Name: transposon-insertion sequencing as a tool to elucidate bacterial colonization factors in a burkholderia gladioli symbiont of lagria villosa beetles
Uploaded: 2021-08-12T15:00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles at JoVE.co

手順の共役と指導のための 大腸菌 WM3064 +pRL27株を提供してくれたJunbeom Lee、ミュータントライブラリ生成中のトラブルシューティングを支援してくれたキャスリン・ヒュフマイヤー、昆虫の収集と許可の取得を支援してくれたアンドレ・ロドリゲス教授に感謝しています。また、レベッカ・ジャンケとダグマール・クレブシュが昆虫の収集と飼育を支援してくれたことに感謝します。我々は、ブラジル当局が、昆虫標本のアクセス、収集及び輸出に関する以下の許可を与えることを認める: SISBIO認可Nr。 45742-1、45742-7および45742-10、CNPqプロセスnº 01300.004320/2014-21および01300.0013848/2017-33、IBAMA Nr. 14BR016151および2033DF)この研究は、ドイツ科学財団(DFG)研究助成金FL1051/1-1およびKA2846/6-1からの資金提供によって支えられました。

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著者らは、研究に関する利益相反はないと宣言している。

B.グラディオリトランスポゾン変異ライブラリーを生成し、L.ビロサカブトムシとB.グラディオリ菌との共生相互作用における重要な宿主コロニー形成因子を同定した。プロトコルの主なステップは、結合、宿主感染、DNAライブラリ調製、およびシーケンシングであった。
バークホルデリアの多くの株が共役24、25によって遺伝子改変に適しているように、トランスポゾンおよび抗生物質挿入カセットを運ぶプラスミドは、大腸菌から標的B.グラディオリLv-StA株に正常に共役した。エレクトロポレーションによる変換の以前の試みは、ほぼないB.グラディオリ形質転換体に非常に低いをもたらしました。多数の形質転換体を効率よく生成するために、ターゲット生物の変換技術を最適化することをお勧めします。
1ラウンドの結合と40の結合点は 、B.グラディオリ Lv-StAの3,736個の遺伝子を破壊した。後から考えると、7,468個の遺伝子の大部分を破壊し、飽和ライブラリを得るためには、複数の結合が必要です。特に、結合時のインキュベーション時間は 、B.グラディオリの指数成長期の終わりである12-18時間を超えることは許されなかった。細菌細胞の指数関数的増殖期を超えて結合を可能にすることは、トランスコンジュガント26を得る成功の可能性を減少させる。したがって、結合期間は、細菌種の増殖に応じて調整されるべきである。
宿主における変異体ライブラリーの感染を含む実験を成功させるためには、コロニー形成中の細菌集団のボトルネックサイズおよび感染前のライブラリー内の変異体の多様性を評価することが重要である1、2、27。実験に備えて、感染しなければならないカブトムシの最小数は、ライブラリ内の各変異体がサンプリングされ、植民地化される可能性が高いと推定した。また、実験期間中の生体内細菌発生時間および世代数の概算も計算した。その後、インキュベーション時間を調整することで、インビトロ培養は同等の数の世代に成長しました。他の非モデル宿主における同様の感染実験では、宿主生物の実験室培養および一定の供給源を維持する能力が望ましい。
in vivoおよびin vitroおよびサンプル収集における変異ライブラリーの成長に続いて、トランスポゾン挿入シーケンシングのための改変DNAライブラリー調製プロトコルが実施された。このプロトコルの変更には、カスタム PCR プライマーの設計と、挿入カセットを含む DNA フラグメントを選択する PCR ステップの追加が含まれます。プロトコルがカスタマイズされたため、プロトコルの追加の PCR サイクルにより、オーバーアンプのリスクが高まり、エンド ライブラリ内のハイブリッド化されたアダプター アダプター フラグメントが取得されます。したがって、これらのフラグメントの除去に役立つため、2 つの PCB の後に(サイズを選択せずに)最終的なクリーンアップ手順を推奨します。DNAライブラリのサイズ分布は、予想以上に広かった。しかし、シーケンシング深度を大きくすると、バイオインフォマティクス解析中にフィルタリングされた十分なデータが得られ、満足のいく結果が得られた。
トランスポゾン媒介性変異誘発は、1回の実験で何千ものランダム挿入を生成するので、細菌の増殖に不可欠な遺伝子が破壊された変異体を除く全ての変異体を含む、飽和した変異体のライブラリーを生成することができる。バークホルデリアspに関する他の研究における必須遺伝子の推定を考えると、飽和変異体ライブラリでは機能しなかった可能性が最も高い。28、29.それにもかかわらず、非飽和ライブラリーは、標的突然変異誘発を用いたさらなる研究のための様々な候補遺伝子の探索に役立つ。実験の前に、いくつかのトランスポソンは、ゲノム30の特定の場所で変異体の存在量を増加させる特異的挿入標的部位を有することを覚えておくことも重要である。マリナートランスポゾンは、挿入用のAT部位を標的とすることが知られており、Tn5トランスポソンはGCバイアス32,33を有する。トランスポゾン挿入のホットスポットを認識するバイオインフォマティクス分析中のステップを含めると、分布バイアスの評価に役立ちます。
挫折を起こしやすいが、適切に設計されたトランスポゾン挿入シーケンシング実験は、単一の実験で細菌の多くの条件付きで重要な遺伝子を同定するための強力なツールであり得る。例えば、蘭葉壊死の抑制に重要なバークホルデリアの十数個の遺伝子をトランスポゾン変異誘発とゲノミクス34と組み合わせることにより同定した。バークホルデリアを超えて、いくつかの接着および運動性遺伝子およびトランスポーターは、アピス・メリケラ(ハニービー)22のスノドグラセラ・アルヴィ共生生物と、エウプリムナ・スコロペス(ハワイ・ボブ・スクイド)23の重要なコロニー形成因子として同定されている。
別のアプローチとして、トランスポゾン変異誘発は、シーケンシングの代わりに選択的培地を用いる個々の変異体のスクリーニングを続けてもよい。運動性、生理活性二次代謝物の産生、または特定のオーソトロフィーなどの欠乏を特定するための表現型スクリーニングまたはバイオアッセイは、実現可能である。例えば、 バークホルデリア昆虫菌 ( カバレロニア属に再割り当てされた)トランスポゾン変異ライブラリーのスクリーニングは、共生者が リプトルトゥス・ペデストリスを植民地化するための運動性遺伝子を採用していることを同定する上で重要であった。さらに、トランスポゾン変異誘発および表皮スクリーニングを用いて、生物活性二次代謝産物カルヨイネンシンの生合成遺伝子クラスターを 、バークホルデリア・カリョフィリ37において同定した。プセポゾン変異誘発およびスクリーニングに続いて 、バークホルデリア・シュードマレイ の栄養変異体が同定され、ヒトおよび動物38における危険な疾患であるメリオイドーシスに対して可能な減衰ワクチン候補である。したがって、トランスポゾン変異生成とシーケンシングは、病原性または相互的な関連においてそれぞれの宿主との相互作用にとって重要な細菌の分子形質を研究する上で貴重なアプローチである。

バークホルデリア・グラディオリは、ラグリア・ビロサカブトムシと共生関連を持ち、昆虫宿主4、5、6の微生物アンタゴニストに対する防御において重要な役割を果たすことができる。女性のカブトムシは、生殖器系に特殊な腺アクセサリーでB.グラディオリのいくつかの株を収容します。産卵時に、雌はB.グラディオリによって産生される抗菌化合物がエントモ病原性真菌4、6によって感染を阻害する卵表面にB.グラディオリ細胞を塗りつぶす。後期胚発生時または幼虫孵化後の早期に、細菌は幼虫の後部表面に切開部の膣を植民地化する。この特殊な局在化と共生者の垂直伝送経路にもかかわらず、L.絨毛は環境4から水平にB.グラディオリを取得することもできます。さらに、少なくとも3株のB.グラディオリがL.絨毛4,6と関連して発見されている。これらの中で、B.グラディオリLv-StAは、インビトロで栽培するのに適している唯一のものです.
B. グラディオリLv-StAのゲノムサイズは8.56 Mb6で、7,468個の遺伝子が含まれています。B.グラディオリ菌がカブトムシ宿主を植民地化するために重要な遺伝子はどれですか?この質問に答えるために、条件付きで必須の微生物遺伝子1、2、3を同定するための探索的方法であるトランスポゾン挿入シーケンシング(Tn-seq)を用いた。B.グラディオリLv-StAの変異ライブラリーは、Tn5トランスポゾンを用いて作成されました。エシェリヒア・コリドナー細胞からB.グラディオリLv-StAへの結合を通じて、Tn5トランスポゾンを運ぶpRL27プラスミドと、逆繰り返しで横たわる抗生物質耐性カセットを移管した(図1)。それにより、3,736個の共生遺伝子の破壊を個別に運ぶ変異体のセットが生成された(図2)。
変異プールは、コロニー形成因子を同定するためにカブトムシ卵に感染し、対照として、キングスB(KB)培地 でインビトロで 成長した。コロニー形成に十分な時間を確保した後、孵化した幼虫を採取し、DNA抽出のためにプールした。トランスポゾン挿入物を含むDNAの断片と B.グラディオリ Lv-StAの横向きゲノム領域を、シーケンシング用の改変DNAライブラリー調製プロトコルを用いて選択した。読み取り品質処理に続いてDESeq2による分析を行い、B. グラディオリ Lv-StAが卵表面を介して透過したときに L.ビロサ 幼虫を植民地化するために重要な特定の遺伝子を同定するために行われました。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,6- Diaminopimelic Acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B22391</td>
			<td>For E.coli WM3064+ pRL27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar - Agar</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure beads XP (magentic beads + polyethylene glycol + salts)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td>Size selection in step 6.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach (NaOCl) 12%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie2 v.2.4.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinfromatic tool for read mapping. Reference 10 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer-S</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>PEQL01-1020</td>
			<td>For PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutadapt v.2.10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatic tool for removing specific adapter sequences from the reads. Reference 8 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DESeq2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RStudio package for assessing differential mutant abundance. Usually used for RNAseq analysis. Reference 12 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder 100 bp</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T834.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>R0182</td>
			<td>PCR for confirming success of conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Di-Sodium salt</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epicentre MasterPure Complete DNA and RNA Purification Kit</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>MC85200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2218.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastQC v.0.11.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatic tool for assessing the quality of sequencing data. Reference 7 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeatureCounts v.2.0.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatic tool to obtain read counts per genomic feature. Reference 11 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>7530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Serva</td>
			<td>26899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>4936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td>Roth</td>
			<td>PO27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index primers set 1)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7335S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7645S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone (soybean)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2365</td>
			<td>For Burkholderia gladioli Lv-StA KB-medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peqGOLD &#39;Hot&#39; Taq- DNA Polymerase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PEQL01-1020</td>
			<td>PCR for confirming success of conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates - 145 x 20 mm</td>
			<td>Roth</td>
			<td>XH90.1</td>
			<td>For selecting transconjugants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates - 90 x 16 mm</td>
			<td>Roth</td>
			<td>N221.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiaxcel (StarSEQ GmbH, Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Quality check after DNA library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin beads</td>
			<td>Roth</td>
			<td>HP57.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>01-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic v.0.36</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatic tool for trimming low quality reads and also adapter sequences. Reference 9 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris -HCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9090.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2366</td>
			<td>For Escherichia coli WM3064+pRL27 LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td>Bandelin</td>
			<td>GM 70 HD</td>
			<td>For shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER enzyme (uracil DNA glycosylase + DNA glycosylase- lyase Endonuclease VIII)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7645S</td>
			<td>Ligation step 6.5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2363</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transposon-insertion sequencing as a tool to elucidate bacterial colonization factors in a burkholderia gladioli symbiont of lagria villosa beetles

遺伝子の活性を操作することによって遺伝子の機能を推測することは、ほとんどの生物学的プロセスの遺伝的基盤を理解するための不可欠なツールです。分子微生物学の進歩により、遺伝子の操作に関する多様な変異発生技術が出現しています。その中でもトランスポゾン挿入シーケンシング(Tn-seq)は、多くの候補遺伝子の機能性を非標的化方法で同時に評価する貴重なツールです。この技術は、いくつかの病原性微生物およびいくつかの有益な共生生物における真核生物宿主の植民地化のための分子メカニズムを同定するための鍵となっている。
ここで、Tn-seqは、カブトムシラグリアビロサの相互主義的なバークホルデリア・グラディオリ共生者における植民地化因子を同定する方法として確立される。結合によって、Tn5トランスポゾン媒介性抗生物質耐性カセットの挿入は、B.グラディオリのランダムゲノム位置で行われる。カブトムシ宿主を植民地化する細菌の能力に対する遺伝子破壊の影響を同定するために、生成されたB.グラディオリトランスポゾン変異ライブラリーはカブトムシの卵に接種され、一方で液体培養培地で体外でコントロールが成長する。コロニー形成に十分な時間を与えた後、DNAはin vivoおよびin vitro成長ライブラリーから抽出される。DNAライブラリー調製プロトコルに従って、DNAサンプルはトランスポゾン挿入シーケンシング用に調製される。トランスポゾン挿入エッジと横向きの細菌DNAを含むDNA断片が選択され、突然変異部位はトランスポゾン挿入エッジから離れてシーケンシングすることによって決定されます。最後に、in vivoとin vitroライブラリの間の各変異体の頻度を分析および比較することによって、カブトムシのコロニー形成中の特異的共生遺伝子の重要性を予測することができる。

宿主関連細菌は、接着性、運動性、化学軸、ストレス応答、または特定のトランスポーターを媒介するものを含む、関連を確立するためにいくつかの要因を採用することができる。いくつかの細菌13、14、14、15、16、17、18に重要な因子が報告されているが、バークホルデリア属のメンバーを含む19、20、より少ない研究は、植民地化のための有益な共生者によって使用される分子メカニズムを探求している21、22、23 .トランスポゾン挿入シーケンシングを使用して、B.グラディオリがL.ビロサカブトムシを植民地化することを可能にする分子因子を同定することが目的であった。
トランスポゾン媒介性変異誘発は、転写反復部位に隣接するTn5トランスポゾンおよびカナマイシン耐性カセットを運ぶpRL27プラスミドを用いて行った。プラスミドを、プラスミドドナー大腸菌WM3064株との共役によって標的B.グラディオリLv-StA細胞に導入した(図1に示すように)。共役後、B.グラディオリレシピエントおよび大腸菌ドナー細胞を含む結合体混合物を、カナマイシンを含む選択的寒天プレート上にメッキした。プレート上のDAPの不在は、ドナー大腸菌細胞を排除し、成功したB.グラディオリLv-StAトランスコンジュガントのために選択されたカナマイシンの存在。100,000個のトランスコンジュガントコロニーを収穫した結果得られたプールされたB.グラディオリLv-StA変異体ライブラリーを、改変DNAライブラリー調製キットおよびカスタムプライマーを用いてシーケンシング用に調製した。図2は、DNAライブラリの作成手順を示しています。シーケンスは、4 Mio ペアの読み取りを生成しました。B.グラディオリLv-StAの7,468遺伝子のうち3,736個の遺伝子が破壊された。
宿主におけるコロニー形成欠陥があった変異体を同定するために 、B.グラディオリ Lv-StA変異体ライブラリーをカブトムシの卵に感染させ、コントロールとしてKB培地 でインビトロで 増殖した。イン ビボ コロニー形成ボトルネックサイズは実験前に計算した。既知の数の B.グラディオリ Lv-StA細胞がカブトムシの卵に感染し、各幼虫から懸濁液をメッキし、個体ごとにコロニー形成ユニットを数えることによって、最初に孵化した新しいインスター幼虫中のコロニー形成細胞の数を得た。これらの計算は、コロニー形成細胞の数が、宿主を植民地化する能力についてライブラリー内の変異体のすべてまたは高い割合を評価するのに十分であることを保証するために行われた。さらに 、in vitro と in vivo 条件の間の成長時間は、これらのサンプルを比較可能にするために細菌世代数に基づいて正規化された。
卵が孵化した後、1,296頭の幼虫が13のプールに集められました。対応する インビトロ 変異培養物を成長させ、グリセロールストックとして保存した。 in vivo およびin vitro 成長変異体ライブラリーのDNAを超音波処理器で抽出し断片化した。 図3 は、断片の大部分が予想通り100~400bpの範囲に及ぶ、せせられたDNAのサイズ分布を示しています。このステップの後に、シーケンスのための修飾されたDNAライブラリー調製プロトコルが続いた。プロトコルの各ステップで、残りのDNAの濃度をチェックして、ステップが正しく実行されたことを確認し、DNAの損失を追跡しました。シーケンシング前の品質チェック( 材料表を参照)により、DNAライブラリに予期せず大きな(>800 bp)DNA断片が含まれていることが明らかになっており、in vivoライブラリでは より顕著であった。シーケンスレーン内のフラグメントのクラスタリングを最適化するのが難しいため、読み取りの所望の数を達成するために 、in vivo ライブラリで10 Mioペアの読み取りにシーケンス深度を大きくする必要がありました。シーケンシング結果の分析結果から 、in vivo ライブラリ内の平均4 Mio読み取りと、in vitro ライブラリでの3.1 Mioの読み取りには、この実験に満足できるRead-1の5'末端(表9)にトランスポゾンエッジが含まれていることが明らかになった。元のライブラリーにおける B.グラディオリ ゲノム全体の24,224個のユニークな挿入の分布を 図4に示します。DESeq2を用いて行った分析により、271個の変異体の存在量が 生体内 と インビトロ の条件の間で有意に異なっていたことが明らかになった。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62843/62843fig03.jpg"> 図3:変異体およびDNAライブラリーのアガロースゲル(A)車線xの突然変異体の未シェアDNAとスケール用1kbpのラダーを有するアガロースゲル。(B) シーアド DNA ライブラリーを用いたゲル化。最初の車線のラダーのバンドサイズは左側に示されています。最初の3レーンa、b、およびcには、in vivoライブラリのシアーDNA断片が含まれています。lanes d,e,f,gは、インビトロライブラリーのシアDNA断片を含む。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62843/62843fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62843/62843fig04.jpg"> 図4:バークホルデリア・グラディオリLv-StAゲノム内の4つのレパコンの元のライブラリ内のユニークな挿入部位の位置X 軸に沿った各バーは、挿入のサイトにあります。Y 軸に沿ったバーの高さは、そのサイトに関連付けられた読み取りの数に対応します。なお、2つの染色体と2つのプラスミドは全長で示され、X軸上で異なるスケールを有していることに注意してください。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62843/62843fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">キングスBミディアム/寒天</td>
		</tr>
<tr>
<td>ペプトン(大豆)</td>
			<td>20 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>K2HPO4
</td>
			<td>1.5 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td>1.5 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>寒天</td>
			<td>15 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">蒸留水に溶解</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">LBミディアム/寒天</td>
		</tr>
<tr>
<td>トリプトン</td>
			<td>10 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>酵母エキス</td>
			<td>5 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>ナクル</td>
			<td>10 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">蒸留水に溶解</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:メディアコンポーネント
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>いいえ。</td>
			<td>プライマー</td>
			<td colspan="2">順序</td>
			<td>PCR アニール温度(°C)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>tpnRL17-1RC</td>
			<td colspan="2">5'-CGTTACATCCCTGGCTGTT-3'</td>
			<td rowspan="2">58.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>tpnRL13-2RC</td>
			<td colspan="2">5'-TCGTGAGAAGGTGtTG-3'</td>
		</tr>
</tbody></table>表2:結合の成功を確認するプライマー。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>コンポーネント</td>
			<td>ボリューム(μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HPLC精製水</td>
			<td>4.92</td>
		</tr>
<tr>
<td>10x バッファ S (特異性が高い)</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2 (25 mM)</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>dMP (2 mM)</td>
			<td>1.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>プライマー 1 (10 pmol/μL)</td>
			<td>0.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>プライマー2(10 pmol/μL)</td>
			<td>0.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>タク (5 U/μL)</td>
			<td>0.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>マスターミックス合計</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td>テンプレート</td>
			<td>1</td>
		</tr>
</tbody></table>表3:結合の成功を確認するPCRマスターミックス。 略語: HPLC = 高速液体クロマトグラフィー;dNTPs = デオキシヌクレオシド三リン酸.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ステップス</td>
			<td>温度 °C</td>
			<td>時間</td>
			<td>サイクル</td>
		</tr>
<tr>
<td>初期変性</td>
			<td>95</td>
			<td>3分</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>変性</td>
			<td>95</td>
			<td>40 s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>アニーリング</td>
			<td>58.2</td>
			<td>40 s</td>
			<td>30~35</td>
		</tr>
<tr>
<td>延長</td>
			<td>72</td>
			<td>1-2分</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>最終拡張</td>
			<td>72</td>
			<td>4分</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>持つ</td>
			<td>4</td>
			<td colspan="2">∞</td>
		</tr>
</tbody></table>表4:結合の成功を確認するPCR条件。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>プライマー</td>
			<td colspan="2">順序</td>
			<td>Tm °C</td>
			<td>使う</td>
			<td>源</td>
		</tr>
<tr>
<td>トランスポゾン特異的ビオチン化プライマー</td>
			<td colspan="2">5'-ビオチン-アカガアカッチャッハックガキャット -3'</td>
			<td>63.5</td>
			<td>6.7.1. PCR I</td>
			<td>習慣</td>
		</tr>
<tr>
<td>改変ユニバーサルPCRプライマー</td>
			<td colspan="2">5'- アトガタックグッカッカッカガガタック タクトクトクトタッハタチャッカクガクト TTCCGATCTGAATTCATCGATATATAT GGTTガガットGT – 3 '</td>
			<td>62</td>
			<td>6.10.1. PCR II</td>
			<td>習慣</td>
		</tr>
<tr>
<td>インデックスプライマー</td>
			<td colspan="3">製造元のマニュアルを参照してください。</td>
			<td>6.7.1. PCR I および 6.10.1.PCR II</td>
			<td>NEBNext イルミナ用マルチプレックスオリゴス(インデックスプライマーセット1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>アダプタ</td>
			<td colspan="3">製造元のマニュアルを参照してください。</td>
			<td>6.5. アダプターライゲーション</td>
			<td>NEB次のウルトラII DNAライブラリのイルミナ用準備キット</td>
		</tr>
</tbody></table>表5:DNAライブラリー調製中のPCR IおよびII用プライマーおよびアダプター。 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>PCR ミックス</td>
			<td>(μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>アダプター・リガイテッド DNA フラグメント</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>ネブネクスト ウルトラII Q5 マスターミックス</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>インデックスプライマー(10 pmol/μL)</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>トランスポゾン特異的ビオチン化プライマー(10 pmol/μL)</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>総量</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>表 6: DNAライブラリー調製-PCR I マスターミックス
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ステップス</td>
			<td>温度</td>
			<td>時間</td>
			<td>サイクル</td>
		</tr>
<tr>
<td>初期変性</td>
			<td>98°C</td>
			<td>30 s</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>変性</td>
			<td>98°C</td>
			<td>10 s</td>
			<td rowspan="3">6~12</td>
		</tr>
<tr>
<td>アニーリング</td>
			<td>65°C</td>
			<td>30 s</td>
		</tr>
<tr>
<td>延長</td>
			<td>72°C</td>
			<td>30 s</td>
		</tr>
<tr>
<td>最終拡張</td>
			<td>72°C</td>
			<td>2分</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>持つ</td>
			<td>16°C</td>
			<td colspan="2">∞</td>
		</tr>
</tbody></table>表7:DNAライブラリー調製-PCRIおよびII条件
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>PCR ミックス</td>
			<td>(μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>ビーズ選択DNA</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>ネブネクスト ウルトラII Q5 マスターミックス</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>インデックスプライマー</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>改変ユニバーサル PCR プライマー</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>総量</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>表 8: DNA ライブラリー調製 -PCR II マスター ミックス
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">ライブラリ</td>
			<td>イヴィーボ-1</td>
			<td>イヴィーボ-2</td>
			<td>インビボ-3</td>
			<td>インビトロ-1</td>
			<td>インビトロ-2</td>
			<td>インビトロ-3</td>
			<td>元のライブラリ</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">いいえ。読み取りの (PE)</td>
			<td>56,57,710</td>
			<td>39,19,051</td>
			<td>30,65,849</td>
			<td>35,73,494</td>
			<td>28,83,440</td>
			<td>36,61,956</td>
			<td>46,09,410</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">いいえ。読み取り-1の5'の終わりのTn - エッジを含む読み取りの</td>
			<td>54,15,880</td>
			<td>37,31,169</td>
			<td>29,36,247</td>
			<td>33,00,499</td>
			<td>27,35,705</td>
			<td>33,50,402</td>
			<td>41,53,270</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">ボウタイ2全体のアライメント率(%)(読み取り-1のみ)</td>
			<td>95.53%</td>
			<td>83.71%</td>
			<td>89.87%</td>
			<td>80.79%</td>
			<td>78.00%</td>
			<td>73.06%</td>
			<td>74.92%</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">一意の挿入の数</td>
			<td>8,539</td>
			<td>4,134</td>
			<td>7,183</td>
			<td>18,930</td>
			<td>18,421</td>
			<td>20,438</td>
			<td>24,224</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">ヒットした遺伝子の数</td>
			<td>1575</td>
			<td>993</td>
			<td>1450</td>
			<td>2793</td>
			<td>2597</td>
			<td>3037</td>
			<td>3736</td>
		</tr>
</tbody></table>表9:ライブラリごとのシーケンス出力とトランスポゾン挿入周波数の概要 略語: PE = ペアエンド。

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Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles

これは、 バークホルデリア 有益な共生者における候補昆虫コロニー形成因子を同定するための適応的方法である。このカブトムシ宿主はトランスポゾン変異生成を介して生成されたランダム変異体ライブラリーに感染し、コロニー形成後のライブラリーの複雑さは 、インビトロで増殖した対照と比較される。

ラグリア・ビロサ・カブトムシのバークホルデリア・グラディオリ・シンビエントにおける細菌コロニー形成因子を解明するためのツールとしてのトランスポゾン挿入シーケンシング

Inferring the function of genes by manipulating their activity is an essential tool for understanding the genetic underpinnings of most biological ...

このプロトコルは、共生細菌、この場合、特にバークホルデリア上で遺伝子操作を行い、昆虫宿主を植民地化するために不可欠な遺伝子を同定するのに有用である。トランスポゾン挿入シーケンシングは、1回の実験で同時に多数の条件的に必須遺伝子を同定するための強力なツールです。滅菌フードの下でカナマイシンとDAPを補充LB培地の10ミリリットルで大腸菌ドナーの新鮮なドナー培養を接種することから始めます.5ミリリットルのKB培地中の受取細胞にバークホルデリア・グラディオリを接種する。250 RPMのシェーカーで一晩摂氏30度で培養をインキュベートします。一晩増殖した後、遠心分離は、各培養物の4ミリリットルを9で、600倍Gで6分間細胞をペレットし、上清を捨てる。無菌フードの下で、ペレット化された細胞培養物をDAPを含むKB培地で洗浄する。そして最後に、KBプラスDAP培地の4ミリリットルで培養を別々に再中断する。新鮮な15ミリリットルのチューブに、洗浄された大腸菌ドナー細胞の250マイクロリットルを、洗浄されたバークホルデリア・グラディオリ株Aレシピエント細胞の1ミリリットルと混合する。DAPを含むKB寒天プレート上のこの共役細胞混合物の10マイクロリットルをスポットする。プレートを室温で無菌フードに邪魔されずに1時間放置します。12〜18時間摂氏30度のコンジュゲーションスポットでプレートをインキュベートします。インキュベーションの後、滅菌フードの下のプレートに1X PBSの2〜4ミリリットルを加え、細胞スクレーパーを使用して寒天から成長した細菌の共役スポットを放出します。次いで、コンジュゲートされた細胞を2つのミリリットルマイクロフュージチューブにピペット混合する。ペレットは、9で遠心分離により細胞を、2分間Gを600回回行う。上清を捨て、ペレットを1ミリリットルで2回洗浄します。最終ペレットを1,200マイクロリットルの1X PBSで再懸濁します。よく混合し、カナマイシンを補った大きなKB寒天プレートに細胞混合物の100マイクロリットルを広げ、一晩摂氏30度でインキュベートします。3つのプレート上のトランスコンジュガントコロニーの総数をカウントし、全てのプレートで得られた変異体の概数を計算するために外挿する。代表的なライブラリーを得る可能性を高めるには、コロニーの総数がゲノム内の遺伝子の総数よりも数倍高いことを確認してください。結合の成功を確認するために、原稿に記載されている10〜20個のサンプルコロニーを用いて挿入カセットを標的とするPCRを行う。無菌フードの下で、寒天に1〜2ミリリットルの1X PBSを加えることによって、プレートからコロニーを削ります。プレートから削り取った細胞混合物を50ミリリットルのチューブにプールします。ライブラリを完全に混合し、プールされた変異体ライブラリの1ミリリットルをいくつかのクライオチューブに分割する。チューブに70%グリセロールの1ミリリットルを加え、マイナス80°Cで保存します。L.絨毛の卵クラッチを選択し、クラッチに100個以上の卵が含まれている場合に継続する卵の数を数えます。卵クラッチ全体を殺菌するには、200マイクロリットルの70%エタノールを加え、卵を5分間静かに洗い、エタノールを取り除き、卵をオートクレーブ水で2回洗います。12%漂白剤の200マイクロリットルを加え、30秒間ゆっくりと卵を洗います。すぐに漂白剤を取り出し、200マイクロリットルのオートクレーブ水で卵を再び3回洗います。PBSで洗浄された変異体ライブラリーのマイクロリットル当たり6細胞に2回10回を使用して殺菌された卵クラッチの卵を感染させる。感染したカブトムシの幼虫の孵化の2日後、1.5ミリリットルマイクロフュージチューブあたり100秒のインスター幼虫を集め、マイナス80度で貯蔵する。in vitro対照ライブラリーを生成するために、カナマイシンを含む10ミリリットルのKB培地中の変異体ライブラリーのマイクロリットル当たり2倍10の250マイクロリットルを6個の細胞に接種する。in vivoおよびin vitro成長変異体ライブラリーからDNAを抽出した後、超音波処理器とDNAを共有する。DNAが所望のサイズ範囲に剪定されているかどうかを確認するには、250ボルトで250ボルトで40分間実行される1.6%アガロースゲルでゲルローディング色素と混合した後、未シャレおよび剪定されたDNAの5マイクロリットルを40分間250ボルトで実行した。アダプターの結紮に必要な断片の端を準備するには、まず、3マイクロリットルの酵素ミックスと7マイクロリットルの反応バッファーを50マイクロリットルのせよシレDNAに加え、ピペット処理によってよく混合します。熱した蓋を摂氏75度以上に熱せ、摂氏20度で30分、摂氏65度で30分間インキュベートし、温度を摂氏4度に抑えます。アダプターライゲーションの場合、ライゲーションマスターミックスの30マイクロリットル、ライゲーションエンハンサーの1マイクロリットル、および希釈されたアダプターの2.5マイクロリットルを、調製工程の終わりの製品に加えます。ピペットで十分に混ぜ、熱い蓋をオフにしてサーモサイクラーで摂氏20度で15分間インキュベートします。15分後、3マイクロリットルの酵素を加える。ピペットでよく混ぜ、蓋を摂氏47度以上で加熱したサーモサイクラーで摂氏37度で15分間インキュベートします。250塩基対のフラグメントを標的とするアダプター連結DNAのサイズを選択するには、まず磁気ビーズ溶液をボルテックスして、使用前に30分間室温に置きます。結紮されたDNA混合物の96.5マイクロリットルに0.3倍のビーズを加え、十分にピペットで混ぜます。ビーズ混合物を5分間インキュベートします。チューブを磁気スタンドに置いてビーズを引き下げ、不要なサイズのDNA断片を取り除きます。ビーズを5分間落ち着かせ、透明な上清を新しいマイクロフュージチューブに移します。上清に0.15倍の新鮮なビーズを加え、よくピペットで混ぜます。ビード混合物を5分間インキュベートし、チューブを磁気スタンドに置き、標的DNAに結合したビーズを引き下げます。5分間待ってから、上清を捨て、ビーズを保管します。マグネットスタンドにビーズを入れ、200マイクロリットルの新しい80%エタノールを加え、ビーズを邪魔することなくエタノールを廃棄する前に30秒間待ちます。スタンドからチューブを取り出し、0.1X TEまたはLow TEの17マイクロリットルを加え、10回ピペットして混ぜ、室温で2分間インキュベートします。チューブを磁気スタンドに置き、PCR-1用にサイズ選択されたDNAを15マイクロリットル取ります。ボルテックスストレプトアビジンビーズを室温で少なくとも30分間置きます。ビーズの32マイクロリットルを取り、1X結合し、バッファーを洗浄する500マイクロリットルでそれらを洗浄します。32マイクロリットルの2X結合と洗浄バッファーを加え、ビーズを再中断します。これに、クリーンアップされたPCR-1製品の32マイクロリットルを加えます。十分に混ぜ合わせ、室温で30分間インキュベートします。ビーズDNA混合物を磁気スタンドに2分間置きます。ピペットは、挿入エッジを含むビオチンタグ付きDNAとして上清を出し、ビーズ上のストレプトアビジンに結合する。500マイクロリットルの1X結合と洗浄バッファーでビーズを洗浄し、200マイクロリットルの低TEでビーズを洗います。DNA結合ビーズを17マイクロリットルの低TEで再懸濁する。インビボおよびin vitro成長変異体ライブラリーのDNAは、超音波処理器で抽出および断片化され、100と400塩基対の間に及ぶ断片の大部分を示した。バークホルデリア・グラディオリ株Aゲノムの4つのレパコンにわたるトランスポゾン媒介挿入の位置は、ポッド内で観察することができる。シーケンス出力の概要と、生体内およびin vitroライブラリの3つの反復でヒットしたユニークな挿入および遺伝子の数は、表で観察することができます。覚えておくべきことは、感染時にライブラリの適切な表現を得るために、ホストの植民地化中に母集団のボトルネックサイズを計算することです。また、生体外および宿主における細菌世代の互換性のある数に合わせて調整します。トランスポゾン変異ライブラリーを生成した後、選択的培地上でスクリーニングして、フェノールの違いに基づいて変異体を回収することができる。したがって、条件に重要な特定の遺伝子を同定することができる。

Research

JoVE Journal

Biology

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安定した濃度勾配で細菌走化性を定量化するためのマイクロ流体デバイス

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マイクロインジェクション分子およびそれらの真核生物の細胞内ターゲットを視覚化するツールに相関光学および電子顕微鏡（クレム）


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Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

宿主植物の揮発性物質のスクリーニングツールとしてElectroantennographicバイオアッセイ

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Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

リボソーム結合したポリペプチドを単離するためのツールと​​してSECM逮捕シーケンスを使用して、

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

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Tetrad analysis is a valuable tool for yeast genetics, but the laborious manual nature of the process has hindered its application on large scales. ...

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

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C-FOSタンパク質免疫組織学的検出：特定の生理反応に関与する中央経路のマーカーとして有用ツール<em&gt;インビボ</em&gt;と<em&gt; ex vivoで</em

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

血管内皮増殖因子の評価のための簡易バイオアッセイ

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

個々の細胞タイプの転写プロファイリングのためのツールと​​してのレーザ支援顕微解剖（LAM）

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...