Name: transposon-insertion sequencing as a tool to elucidate bacterial colonization factors in a burkholderia gladioli symbiont of lagria villosa beetles
Uploaded: 2021-08-12T15:00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles at JoVE.co

Siamo grati a Junbeom Lee per aver fornito il ceppo E. coli WM3064 + pRL27 per la coniugazione e la guida nella procedura, Kathrin Hüffmeier per aver aiutato con la risoluzione dei problemi durante la generazione della libreria mutante e il Prof. André Rodrigues per supportare la raccolta degli insetti e l'acquisizione dei permessi. Ringraziamo anche Rebekka Janke e Dagmar Klebsch per il supporto nella raccolta e nell'allevamento degli insetti. Riconosciamo le autorità brasiliane per aver concesso i seguenti permessi per l'accesso, la raccolta e l'esportazione di esemplari di insetti: autorizzazione SISBIO Nr. 45742-1, 45742-7 e 45742-10, processo CNPq nº 01300.004320/2014-21 e 01300.0013848/2017-33, IBAMA Nr. 14BR016151DF e 20BR035212/DF). Questa ricerca è stata sostenuta da finanziamenti della German Science Foundation (DFG) Research Grants FL1051/1-1 e KA2846/6-1.

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Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi relativo allo studio.

È stata generata una libreria mutante di trasposone di B. gladioli per identificare importanti fattori di colonizzazione dell'ospite nell'interazione simbiotica tra coleotteri L. villosa e batteri B. gladioli. I passaggi principali del protocollo sono stati la coniugazione, l'infezione dell'ospite, la preparazione della libreria del DNA e il sequenziamento.
Poiché molti ceppi di Burkholderia sono suscettibili di modificazione genetica mediante coniugazione24,25,il plasmide che trasporta il trasposone e la cassetta di inserimento antibiotico è stato coniugato con successo nel ceppo target B. gladioli Lv-StA di E. coli. I precedenti tentativi di trasformazione mediante elettroporazione hanno prodotto molto bassi o quasi nessun trasformanti di B. gladioli. Si consiglia di ottimizzare la tecnica di trasformazione per l'organismo bersaglio per produrre in modo efficiente un gran numero di trasformanti.
Un ciclo di coniugazione e 40 punti di coniugazione hanno interrotto 3.736 geni in B. gladioli Lv-StA. Col senno di poi, sarebbero necessari più cicli di coniugazione per interrompere la maggior parte dei 7.468 geni e ottenere una libreria satura. In particolare, il tempo di incubazione durante la coniugazione non è stato permesso di superare le 12-18 ore, che è la fine della fase di crescita esponenziale di B. gladioli. Consentire la coniugazione oltre la fase di crescita esponenziale delle cellule batteriche riduce le possibilità di successo di ottenere transconigiunti26. Pertanto, il periodo di coniugazione deve essere regolato in base alla crescita delle specie batteriche.
Per eseguire con successo un esperimento che coinvolge l'infezione di librerie mutanti in un ospite, è importante valutare la dimensione del collo di bottiglia della popolazione batterica durante la colonizzazione e la diversità dei mutanti nella libreria prima dell'infezione1,2,27. In preparazione per l'esperimento, abbiamo stimato il numero minimo di coleotteri che devono essere infettati per avere un'alta probabilità che ogni mutante nella biblioteca venga campionato e lasciato colonizzare. Sono stati calcolati anche il tempo approssimativo di generazione batterica in vivo e il numero di generazioni per la durata dell'esperimento. La coltura in vitro è stata poi cresciuta fino a un numero comparabile di generazioni regolando il tempo di incubazione. Per un esperimento di infezione simile in altri ospiti non modello, è auspicabile la capacità di mantenere una coltura di laboratorio e una fonte costante degli organismi ospiti.
A seguito della crescita della libreria mutante in vivo e in vitro e della raccolta di campioni, è stato effettuato un protocollo di preparazione della libreria di DNA modificato per il sequenziamento dell'inserzione di trasposoni. La modifica del protocollo ha comportato la progettazione di primer PCR personalizzati e l'aggiunta di passaggi PCR per selezionare i frammenti di DNA contenenti la cassetta di inserimento. Poiché il protocollo è stato personalizzato, cicli PCR aggiuntivi nel protocollo hanno aumentato il rischio di sovraesplosione e di ottenere frammenti ibridi adattatore-adattatore nelle librerie finali. Quindi, si consiglia una fase di pulizia finale (senza selezione delle dimensioni) dopo le due PCR, in quanto aiuta a rimuovere questi frammenti. La distribuzione dimensionale delle librerie di DNA era ancora più ampia del previsto. Tuttavia, l'aumento della profondità di sequenziamento ha fornito dati sufficienti che sono stati filtrati durante l'analisi bioinformatica, ottenendo risultati soddisfacenti.
Poiché la mutagenesi mediata dal trasposone genera migliaia di inserzioni casuali in un singolo esperimento, è possibile generare una libreria satura di mutanti che contiene tutti tranne quei mutanti in cui i geni essenziali per la crescita batterica sono stati interrotti. Molto probabilmente non abbiamo lavorato con una libreria mutante satura, date le stime dei geni essenziali in altri studi su Burkholderia sp. 28,29. Una libreria non satura aiuta tuttavia ad esplorare vari geni candidati per ulteriori studi utilizzando la mutagenesi mirata. Prima degli esperimenti, è anche importante ricordare che alcuni trasposoni hanno specifici siti bersaglio di inserzione che aumentano l'abbondanza di mutanti in determinati loci nel genoma30. I trasposoni Mariner sono noti per colpire i siti AT per l'inserzione31e i trasposoni Tn5 hanno un bias GC32,33. Includere passaggi durante l'analisi bioinformatica per riconoscere gli hotspot per gli inserimenti di trasposoni aiuterà a valutare qualsiasi bias di distribuzione.
Sebbene soggetto a battute d'arresto, un esperimento di sequenziamento dell'inserzione di trasposone ben progettato può essere un potente strumento per identificare molti geni condizionatamente importanti nei batteri all'interno di un singolo esperimento. Ad esempio, una dozzina di geni in Burkholderia seminalis importanti per la soppressione della necrosi delle foglie di orchidea sono stati identificati combinando mutagenesi trasposone e genomica34. Oltre alla Burkholderia,diversi geni e trasportatori di adesione e motilità sono stati identificati come importanti fattori di colonizzazione nei simbionti di Snodgrassella alvi di Apis mellifera (Ape mellifera)22e nei simbionti Vibrio fischerii di Euprymna scolopes (calamari bobtail hawaiani)23 utilizzando l'approccio di mutagenesi trasposone-inserzione.
Come approccio alternativo, la mutagenesi del trasposone può essere seguita dallo screening per i singoli mutanti utilizzando mezzi selettivi invece del sequenziamento. Sono possibili screening fenotipici o biosaggi per identificare carenze, come la motilità, la produzione di metaboliti secondari bioattivi o auxotrofie specifiche. Ad esempio, lo screening di una libreria mutante di trasposone burkholderia insecticola (riassegnata al genere Caballeronia35)è stata fondamentale per identificare che i simbionti impiegano geni di motilità per colonizzare Riptortus pedestris, il loro ospite insetto36. Inoltre, utilizzando la mutagenesi trasposonica e lo screening fenotipico, il cluster di geni biosintetici per il metabolita secondario bioattivo carioinencina è stato identificato in Burkholderia caryophylli37. Un mutante auxotrofico di Burkholderia pseudomallei è stato identificato dopo mutagenesi e screening del trasposone ed è un possibile candidato vaccino attenuato contro la melioidosi, una malattia pericolosa nell'uomo e negli animali38. Pertanto, la mutagenesi e il sequenziamento del trasposone sono un approccio prezioso nello studio dei tratti molecolari dei batteri che sono importanti per le interazioni con i rispettivi ospiti in associazioni patogene o mutualistiche.

Burkholderia gladioli può impegnarsi in un'associazione simbiotica con i coleotteri Lagria villosa, svolgendo un ruolo importante nella difesa contro gli antagonisti microbici dell'insetto ospite4,5,6. I coleotteri femminili ospitano diversi ceppi di B. gladioli in ghiandole specializzate accessorie al sistema riproduttivo. Al momento della deposizione delle uova, le femmine spalmano le cellule di B. gladioli sulla superficie dell'uovo dove i composti antimicrobici prodotti da B. gladioli inibiscono le infezioni da funghi entomopatogeni4,6. Durante lo sviluppo embrionale tardivo o all'inizio dopo la schiusa delle larve, i batteri colonizzano le invaginazioni cuticolari sulla superficie dorsale delle larve. Nonostante questa localizzazione specializzata e la via di trasmissione verticale dei simbionti, L. villosa può presumibilmente acquisire anche B. gladioli orizzontalmente dall'ambiente4. Inoltre, almeno tre ceppi di B. gladioli sono stati trovati in associazione con L. villosa4,6. Tra questi, B. gladioli Lv-StA è l'unico che è suscettibile di coltivazione in vitro.
B. gladioli Lv-StA ha una dimensione del genoma di 8,56 Mb6 e contiene 7.468 geni. Quale di questi geni è importante per i batteri B. gladioli per colonizzare l'ospite coleottero? Per rispondere a questa domanda, abbiamo usato il sequenziamento transposon-insertion (Tn-seq), un metodo esplorativo per identificare i geni microbici condizionatamente essenziali1,2,3. Una libreria mutante di B. gladioli Lv-StA è stata creata utilizzando un trasposone Tn5. Attraverso la coniugazione da cellule donatrici di Escherichia coli a B. gladioli Lv-StA, è stato trasferito un plasmide pRL27 che trasporta il trasposone Tn5 e una cassetta di resistenza agli antibiotici affiancata da ripetizioni invertite (Figura 1). In tal modo, è stato generato un insieme di mutanti che trasportano individualmente interruzioni di 3.736 geni simbionti (Figura 2).
Il pool mutante è stato infettato su uova di coleottero per identificare i fattori di colonizzazione e, come controllo, è stato anche coltivato in vitro nel mezzo B di King (KB). Dopo aver concesso un tempo sufficiente per la colonizzazione, le larve tratteggiate sono state raccolte e raggruppate per l'estrazione del DNA. Frammenti di DNA contenenti l'inserto di trasposone e la regione genomica fiancheggiante di B. gladioli Lv-StA sono stati selezionati utilizzando un protocollo di preparazione della libreria di DNA modificato per il sequenziamento. L'elaborazione della qualità della lettura seguita dall'analisi con DESeq2 è stata effettuata per identificare geni specifici cruciali per B. gladioli Lv-StA per colonizzare le larve di L. villosa quando trasmesse attraverso la superficie dell'uovo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,6- Diaminopimelic Acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B22391</td>
			<td>For E.coli WM3064+ pRL27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar - Agar</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure beads XP (magentic beads + polyethylene glycol + salts)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td>Size selection in step 6.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach (NaOCl) 12%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie2 v.2.4.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinfromatic tool for read mapping. Reference 10 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer-S</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>PEQL01-1020</td>
			<td>For PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutadapt v.2.10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatic tool for removing specific adapter sequences from the reads. Reference 8 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DESeq2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RStudio package for assessing differential mutant abundance. Usually used for RNAseq analysis. Reference 12 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder 100 bp</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T834.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>R0182</td>
			<td>PCR for confirming success of conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Di-Sodium salt</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epicentre MasterPure Complete DNA and RNA Purification Kit</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>MC85200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2218.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastQC v.0.11.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatic tool for assessing the quality of sequencing data. Reference 7 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeatureCounts v.2.0.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatic tool to obtain read counts per genomic feature. Reference 11 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>7530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Serva</td>
			<td>26899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>4936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td>Roth</td>
			<td>PO27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index primers set 1)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7335S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7645S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone (soybean)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2365</td>
			<td>For Burkholderia gladioli Lv-StA KB-medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peqGOLD &#39;Hot&#39; Taq- DNA Polymerase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PEQL01-1020</td>
			<td>PCR for confirming success of conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates - 145 x 20 mm</td>
			<td>Roth</td>
			<td>XH90.1</td>
			<td>For selecting transconjugants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates - 90 x 16 mm</td>
			<td>Roth</td>
			<td>N221.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiaxcel (StarSEQ GmbH, Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Quality check after DNA library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin beads</td>
			<td>Roth</td>
			<td>HP57.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>01-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic v.0.36</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatic tool for trimming low quality reads and also adapter sequences. Reference 9 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris -HCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9090.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2366</td>
			<td>For Escherichia coli WM3064+pRL27 LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td>Bandelin</td>
			<td>GM 70 HD</td>
			<td>For shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER enzyme (uracil DNA glycosylase + DNA glycosylase- lyase Endonuclease VIII)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7645S</td>
			<td>Ligation step 6.5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2363</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transposon-insertion sequencing as a tool to elucidate bacterial colonization factors in a burkholderia gladioli symbiont of lagria villosa beetles

Dedurre la funzione dei geni manipolando la loro attività è uno strumento essenziale per comprendere le basi genetiche della maggior parte dei processi biologici. I progressi della microbiologia molecolare hanno visto l'emergere di diverse tecniche di mutagenesi per la manipolazione dei geni. Tra questi, il sequenziamento trasposone-inserzione (Tn-seq) è uno strumento prezioso per valutare contemporaneamente la funzionalità di molti geni candidati in modo non target. La tecnica è stata fondamentale per identificare i meccanismi molecolari per la colonizzazione degli ospiti eucariotici in diversi microbi patogeni e alcuni simbionti benefici.
Qui, Tn-seq è stabilito come metodo per identificare i fattori di colonizzazione in un simbionte mutualistico Burkholderia gladioli del coleottero Lagria villosa. Per coniugazione, l'inserimento mediato da trasposoni Tn5 di una cassetta di resistenza agli antibiotici viene effettuato in posizioni genomiche casuali in B. gladioli. Per identificare l'effetto delle interruzioni geniche sulla capacità dei batteri di colonizzare l'ospite coleottero, la libreria di trasposoni-mutanti B. gladioli generata viene inoculata sulle uova del coleottero, mentre un controllo viene coltivato in vitro in un terreno di coltura liquido. Dopo aver concesso tempo sufficiente per la colonizzazione, il DNA viene estratto dalle biblioteche coltivate in vivo e in vitro. Seguendo un protocollo di preparazione della libreria del DNA, i campioni di DNA vengono preparati per il sequenziamento di trasposone-inserimento. Vengono selezionati frammenti di DNA che contengono il bordo dell'inserto del trasposone e il DNA batterico fiancheggiante e i siti di mutazione sono determinati sequenziando lontano dal bordo dell'inserto del trasposone. Infine, analizzando e confrontando le frequenze di ciascun mutante tra le librerie in vivo e in vitro, è possibile prevedere l'importanza di specifici geni simbionti durante la colonizzazione dei coleotteri.

I batteri associati all'ospite possono impiegare diversi fattori per stabilire un'associazione, compresi quelli che mediano l'adesione, la motilità, la chemiotassi, le risposte allo stress o i trasportatori specifici. Mentre fattori importanti per le interazioni patogeno-ospite sono stati riportati per diversi batteri13,14,15,16,17,18,compresi i membri del genere Burkholderia19,20,meno studi hanno esplorato i meccanismi molecolari utilizzati dai simbionti benefici per la colonizzazione21,22,23 . Utilizzando il sequenziamento dell'inserzione di trasposoni, l'obiettivo era identificare i fattori molecolari che consentono a B. gladioli di colonizzare i coleotteri L. villosa.
La mutagenesi mediata dal trasposone è stata eseguita utilizzando il plasmide pRL27, che trasporta un trasposone Tn5 e una cassetta di resistenza alla kanamicina affiancata da siti di ripetizione invertita. Il plasmide è stato introdotto nelle cellule target B. gladioli Lv-StA mediante coniugazione con il ceppo E. coli WM3064 del donatore di plasmidi (come mostrato in Figura 1). Dopo la coniugazione, la miscela di coniugazione contenente cellule riceventi di B. gladioli e donatori di E. coli è stata placcata su piastre di agar selettive contenenti kanamicina. L'assenza di DAP sulle piastre ha eliminato le cellule di E. coli del donatore e la presenza di kanamicina selezionata per i transconigiunti B. gladioli Lv-StA di successo. La libreria di mutanti B. gladioli Lv-StA ottenuta dalla raccolta delle 100.000 colonie transconigiuchide è stata preparata per il sequenziamento utilizzando un kit di preparazione della libreria di DNA modificato e primer personalizzati. La Figura 2 evidenzia le fasi di preparazione della libreria del DNA. Il sequenziamento ha prodotto 4 Mio di letture accoppiate; 3.736 geni su 7.468 geni in B. gladioli Lv-StA sono stati interrotti.
Per identificare i mutanti che erano difettosi nella colonizzazione nell'ospite, la libreria mutante B. gladioli Lv-StA è stata infettata sulle uova di coleottero e coltivata in vitro in mezzo KB come controllo. La dimensione del collo di bottiglia della colonizzazione in vivo è stata calcolata prima dell'esperimento. Un numero noto di cellule di B. gladioli Lv-StA è stato infettato su uova di coleottero e il numero di cellule colonizzatrici in larve di prima stella appena nate è stato ottenuto placcando una sospensione da ciascuna larva e contando le unità formanti colonie per individuo. Questi calcoli sono stati fatti per garantire che il numero di cellule colonizzanti sia sufficiente per valutare tutti o un'alta percentuale dei mutanti nella libreria per la loro capacità di colonizzare l'ospite. Inoltre, il tempo di crescita tra condizioni in vitro e in vivo è stato normalizzato in base al numero di generazioni batteriche per rendere comparabili questi campioni.
Dopo la schiusa delle uova, 1.296 larve sono state raccolte in 13 piscine. Le corrispondenti colture mutanti in vitro sono state coltivate e conservate come scorte di glicerolo. Il DNA delle librerie mutanti cresciute in vivo e in vitro è stato estratto e frammentato in un ultrasuoni. La Figura 3 mostra la distribuzione dimensionale del DNA tranciato, dove la maggior parte dei frammenti si estende tra 100 e 400 bp, come previsto. Questo passaggio è stato seguito dal protocollo di preparazione della libreria del DNA modificato per il sequenziamento. In ogni fase del protocollo, la concentrazione di DNA rimanente è stata controllata per garantire che i passaggi siano stati eseguiti correttamente e per tracciare le perdite di DNA. Un controllo di qualità (vedi la Tabella dei Materiali)prima del sequenziamento ha rivelato che le librerie di DNA contenevano frammenti di DNA inaspettatamente grandi (>800 bp), e questo era più pronunciato nelle librerie in vivo. Data la difficoltà di ottimizzare il clustering dei frammenti nelle corsie di sequenziamento, è stato necessario aumentare la profondità di sequenziamento a 10 Mio di letture accoppiate nelle librerie in vivo per raggiungere il numero desiderato di letture. L'analisi dei risultati del sequenziamento ha rivelato che una media di 4 Mio di letture nelle librerie in vivo e 3,1 Mio di lettura nelle librerie in vitro contenevano il bordo di Transposon nella fine di 5' di Read-1(Tabella 9),il che era soddisfacente per questo esperimento. La distribuzione delle 24.224 inserzioni uniche attraverso il genoma di B. gladioli nella libreria originale è mostrata nella Figura 4. Un'analisi condotta utilizzando DESeq2 ha rivelato che l'abbondanza di 271 mutanti era significativamente diversa tra le condizioni in vivo e in vitro. 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62843/62843fig03.jpg"> Figura 3: Gel di acarosio di un mutante e librerie di DNA. (A) Gel di agarose con DNA non segnato di un mutante in corsia x e una scala da 1 kbp per la scala. (B) Gel con libreria di DNA tranciato. Le dimensioni della banda della scala nella prima corsia sono indicate sul lato sinistro. Le prime tre corsie a, b e c contengono frammenti di DNA tranciati delle librerie in vivo. Le corsie d, e, f e g contengono frammenti di DNA tranciati delle librerie in vitro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62843/62843fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62843/62843fig04.jpg"> Figura 4: Posizione di siti di inserzione unici nella biblioteca originale attraverso i quattro replicons nel genoma Burkholderia gladioli Lv-StA. Ogni barra lungo l'asse x si trova in un sito di inserimento. L'altezza di una barra lungo l'asse y corrisponde al numero di letture associate a quel sito. Si noti che i due cromosomi e due plasmidi sono mostrati a tutta lunghezza e quindi hanno scale diverse sull'asse x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62843/62843fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">King's B medio/ agar</td>
		</tr>
<tr>
<td>Peptone (soia)</td>
			<td>20 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>K2HPO4
</td>
			<td>1,5 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td>1,5 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Agar</td>
			<td>15 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Disciolto in acqua distillata</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">LB medio/agar</td>
		</tr>
<tr>
<td>Triptone</td>
			<td>10 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Estratto di lievito</td>
			<td>5 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>10 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Disciolto in acqua distillata</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Componenti multimediali.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>No.</td>
			<td>Primer</td>
			<td colspan="2">Sequenza</td>
			<td>Temperatura di ricottura PCR (°C)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>tpnRL17-1RC</td>
			<td colspan="2">5'-CGTTACATCCCTGGCTTGTT-3'</td>
			<td rowspan="2">58.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>tpnRL13-2RC</td>
			<td colspan="2">5'-TCGTGAAGAAGGTGTTGCTG-3'</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Primer per confermare il successo della coniugazione.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Componente</td>
			<td>Volume (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acqua purificata hpLC</td>
			<td>4.92</td>
		</tr>
<tr>
<td>10x Buffer S (alta specificità)</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2 (25 mM)</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTPs (2 mM)</td>
			<td>1.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer 1 (10 pmol/μL)</td>
			<td>0.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer 2 (10 pmol/μL)</td>
			<td>0.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Taq (5 U/μL)</td>
			<td>0.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mastermix totale</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sagoma</td>
			<td>1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 3: Master mix PCR per confermare il successo della coniugazione. Abbreviazioni: HPLC = cromatografia liquida ad alte prestazioni; dNTPs = deossinucleoside trifosfato.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Passi</td>
			<td>Temperatura °C</td>
			<td>Ore</td>
			<td>Cicli</td>
		</tr>
<tr>
<td>Denaturazione iniziale</td>
			<td>95</td>
			<td>3 minuti</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Denaturazione</td>
			<td>95</td>
			<td>40 anni</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Ricottura</td>
			<td>58.2</td>
			<td>40 anni</td>
			<td>da 30 a 35 anni</td>
		</tr>
<tr>
<td>Estensione</td>
			<td>72</td>
			<td>1-2 minuti</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Estensione finale</td>
			<td>72</td>
			<td>4 minuti</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tenere</td>
			<td>4</td>
			<td colspan="2">∞</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 4: Condizioni PCR per confermare il successo della coniugazione.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Primer</td>
			<td colspan="2">Sequenza</td>
			<td>Tm °C</td>
			<td>Usare</td>
			<td>Fonte</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer biotinilato specifico per il trasposone</td>
			<td colspan="2">5'-Biotina-ACAGGAACACTTAACGGCTGACATG -3'</td>
			<td>63.5</td>
			<td>6.7.1. PCR I</td>
			<td>Costume</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer PCR universale modificato</td>
			<td colspan="2">5'- AATGATACGGCGACCACCGAGATC TACACTCTTTCCCTACACGACGCTC TTCCGATCTGAATTCATCGATGATGAT GGTTGAGATGTGT – 3'</td>
			<td>62</td>
			<td>6.10.1. PCR II</td>
			<td>Costume</td>
		</tr>
<tr>
<td>Introduzione all'indice</td>
			<td colspan="3">Fare riferimento al manuale del produttore</td>
			<td>6.7.1. PCR I e 6.10.1. PCR II</td>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos per Illumina (Index primers set 1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Adattatore</td>
			<td colspan="3">Fare riferimento al manuale del produttore</td>
			<td>6.5. Legatura dell'adattatore</td>
			<td>Kit di preparazione della libreria DNA NEBNext Ultra II per Illumina</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 5: Primer e adattatore per PCR I e II durante la preparazione della libreria del DNA. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Mix PCR</td>
			<td>(μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Frammenti di DNA legati all'adattatore</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>NEBNext Ultra II Q5 master mix</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Indice primer (10 pmol/ μL)</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer biotinilato specifico per il trasposone (10 pmol/μL)</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volume totale</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 6: Preparazione della libreria del DNA -PCR I master mix.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Passi</td>
			<td>Temperatura</td>
			<td>Ore</td>
			<td>Cicli</td>
		</tr>
<tr>
<td>Denaturazione iniziale</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>30 anni</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Denaturazione</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>10 s</td>
			<td rowspan="3">6 a 12</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ricottura</td>
			<td>65 °C</td>
			<td>30 anni</td>
		</tr>
<tr>
<td>Estensione</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>30 anni</td>
		</tr>
<tr>
<td>Estensione finale</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>2 minuti</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tenere</td>
			<td>16 °C</td>
			<td colspan="2">∞</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 7: Preparazione della libreria del DNA -Condizioni PCR I e II.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Mix PCR</td>
			<td>(μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNA selezionato per perle</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>NEBNext Ultra II Q5 master mix</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Introduzione all'indice</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer PCR universale modificato</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volume totale</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 8: Preparazione della libreria del DNA -Mix masterPCR II.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Biblioteche</td>
			<td>Invivo-1 ·</td>
			<td>Invivo-2 ·</td>
			<td>Invivo-3 ·</td>
			<td>Invitro-1</td>
			<td>Invitro-2</td>
			<td>Invitro-3</td>
			<td>Biblioteca originale</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">No. di letture (PE)</td>
			<td>56,57,710</td>
			<td>39,19,051</td>
			<td>30,65,849</td>
			<td>35,73,494</td>
			<td>28,83,440</td>
			<td>36,61,956</td>
			<td>46,09,410</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">No. di letture contenenti Tn – bordo su 5' fine di Read-1</td>
			<td>54,15,880</td>
			<td>37,31,169</td>
			<td>29,36,247</td>
			<td>33,00,499</td>
			<td>27,35,705</td>
			<td>33,50,402</td>
			<td>41,53,270</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Bowtie2 tasso di allineamento complessivo (%) (solo Read-1)</td>
			<td>95.53%</td>
			<td>83.71%</td>
			<td>89.87%</td>
			<td>80.79%</td>
			<td>78.00%</td>
			<td>73.06%</td>
			<td>74.92%</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Numero di inserimenti univoci</td>
			<td>8,539</td>
			<td>4,134</td>
			<td>7,183</td>
			<td>18,930</td>
			<td>18,421</td>
			<td>20,438</td>
			<td>24,224</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Numero di geni colpiti</td>
			<td>1575</td>
			<td>993</td>
			<td>1450</td>
			<td>2793</td>
			<td>2597</td>
			<td>3037</td>
			<td>3736</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 9: Riepilogo dell'output di sequenziamento e della frequenza di inserimento del trasposone per libreria. Abbreviazione: PE = paired-end.

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Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles

Questo è un metodo adattato per identificare i potenziali fattori di colonizzazione degli insetti in un simbionte benefico Burkholderia. L'ospite coleottero è infettato da una libreria mutante casuale generata tramite mutagenesi trasposone e la complessità della libreria dopo la colonizzazione viene confrontata con un controllo coltivato in vitro.

Sequenziamento trasposone-inserzione come strumento per chiarire i fattori di colonizzazione batterica in un simbionte gladioli Burkholderia di Coleotteri Lagria villosa

Inferring the function of genes by manipulating their activity is an essential tool for understanding the genetic underpinnings of most biological ...

Questo protocollo è utile per eseguire manipolazioni genetiche su batteri simbiotici, in questo caso, in particolare su Burkholderia, e identificare i geni essenziali per colonizzare un ospite insetto. Il sequenziamento dell'inserzione di trasposone è un potente strumento per identificare un gran numero di geni condizionalmente essenziali contemporaneamente in un singolo esperimento. Inizia inoculando una coltura di donatore fresco di donatore di E.coli in 10 millilitri di mezzo LB integrato con Kanamicina e DAP sotto un cappuccio sterile.Cellule riceventi di Burkholderia gladioli inoculato ceppo A in cinque millilitri di terreno KB. Incubare le colture a 30 gradi Celsius durante la notte su uno shaker a 250 RPM. Dopo la crescita durante la notte, centrifugare quattro millilitri di ciascuna delle colture a 9.600 volte G per sei minuti per pellettare le cellule e scartare il surnatante.Sotto un cappuccio sterile, lavare le colture cellulari pellettate in un mezzo KB contenente DAP. E infine, risuscindi le colture separatamente in quattro millilitri di KB più il mezzo DAP. In un tubo fresco da 15 millilitri, mescolare 250 microlitri delle cellule donatrici di E.coli lavate con un millilitro delle cellule riceventi del ceppo A di Burkholderia gladioli lavate.Spot 10 microlitri di questa miscela di celle di coniugazione su piastre di agar KB contenenti DAP. Lasciare riposare indisturbato la piastra nel cappuccio sterile a temperatura ambiente per un'ora. Incubare le piastre con i punti di coniugazione a 30 gradi Celsius per 12-18 ore.Dopo l'incubazione, aggiungere da due a quattro millilitri di 1X PBS sulle piastre sotto un cappuccio sterile e utilizzare un raschietto cellulare per rilasciare i punti di coniugazione batterica cresciuti dall'agar. Quindi pipettare la miscela di cellule coniugate in due tubi di microfugazione millilitro. Pellet le celle centrifugando a 9.600 volte G per due minuti.Scartare il surnatante e lavare il pellet due volte in un millilitro di 1X PBS tubando su e giù. Ripresa del pellet finale in 1.200 microlitri di 1X PBS. Mescolare bene e distribuire 100 microlitri della miscela cellulare su grandi piastre di agar KB integrate con Kanamicina e incubare a 30 gradi Celsius durante la notte.Contare il numero totale di colonie transconigiunte sulle tre piastre ed estrapolare per calcolare il numero approssimativo di mutanti ottenuti in tutte le piastre. Per aumentare le possibilità di ottenere una libreria rappresentativa, assicurarsi che il numero totale di colonie sia diverse volte superiore al numero totale di geni nel genoma. Per confermare il successo della coniugazione, eseguire una PCR mirata alla cassetta di inserimento utilizzando da 10 a 20 colonie di campioni come descritto nel manoscritto.Sotto un cappuccio sterile, raschiare le colonie dalle piastre aggiungendo uno o due millilitri di 1X PBS sull'agar. Mettere a piscina la miscela cellulare raschiata via dalle piastre in tubi da 50 millilitro. Vortex la libreria per mescolare accuratamente, e poi dividere un millilitro della libreria mutante raggruppata in diversi tubi crio.Aggiungere un millilitro di glicerolo al 70% ai tubi e conservare a meno 80 gradi Celsius. Selezionare una frizione di uova L.villosa e contare il numero di uova che continuano se la frizione contiene più di 100 uova. Per sterilizzare l'intera frizione delle uova, aggiungere 200 microlitri di etanolo al 70% e lavare delicatamente le uova per cinque minuti, quindi rimuovere l'etanolo e lavare le uova due volte con acqua autoclavata.Aggiungere 200 microlitri di candeggina al 12% e lavare delicatamente le uova per 30 secondi. Rimuovere immediatamente la candeggina e lavare nuovamente le uova tre volte con 200 microlitri di acqua autoclavata. Infettare le uova nella frizione di uova sterilizzate usando due volte 10 alle sei cellule per microlitro della libreria mutante lavata in PBS.Due giorni dopo che le larve di coleottero infetto si schiudono, raccogliere larve di 100 secondi per tubo di microfuga da 1,5 millilitro e conservare a meno 80 gradi Celsius. Per generare la libreria di controllo in vitro, inoculare 250 microlitri di due volte 10 alle sei cellule per microlitro della libreria mutante in 10 millilitri di terreno KB contenente Kanamicina. Dopo aver estratto il DNA dalle librerie mutanti cresciute in vivo e in vitro, condividi il DNA con un ultrasuoni.Per verificare se il DNA è stato tranciato nell'intervallo di dimensioni desiderato, caricare cinque microlitri del DNA non scuoiato e tranciato dopo la miscelazione con colorante di carico del gel in un rapporto uno a uno su un gel di agarose all'1,6% a 250 volt per 40 minuti. Per preparare le estremità del frammento necessarie per la legatura dell'adattatore, iniziare aggiungendo tre microlitri della miscela enzimatica e sette microlitri di tampone di reazione a 50 microlitri del DNA tranciato e mescolare bene mediante pipettaggio. Impostare un termociclatore con un coperchio riscaldato a maggiore o uguale a 75 gradi Celsius e incubare i campioni per 30 minuti a 20 gradi Celsius e 30 minuti a 65 gradi Celsius, quindi mantenere la temperatura a quattro gradi Celsius.Per la legatura dell'adattatore, aggiungere 30 microlitri di miscela principale di legatura, un microlitro di potenziatore di legatura e 2,5 microlitri di adattatore diluito ai prodotti della fase di preparazione finale. Mescolare accuratamente mediante pipettaggio e incubare il campione per 15 minuti a 20 gradi Celsius nel termociclatore con il coperchio riscaldato spento. Dopo 15 minuti, aggiungere tre microlitri dell'enzima.Mescolare bene pipettando e incubare il campione per 15 minuti a 37 gradi Celsius in un termociclatore con il coperchio riscaldato a più o uguale a 47 gradi Celsius. Per selezionare la dimensione del DNA legato all'adattatore che prende di mira frammenti di 250 coppie di basi, iniziare vorticosamente la soluzione di perle magnetiche e posizionarla a temperatura ambiente per 30 minuti prima dell'uso. Aggiungere 0,3 volte di perle a 96,5 microlitri della miscela di DNA legato e mescolare pipettando accuratamente.Incubare la miscela di perle per cinque minuti. Posizionare i tubi su un supporto magnetico per tirare giù le perle e rimuovere frammenti di DNA di dimensioni indesiderate. Lasciare che le perle si depositino per cinque minuti e poi trasferire il surnatante trasparente in un nuovo tubo di microfuga.Aggiungere 0,15 volte di perle fresche al surnatante e mescolare pipettando bene. Incubare la miscela di perle per cinque minuti e quindi posizionare i tubi su un supporto magnetico per tirare giù le perle legate al DNA bersaglio. Attendere cinque minuti e poi scartare il surnatante, mantenendo le pere.Con le perle sul supporto magnetico, aggiungere 200 microlitri di etanolo all'80% appena preparato e attendere 30 secondi prima di scartare l'etanolo senza disturbare le perle. Rimuovere i tubi dal supporto e aggiungere 17 microlitri di 0,1X TE o Low TE, quindi mescolare per pipettaggio 10 volte e incubare la miscela a temperatura ambiente per due minuti. Posizionare il tubo sul supporto magnetico e prendere 15 microlitri del DNA selezionato per PCR-1.Perle di streptavitina Vortex e metterle a temperatura ambiente per almeno 30 minuti. Prendi 32 microlitri delle perle e lavali con 500 microlitri di tampone 1X bind e wash. Aggiungere 32 microlitri di 2X legare e lavare il tampone e risospenare le perle.A questo, aggiungere 32 microlitri dei prodotti PCR-1 ripuliti. Mescolare accuratamente e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Posizionare la miscela di DNA di perle su un supporto magnetico per due minuti.Pipettare il surnatante come DNA etichettato con biotina contenente il bordo di inserzione si lega alla streptavitina sulle perle. Lavare le perle con 500 microlitri di 1X bind e wash buffer, quindi lavare le perle con 200 microlitri di Low TE. Sospendare le perle legate al DNA in 17 microlitri di LOW TE. Il DNA delle librerie mutanti in vivo e in vitro estratte e frammentate in un ultrasuoni ha mostrato che la maggior parte dei frammenti si estende tra 100 e 400 coppie di basi. La posizione delle inserzioni mediate dal trasposone attraverso i quattro repliconi del genoma del ceppo A di Burkholderia gladioli può essere osservata nel baccello.Un riepilogo dell'output del sequenziamento e del numero di inserzioni uniche e geni colpiti nelle tre librerie replicate in vivo e in vitro può essere osservato nella tabella. La cosa importante da ricordare è calcolare la dimensione del collo di bottiglia della popolazione durante la colonizzazione dell'ospite per ottenere una rappresentazione appropriata della biblioteca durante l'infezione. Inoltre, regolare per un numero compatibile di generazioni batteriche in vitro e nell'ospite.Dopo aver generato la libreria mutante di trasposoni, può essere sottoposta a screening su supporti selettivi per recuperare i mutanti in base alle differenze fenotipiche. È quindi possibile identificare geni specifici importanti per una condizione.

Research

JoVE Journal

Biology

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Ricerca

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