 1). Na conjugatie werd het conjugatiemengsel met B. gladiolenontvanger en E. coli-donorcellen geplateerd op selectieve agarplaten die kanamycine bevatten. De afwezigheid van DAP op de platen elimineerde de donor E. coli-cellen en de aanwezigheid van kanamycine geselecteerd voor succesvolle B. gladiolen Lv-StA-transconjuganten. De gepoolde B. gladiolen Lv-StA mutantenbibliotheek verkregen uit het oogsten van de 100.000 transconjugante kolonies werd voorbereid voor sequencing met behulp van een aangepaste DNA-bibliotheekvoorbereidingskit en aangepaste primers. Figuur 2 toont de voorbereidingsstappen van de DNA-bibliotheek. Sequencing leverde 4 Mio gepaarde reads op; 3.736 genen van de 7.468 genen in B. gladiolen Lv-StA waren verstoord.
Om mutanten te identificeren die kolonisatie-defect waren in de gastheer, werd de B. gladiolen Lv-StA mutantenbibliotheek geïnfecteerd op de kevereieren en in vitro gekweekt in KB-medium als een controle. De in vivo kolonisatieknelpuntgrootte werd vóór het experiment berekend. Een bekend aantal B. gladiolen Lv-StA-cellen was geïnfecteerd op kevereieren en het aantal koloniserende cellen in vers uitgekomen eerste instarlarven werd verkregen door een suspensie van elke larve te platen en kolonievormende eenheden per individu te tellen. Deze berekeningen werden gedaan om ervoor te zorgen dat het aantal koloniserende cellen voldoende is om alle of een hoog percentage van de mutanten in de bibliotheek te beoordelen op hun vermogen om de gastheer te koloniseren. Bovendien werd de groeitijd tussen in vitro en in vivo omstandigheden genormaliseerd op basis van het aantal bacteriële generaties om deze monsters vergelijkbaar te maken.
Nadat de eieren waren uitgekomen, werden 1.296 larven verzameld in 13 poelen. De overeenkomstige in vitro mutantculturen werden gekweekt en opgeslagen als glycerolvoorraden. DNA van de in vivo en in vitro gekweekte mutantenbibliotheken werd geëxtraheerd en gefragmenteerd in een ultrasoonapparaat. Figuur 3 toont de grootteverdeling van het gescheurde DNA, waarbij het merendeel van de fragmenten zich, zoals verwacht, tussen de 100 en 400 bp uitstrekt. Deze stap werd gevolgd door het aangepaste DNA-bibliotheekvoorbereidingsprotocol voor sequencing. Bij elke stap van het protocol werd de concentratie van het resterende DNA gecontroleerd om ervoor te zorgen dat de stappen correct werden uitgevoerd en om dna-verliezen te volgen. Een kwaliteitscontrole (zie de Tabel van Materialen) vóór sequencing onthulde dat de DNA-bibliotheken onverwacht grote (>800 bp) DNA-fragmenten bevatten, en dit was meer uitgesproken in de in vivo bibliotheken. Gezien de moeilijkheid om de clustering van fragmenten in de sequencing lanes te optimaliseren, was het noodzakelijk om de sequencingdiepte te verhogen tot 10 Mio gepaarde reads in de in vivo bibliotheken om het gewenste aantal reads te bereiken. Uit de analyse van de sequencingresultaten bleek dat gemiddeld 4 Mio reads in de in vivo libraries en 3,1 Mio reads in de in vitro libraries de Transposon edge aan het 5' einde van Read-1 (Tabel 9) bevatten, wat bevredigend was voor dit experiment. De verdeling van de 24.224 unieke inserties over het B. gladiolen genoom in de oorspronkelijke bibliotheek is weergegeven in figuur 4. Een analyse uitgevoerd met DESeq2 toonde aan dat de abundanties van 271 mutanten significant verschilden tussen de in vivo en in vitro omstandigheden.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62843/62843fig03.jpg"> Figuur 3: Agarose gels van een mutant en DNA bibliotheken. (A) Agarose gel met ongehoord DNA van een mutant in lane x en een 1 kbp ladder voor schaal. (B) Gel met gescheurde DNA-bibliotheek. De bandmaten van de ladder in de eerste rijstrook zijn aan de linkerkant aangegeven. De eerste drie rijstroken a, b en c bevatten gescheurde DNA-fragmenten van de in vivo bibliotheken. Lanes d, e, f en g bevatten gescheurde DNA-fragmenten van de in vitro bibliotheken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62843/62843fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62843/62843fig04.jpg"> Figuur 4: Locatie van unieke insertieplaatsen in de oorspronkelijke bibliotheek over de vier replicons in het Burkholderia gladioli Lv-StA genoom. Elke balk langs de x-as bevindt zich op een invoegplaats. De hoogte van een balk langs de y-as komt overeen met het aantal leesopnamen dat aan die site is gekoppeld. Merk op dat de twee chromosomen en twee plasmiden over de volledige lengte worden weergegeven en dus verschillende schalen op de x-as hebben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62843/62843fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">King's B medium/ agar</td>
		</tr>
<tr>
<td>Peptone (sojabonen)</td>
			<td>20 gr/l</td>
		</tr>
<tr>
<td>K2HPO4
</td>
			<td>1,5 g/l</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td>1,5 g/l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Agar-agar</td>
			<td>15 g/l</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Opgelost in gedestilleerd water</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">LB medium/agar</td>
		</tr>
<tr>
<td>Trypton</td>
			<td>10 gr/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gist extract</td>
			<td>5 g/l</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>10 gr/L</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Opgelost in gedestilleerd water</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Mediacomponenten.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nee.</td>
			<td>Inleidingen</td>
			<td colspan="2">Volgorde</td>
			<td>PCR gloeitemperatuur. (°C)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>tpnRL17-1RC</td>
			<td colspan="2">5'-CGTTACATCCCTGGCTTGTT-3'</td>
			<td rowspan="2">58.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>tpnRL13-2RC</td>
			<td colspan="2">5'-TCGTGAAGAAGGTGTTGCTG-3'</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Primers om het succes van conjugatie te bevestigen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Bestanddeel</td>
			<td>Volume (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HPLC-gezuiverd water</td>
			<td>4.92</td>
		</tr>
<tr>
<td>10x Buffer S (hoge specificiteit)</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2 (25 mM)</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTPs (2 mM)</td>
			<td>1.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer 1 (10 pmol/μL)</td>
			<td>0.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer 2 (10 pmol/μL)</td>
			<td>0.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Taq (5 U/µL)</td>
			<td>0.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mastermix totaal</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sjabloon</td>
			<td>1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 3: PCR-mastermix om het succes van de conjugatie te bevestigen. Afkortingen: HPLC = high-performance vloeistofchromatografie; dNTPs = deoxynucleosidetrifosfaat.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Stappen</td>
			<td>Temperatuur °C</td>
			<td>Tijd</td>
			<td>Cycli</td>
		</tr>
<tr>
<td>Initiële denaturatie</td>
			<td>95</td>
			<td>3 min.</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Denaturatie</td>
			<td>95</td>
			<td>40 s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Annealing</td>
			<td>58.2</td>
			<td>40 s</td>
			<td>30 tot 35</td>
		</tr>
<tr>
<td>Extensie</td>
			<td>72</td>
			<td>1-2 min</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Definitieve uitbreiding</td>
			<td>72</td>
			<td>4 min.</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Houden</td>
			<td>4</td>
			<td colspan="2">∞</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 4: PCR-voorwaarden om het succes van de conjugatie te bevestigen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Inleidingen</td>
			<td colspan="2">Volgorde</td>
			<td>Tm °C</td>
			<td>Gebruiken</td>
			<td>Bron</td>
		</tr>
<tr>
<td>Transposon-specifieke gebiotinyleerde primer</td>
			<td colspan="2">5'-Biotine-ACAGGAACACTTAACGGCTGACATG -3'</td>
			<td>63.5</td>
			<td>6.7.1. PCR I</td>
			<td>Gewoonte</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gemodificeerde Universele PCR primer</td>
			<td colspan="2">5'- AATGATACGGCGACCACCGAGATC TACACTCTTTCCCTACACGACGCTC TTCCGATCTGAATTCATCGATGAT GGTTGAGATGTGT - 3'</td>
			<td>62</td>
			<td>6.10.1. PCR II</td>
			<td>Gewoonte</td>
		</tr>
<tr>
<td>Indexprimer</td>
			<td colspan="3">Raadpleeg de handleiding van de fabrikant</td>
			<td>6.7.1. PCR I & 6.10.1. PCR II</td>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos voor Illumina (Index primers set 1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Adapter</td>
			<td colspan="3">Raadpleeg de handleiding van de fabrikant</td>
			<td>6.5. Adapterligatie</td>
			<td>NEBNext Ultra II DNA bibliotheek prep kit voor Illumina</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 5: Primers en adapter voor PCR I en II tijdens de voorbereiding van de DNA-bibliotheek. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>PCR-mix</td>
			<td>(μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Adapter-geligeerde DNA-fragmenten</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>NEBNext Ultra II Q5 master mix</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Indexprimer (10 pmol/ μL)</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Transposon specifieke gebiotinyleerde primer (10 pmol/ μL)</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totaal volume</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 6: DNA-bibliotheekvoorbereiding-PCR I mastermix.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Stappen</td>
			<td>Temperatuur</td>
			<td>Tijd</td>
			<td>Cycli</td>
		</tr>
<tr>
<td>Initiële denaturatie</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>30 s</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Denaturatie</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>10 s</td>
			<td rowspan="3">6 tot 12</td>
		</tr>
<tr>
<td>Annealing</td>
			<td>65 °C</td>
			<td>30 s</td>
		</tr>
<tr>
<td>Extensie</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>30 s</td>
		</tr>
<tr>
<td>Definitieve uitbreiding</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>2 min.</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Houden</td>
			<td>16 °C</td>
			<td colspan="2">∞</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 7: DNA-bibliotheekvoorbereiding -PCR I- en II-voorwaarden.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>PCR-mix</td>
			<td>(μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dna dat op kralen is geselecteerd</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>NEBNext Ultra II Q5 master mix</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Indexprimer</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gemodificeerde universele PCR primer</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totaal volume</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 8: DNA-bibliotheekvoorbereiding -PCR II-mastermix.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Bibliotheken</td>
			<td>Invivo-1</td>
			<td>Invivo-2</td>
			<td>Invivo-3</td>
			<td>Invitro-1</td>
			<td>Invitro-2</td>
			<td>Invitro-3</td>
			<td>Originele bibliotheek</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Nee. aantal reads (PE)</td>
			<td>56,57,710</td>
			<td>39,19,051</td>
			<td>30,65,849</td>
			<td>35,73,494</td>
			<td>28,83,440</td>
			<td>36,61,956</td>
			<td>46,09,410</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Nee. aantal reads met Tn – rand op 5' einde van Read-1</td>
			<td>54,15,880</td>
			<td>37,31,169</td>
			<td>29,36,247</td>
			<td>33,00,499</td>
			<td>27,35,705</td>
			<td>33,50,402</td>
			<td>41,53,270</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Bowtie2 totale uitlijningssnelheid (%) (alleen Read-1)</td>
			<td>95.53%</td>
			<td>83.71%</td>
			<td>89.87%</td>
			<td>80.79%</td>
			<td>78.00%</td>
			<td>73.06%</td>
			<td>74.92%</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Aantal unieke inserties</td>
			<td>8,539</td>
			<td>4,134</td>
			<td>7,183</td>
			<td>18,930</td>
			<td>18,421</td>
			<td>20,438</td>
			<td>24,224</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Aantal getroffen genen</td>
			<td>1575</td>
			<td>993</td>
			<td>1450</td>
			<td>2793</td>
			<td>2597</td>
			<td>3037</td>
			<td>3736</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 9: Samenvatting van de sequencing output en transposon insertie frequentie per bibliotheek. Afkorting: PE = paired-end.

Watch this Scientific Journal Video about Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles at JoVE.co

Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles

Dit is een aangepaste methode voor het identificeren van kandidaat-insectenkolonisatiefactoren in een Burkholderia gunstige symbiont. De kevergastheer is geïnfecteerd met een willekeurige mutantenbibliotheek gegenereerd via transposonmutagenese en de complexiteit van de bibliotheek na kolonisatie wordt vergeleken met een controle die in vitrois gekweekt.

Transposon-insertion Sequencing als een hulpmiddel om bacteriële kolonisatiefactoren in een Burkholderia gladiolen symbiont van Lagria villosa Kevers op te helderen

Inferring the function of genes by manipulating their activity is an essential tool for understanding the genetic underpinnings of most biological ...

Dit protocol is nuttig voor het uitvoeren van genetische manipulatie op symbiotische bacteriën, in dit geval specifiek op Burkholderia, en het identificeren van de genen die essentieel zijn voor het koloniseren van een insectengastheer. Transposon insertion sequencing is een krachtig hulpmiddel voor het identificeren van een groot aantal voorwaardelijk essentiële genen tegelijkertijd in een enkel experiment. Begin met het inenten van een verse donorcultuur van E.coli-donor in 10 milliliter LB-medium aangevuld met kanamycine en DAP onder een steriele kap.Ent Burkholderia gladiolen stam A ontvangende cellen in vijf milliliter KB medium. Incubeer de culturen bij 30 graden Celsius 's nachts op een shaker bij 250 RPM. Na nachtelijke groei centrifugeer je vier milliliter van elk van de culturen op 9.600 keer G gedurende zes minuten om de cellen te pelleteren en het supernatant weg te gooien.Was de gepelletiseerde celculturen onder een steriele kap in KB-medium dat DAP bevat. En ten slotte, resuspend de culturen afzonderlijk in vier milliliter KB plus DAP-medium. Meng in een verse buis van 15 milliliter 250 microliter van de gewassen E.coli-donorcellen met één milliliter van de gewassen Burkholderia gladiolen stam A-ontvangercellen.Spot 10 microliter van dit conjugatiecelmengsel op KB-agarplaten die DAP bevatten. Laat de plaat een uur ongestoord in de steriele kap bij kamertemperatuur rusten. Incubeer de platen met de vervoegingsvlekken bij 30 graden Celsius gedurende 12 tot 18 uur.Voeg na incubatie twee tot vier milliliter 1X PBS toe aan de platen onder een steriele kap en gebruik een celschraper om de gekweekte bacteriële conjugatieplekken van de agar vrij te maken. Pipetteer vervolgens het geconjugeerde celmengsel in twee milliliter microfugebuisjes. Pellet de cellen door twee minuten te centrifugeren op 9.600 maal G.Gooi het supernatant weg en was de pellet twee keer in één milliliter 1X PBS door op en neer te pipetteren. Resuspend de uiteindelijke pellet in 1.200 microliter 1X PBS. Meng goed en verdeel 100 microliter van het celmengsel op grote KB-agarplaten aangevuld met kanamycine en incubeer 's nachts bij 30 graden Celsius.Tel het totale aantal transconjugante kolonies op de drie platen en extrapoleer om het geschatte aantal mutanten te berekenen dat in alle platen is verkregen. Om de kans op het verkrijgen van een representatieve bibliotheek te vergroten, moet u ervoor zorgen dat het totale aantal kolonies meerdere malen hoger is dan het totale aantal genen in het genoom. Om het succes van de conjugatie te bevestigen, voert u een PCR uit gericht op de inbrengcassette met behulp van 10 tot 20 monsterkolonies zoals beschreven in het manuscript.Schraap onder een steriele kap de kolonies van de platen door één tot twee milliliter 1X PBS op de agar toe te voegen. Pool het celmengsel dat van de platen is afgeschraapt in buizen van 50 milliliter. Vortex de bibliotheek om grondig te mengen en splits vervolgens een milliliter van de gepoolde mutantenbibliotheek in verschillende cryobuizen.Voeg een milliliter 70% glycerol toe aan de buisjes en bewaar bij min 80 graden Celsius. Selecteer een L.villosa-eierkoppeling en tel het aantal eieren dat doorgaat als de koppeling meer dan 100 eieren bevat. Om de hele eikoppeling te steriliseren, voegt u 200 microliter 70% ethanol toe en wast u de eieren voorzichtig gedurende vijf minuten, verwijdert u vervolgens de ethanol en wast u de eieren tweemaal met geautoclaveerd water.Voeg 200 microliter 12% bleekmiddel toe en was de eieren voorzichtig gedurende 30 seconden. Verwijder het bleekmiddel onmiddellijk en was de eieren drie keer opnieuw met 200 microliter geautoclaveerd water. Infecteer de eieren in het gesteriliseerde eikoppeling met behulp van twee keer 10 tot de zes cellen per microliter van de gewassen mutantenbibliotheek in PBS.Twee dagen nadat de geïnfecteerde keverlarven uitkomen, verzamel je 100 seconden instarlarven per microfugebuis van 1,5 milliliter en bewaar je ze bij min 80 graden Celsius. Om de in vitro controlebibliotheek te genereren, ent u 250 microliter van twee keer 10 tot de zes cellen per microliter van de mutantenbibliotheek in 10 milliliter KB-medium dat Kanamycine bevat. Na het extraheren van DNA uit de in vivo en in vitro gekweekte mutantenbibliotheken, deelt u het DNA met een ultrasoonapparaat.Om te controleren of het DNA tot het gewenste groottebereik was gescheurd, laadt u vijf microliters van het ongehoorde en gescheurde DNA na vermenging met gel loading dye in een één-op-één verhouding op een 1,6% agarose gel run op 250 volt gedurende 40 minuten. Om de fragmentuiteinden voor te bereiden die nodig zijn voor adapterligatie, begint u met het toevoegen van drie microliter van het enzymmengsel en zeven microliter reactiebuffer aan 50 microliter van het gescheurde DNA en mengt u goed door pipetteren. Zet een thermocycler met een verwarmd deksel op groter dan of gelijk aan 75 graden Celsius en incubeer de monsters gedurende 30 minuten bij 20 graden Celsius en 30 minuten bij 65 graden Celsius en houd de temperatuur vervolgens op vier graden Celsius.Voeg voor adapterligatie 30 microliter ligatiemastermix, één microliter ligatieversterker en 2,5 microliter verdunde adapter toe aan de producten van de eindvoorbereidingsstap. Meng grondig door te pipetteren en incubeer het monster gedurende 15 minuten bij 20 graden Celsius in de thermocycler met het verwarmde deksel eraf. Voeg na 15 minuten drie microliter van het enzym toe.Meng goed door te pipetteren en incubeer het monster gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius in een thermocycler met het deksel verwarmd op meer dan of gelijk aan 47 graden Celsius. Om de grootte van adapter geligeerd DNA te selecteren gericht op fragmenten van 250 basenparen, begint u met het vortexen van de magnetische kraaloplossing en plaatst u deze gedurende 30 minuten voor gebruik op kamertemperatuur. Voeg 0,3 keer kralen toe aan 96,5 microliter van het geligeerde DNA-mengsel en meng door grondig te pipetteren.Incubeer het kralenmengsel gedurende vijf minuten. Plaats de buizen op een magnetische standaard om de kralen naar beneden te trekken en DNA-fragmenten van ongewenste grootte te verwijderen. Laat de kralen vijf minuten bezinken en breng dan het heldere supernatant over in een nieuwe microfugebuis.Voeg 0,15 keer verse kralen toe aan het supernatant en meng door goed te pipetteren. Incubeer het kralenmengsel gedurende vijf minuten en plaats de buizen vervolgens op een magnetische standaard om de kralen die aan het doel-DNA zijn gebonden naar beneden te trekken. Wacht vijf minuten en gooi dan het supernatant weg, houd de kralen.Voeg met de kralen op de magnetische standaard 200 microliter vers bereide 80% ethanol toe en wacht 30 seconden voordat u de ethanol weggooit zonder de kralen te verstoren. Verwijder de buizen uit de standaard en voeg 17 microliter van 0,1X TE of Low TE toe, meng vervolgens door 10 keer te pipetteren en incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende twee minuten. Plaats de buis op de magnetische standaard en neem 15 microliter van het door de grootte geselecteerde DNA voor PCR-1.Vortex streptavidin kralen en plaats ze op kamertemperatuur gedurende ten minste 30 minuten. Neem 32 microliter van de kralen en was ze met 500 microliter 1X bind- en wasbuffer. Voeg 32 microliter 2X bind- en wasbuffer toe en reuspend de kralen.Voeg hieraan 32 microliter van de opgeschoonde PCR-1-producten toe. Meng grondig en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Plaats het kralen-DNA-mengsel gedurende twee minuten op een magnetische standaard.Pipetteer het supernatant als biotine-gelabeld DNA met de inbrengrand bindt aan streptavidin op de kralen. Was de kralen met 500 microliter 1X bind- en wasbuffer en was vervolgens de kralen met 200 microliter Low TE. Resuspend de DNA-gebonden kralen in 17 microliter Low TE. Het DNA van de in vivo en in vitro gekweekte mutantenbibliotheken geëxtraheerd en gefragmenteerd in een ultrasoonapparaat toonde de meerderheid van de fragmenten tussen 100 en 400 basenparen. De locatie van getransponeerde inserties over de vier replicons van Burkholderia gladiolen stam A genoom kan worden waargenomen in de peul.Een samenvatting van de sequencing output en het aantal unieke inserties en genen geraakt in de drie replicaat in vivo en in vitro bibliotheken kan worden waargenomen in de tabel. Het belangrijkste om te onthouden is om de knelpuntgrootte van de populatie te berekenen tijdens de kolonisatie van de gastheer om een geschikte weergave van de bibliotheek te krijgen tijdens infectie. Corrigeer ook voor een compatibel aantal bacteriële generaties in vitro en in de gastheer.Na het genereren van de transposon mutant bibliotheek, kan deze worden gescreend op selectieve media om mutanten te herstellen op basis van fenotypische verschillen. Zo kunnen specifieke genen worden geïdentificeerd die belangrijk zijn voor een aandoening.

Research

JoVE Journal

Biology

Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

Gebruik van Rotorod als een methode voor de kwalitatieve analyse van Wandelen in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Een microfluïdische apparaat voor het kwantificeren van Bacteriële Chemotaxis in stabiele concentratiegradiënten

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

Correlatieve licht-en elektronenmicroscopie (CLEM) als een hulpmiddel om gemicroinjecteerd Moleculen en hun Eukaryotische Subcellulaire Doelen Visualiseer


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Electroantennographic Bioassay als een screeningsinstrument voor Host Plant Vluchtige stoffen

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Met behulp van SecM Arrestatie sequentie als een Tool om Ribosoom Bound Polypeptiden Isoleer

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Gebruik<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Als een modelsysteem voor de Protein Homeostase studeren in een meercellige

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

BEST: Barcode Enabled Sequencing of Tetrads

BEST: Barcode Enabled Sequencing van Tetrads

Tetrad analysis is a valuable tool for yeast genetics, but the laborious manual nature of the process has hindered its application on large scales. ...

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

De c-FOS Protein Immunohistologische Detection: Een handig hulpmiddel als een marker van Central Pathways betrokken bij specifieke fysiologische reacties<em&gt; In Vivo</em&gt; en<em&gt; Ex Vivo</em

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

Een eenvoudige bioassays voor de beoordeling van de vasculaire endotheliale groeifactoren

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection (LAM) als een tool voor Transcriptionele Profiling van individuele cel Types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...