Name: transposon-insertion sequencing as a tool to elucidate bacterial colonization factors in a burkholderia gladioli symbiont of lagria villosa beetles
Uploaded: 2021-08-12T15:00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles at JoVE.co

Vi er takknemlige til Junbeom Lee for å ha levert E. coli WM3064+pRL27-stammen for konjugering og veiledning i prosedyren, Kathrin Hüffmeier for å hjelpe til med feilsøking under mutant bibliotekgenerering, og prof. André Rodrigues for å støtte insektinnsamling og tillatelsesanskaffelse. Vi takker også Rebekka Janke og Dagmar Klebsch for støtte i innsamling og oppdrett av insekter. Vi anerkjenner brasilianske myndigheter for å gi følgende tillatelser for tilgang, innsamling og eksport av insektprøver: SISBIO-autorisasjon Nr. 45742-1, 45742-7 og 45742-10, CNPq prosess nº 01300.004320/2014-21 og 01300.0013848/2017-33, IBAMA Nr. 14BR016151DF og 200BR35212/DF). Denne forskningen ble støttet av midler fra German Science Foundation (DFG) Research Grants FL1051/1-1 og KA2846/6-1.

1. Forberedelse av medier og buffer
<ol><li>Forbered KB- og LB-medier og agarplater som angitt i tabell 1, og autoklav ved 121 °C, 15 psi, 20 min.<ol>
<li>Tilsett 50 μg/ml filtersterilisert kanamycin og 300 μM filtersterilisert 2,6-diaminopimelic acid (DAP) til det autoklavede LB-mediet før du dyrker E.coli WM3064 + pRL27.</li>
		<li>Tilsett 50 μg/ml filtersterilisert kanamycin i den autoklavede KB-agaren for å helle plater som trengs for å velge vellykkede B. gladioli Lv-StA-transkonjuganter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forbered 1x fosfatbufret saltvann (PBS) ved å blande følgende komponenter: NaCl 8 g/L, KCl 0.201 g/L, Na2HPO4 1,42 g/l og KH2PO4 0,272 g/l. Løs opp saltene i destillert vann og autoklaver blandingen ved 121 °C, 15 psi, 20 min før bruk. Oppbevars ved romtemperatur.</li>
	<li>Forbered en 2x bind-og-vask buffer ved å oppløse følgende komponenter: 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM etylendiamintetraedsyre (EDTA) og 2 M NaCl i destillert vann. Filtrer-steriliser blandingen før bruk. Oppbevars ved romtemperatur.</li>
	<li>Forbered 1x low-TE ved å oppløse 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) og 0,1 mM EDTA i dobbeltdestillert vann. Steriliser ved autoklavering ved 121 °C, 15 psi, 20 min. Oppbevars ved romtemperatur.</li>
</ol>2. Konjugering for å generere transposon mutantbiblioteket
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62843/62843fig01.jpg"> Figur 1: Trinn i konjugeringsprotokollen. Konjugeringsmottakeren Burkholderia gladioli Lv-StA (rød) og donor Escherichia coli som inneholder pRL27 plasmid (rosa) dyrkes i henholdsvis KB agar og LB, supplert med kanamycin og DAP. Etter konjugativ overføring av plasmidet i 12-18 timer ved 30 °C, velges transkonjugante B. gladioliceller på KB som inneholder kanamycin og samles sammen. Forkortelser: DAP = 2,6-diaminopimelic syre; Kan = kanamycin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62843/62843fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<ol><li>Under en steril hette inokulerer du en frisk donorkultur av Escherichia coli WM3064 + pRL27 i 10 ml LB-medium supplert med kanamycin og DAP. Inokulerte Burkholderia gladioli Lv-StA mottakerceller i 5 ml KB medium. Inkuber kulturene ved 30 °C over natten på en shaker ved 250 o/min.</li>
	<li>Etter nattvekst, sentrifuge 4 ml av hver av kulturene på 9600 × g i 6 min for å pellet cellene. Kast supernatanten.</li>
	<li>Under en steril hette, vask pelleted cellekulturer i KB medium som inneholder DAP og til slutt resuspend kulturene separat i 4 ml KB + DAP medium.</li>
	<li>Bland 250 μL av de vaskede E. coli-donorcellene med 1 ml av de vaskede B. gladioli Lv-StA-mottakercellene i et friskt 15 ml rør.</li>
	<li>Spot 10 μL av denne konjugeringscelleblandingen på KB agarplater som inneholder DAP. La platen hvile uforstyrret i den sterile hetten ved romtemperatur i 1 time. Deretter inkuberer du platene med konjugeringspunktene ved 30 °C i 12-18 timer. MERK: Konjugeringsperioden kan justeres i henhold til målartene. En lang konjugeringsperiode øker imidlertid risikoen for doble innsettinger eller plasmidintegrasjon i genomet. For langsomt voksende bakterier, gi lengre konjugeringsperioder.</li>
	<li>Etter inkubasjon, tilsett 2-4 ml 1x PBS i platene under en steril hette og bruk en celleskraper for å frigjøre de dyrkede bakterielle konjugeringsflekkene fra agaren. Pipette den konjugerte celleblandingen i 2 ml mikrofugerør.</li>
	<li>Pellet cellene ved sentrifugering på 9600 × g i 2 min. Kast supernatanten og vask pelletsen to ganger i 1 ml 1x PBS ved å pipettere opp og ned. Resuspend den endelige pellets i 1200 μL av 1x PBS. Lag fortynning før plating hvis antall celler i blandingen er over 1 × 104.</li>
	<li>Bland godt og spred 200 μL av celleblandingen på store KB agarplater (6 eller flere, om nødvendig) supplert med kanamycin og inkuber ved 30 °C over natten. MERK: Målmutantkolonier vises innen 30 timer på de selektive agarplatene. På grunn av antibiotikaresistensmarkøren vises bare muterte kolonier på den selektive agarplaten. Derfor forventes alle kolonier å være vellykkede transkonjuganter.</li>
	<li>Tell det totale antallet transkonjugante kolonier på tre plater og ekstrapoler for å beregne omtrentlig antall mutanter oppnådd i alle platene. For å øke sjansene for å få et representativt bibliotek, sørg for at det totale antallet kolonier er flere ganger høyere enn det totale antall gener i genomet. For å bekrefte suksessen med konjugering, utfør en PCR rettet mot innsettingskassett ved hjelp av 10-20 prøvekolonier, som beskrevet i avsnitt 3. MERK: Målet er å sikre at antall kolonier er minst 10 ganger antall gener i hele genomet, i dette tilfellet > 75.000 mutanter. Det er imidlertid generelt utfordrende å nøyaktig estimere antall kolonier som vil tilsvare et fullt representativt bibliotek. Antallet unike gener mutert er ikke tydelig på dette tidspunktet, gitt at forstyrrelser i essensielle gener ikke fanges opp, det er ofte flere forskjellige mutasjonssteder for samme gen, og mutasjoner generert med Tn5 transposoner er ikke helt tilfeldige.</li>
	<li>Under en steril hette skraper du kolonier fra platene ved å tilsette 1-2 ml 1x PBS på agaren. Slå sammen celleblandingen som skrapes av platene til 50 ml rør. Vortex biblioteket for å blande grundig og deretter dele 4 ml av det samlede mutantbiblioteket i flere kryorør. Tilsett 1 ml 70% glyserol i rørene og oppbevar ved -80 °C.</li>
</ol>3. PCR og gelelektroforese for å bekrefte vellykkede innsettinger i B. gladioli Lv-StA
<ol><li>Hvis du vil bekrefte at innsettingen finnes, velger du individuelle mutantkolonier fra merkeplatene i trinn 2.9 og utfører en PCR som er rettet mot innsettingskassett ved hjelp av primerne som er oppført i tabell 2. Klargjør PCR-hovedmiksen i henhold til tabell 3 og still inn forholdene i termosypen som beskrevet i tabell 4.</li>
	<li>Kjør PCR-produktene på en 1,6% agarose gel ved elektroforese (250 V, 40 min) for å sjekke om de forsterkede DNA-fragmentene er av forventet lengde på 1580 bp.</li>
</ol>4. Mutant bassenginfeksjon på billeegg
<ol><li>Trinn for bibliotekvask<ol>
<li>Tin et aliquot av det forberedte mutantbiblioteket på is. Sentrifuge ved 2683 × g i 10 minutter og fjern supernatanten. Under en steril hette, vask cellene med 4 ml 1x PBS for å fjerne gjenværende medium fra cellene. Resuspend cellene i 4 ml 1x PBS.</li>
		<li>Tell antall celler i en aliquot av biblioteket ved hjelp av et celletellingskammer. Fortynn en del av biblioteket til 2 × 106 celler / μL i 1x PBS.</li>
		<li>Vortex biblioteket aliquot grundig for å blande hele biblioteket homogent før du tar det nødvendige volumet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Egg clutch sterilisering og in vivo infeksjon<ol>
<li>Velg en L. villosa eggkobling. Tell antall egg og fortsett hvis koblingen inneholder mer enn 100 egg.</li>
		<li>Steriliser hele eggkoblingen.<ol>
<li>Tilsett 200 μL 70% etanol og vask eggene forsiktig i 5 min. Fjern etanol og vask eggene to ganger med autoklavert vann.</li>
			<li>Tilsett 200 μL 12% blekemiddel (NaOCl) og vask eggene forsiktig i 30 s. Fjern blekemiddelet umiddelbart og vask eggene igjen tre ganger med 200 μL autoklavert vann.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Infiser 2 × 106 celler/μL av det vaskede mutantbiblioteket på den steriliserte eggkoblingen (2,5 μL per egg).</li>
		<li>To dager etter at de infiserte bille larver luker, samle 1002 nd instar larver per 1,5 ml mikrofugerør og lagre ved -80 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
In vitro mutant bibliotek kontroll<ol>
<li>Under en steril hette inokulerer du 250 μL 2 × 106 celler/μL av det vaskede mutantbiblioteket i 10 ml KB-medium som inneholder kanamycin.</li>
		<li>Inkuber in vitro mutantkulturen ved 30 °C i 20 timer. MERK: Beregn varigheten av inkubasjon for å matche omtrentlig antall generasjoner av WT B. gladioli Lv-StA in vivo under kolonisering.</li>
		<li>Etter 20 h inkubasjon, legg til et likt volum på 70% glyserol til in vitro mutantkulturen og lagre den ved -80 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Infiserte biller og in vitro mutant bibliotek DNA-ekstraksjon
MERK: DNA-ekstraksjoner ble utført ved hjelp av et DNA- og RNA-rensesett i henhold til produsentens protokoll kort skissert nedenfor.
<ol><li>Homogeniser samlede larver (maksimalt 4 mg per mikrofugerør) ved å tilsette 1-2 ml flytende nitrogen og knuse med en pestle.</li>
	<li>Tine in vitro dyrkede mutantkulturer fra glyserolbestander på is. Pellet cellene ved sentrifugering på 9600 × g i 10 minutter før cellelys.</li>
	<li>Tilsett 300 μL vevs- og cellelysoppløsning i in vitro- og in vivo-prøvene. Tilsett 5 μL 10 mg/ml proteinase K, inkuber blandingen ved 60 °C i 15 minutter, og legg deretter på is i 3-5 min.</li>
	<li>Tilsett 150 μL proteinutfellingsreagens til lysates og virvel grundig. Pellet proteinrester ved sentrifugering ved 9600 × g i 10 min.</li>
	<li>Overfør supernatanten til et 1,5 ml mikrofugerør. Tilsett 500 μL isopropanol til supernatanten og inverter rørene forsiktig minst 40 ganger før du inkuberer ved -20 °C i 1 time eller over natten.</li>
	<li>Pellet det utfelte DNA ved sentrifugering på 9600 × g i 10 min. Kast supernatanten og tilsett iskald 70% etanol til DNA-pelletsen.</li>
	<li>Sentrifuge på ≥ 10.000 × g i 5 min. Kast supernatanten og la prøvene lufttørke i minst 1 time.</li>
	<li>Resuspend DNA fra in vitro- og in vivo-prøvene i 100 μL lav-TE-buffer.</li>
	<li>Oppbevar prøvene ved -20 °C.</li>
</ol>6. Klargjøring av sekvenseringsbibliotek
MERK: Protokollen og reagensene for DNA-bibliotekforberedelse er tilpasset og modifisert fra instruksjonene fra produsenten av DNA-bibliotekets forberedelsessett.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62843/62843fig2v3.jpg"> Figur 2: Skjematisk for forberedelsestrinnene for DNA-biblioteket. Etter skjæring og adapterligasjon inkluderer den modifiserte protokollen et streptavidin perlevalgstrinn for å berike DNA-fragmenter som inneholder innsettingskassett. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62843/62843fig2v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<ol><li>Fortynn prøvene til 20 ng/μL konsentrasjon og volum på 100 μL og hold dem på is.</li>
	<li>Skjær in vivo og in vitro prøve DNA ved hjelp av en ultralydator. Sett ultralydatoren på 70% kraft. Virvel prøvene kort og skjær i 1 min 30 s. MERK: Innstillingene for ultralydatoren vil variere mellom instrumenter. I dette tilfellet var fragmentstørrelsen 200-400 bp, som passer for denne sekvenseringsmetoden på 150 bp, parret slutt (se trinn 9.1). Skjæreparametrene kan justeres i henhold til eksperimentets krav.</li>
	<li>Sjekk om DNA-et ble kuttet til ønsket størrelsesområde (i dette tilfellet 200-400 bp). Last 5 μL av det uarkerte og skjærede DNA-et etter blanding med gellastefargestoff i et 1:1-forhold på en 1,6 % agarose gelløp ved 250 V i 40 minutter (Figur 3A,B).</li>
	<li>Klargjøring av fragmentender som kreves for kortligasjon<ol>
<li>Til 50 μL av det skjærede DNA-et, legg til endepreparatets reagenser gitt i bibliotekets forberedelsessett: 3 μL av enzymblandingen og 7 μL reaksjonsbuffer og bland godt ved pipettering. Sett en termisk syklist med oppvarmet lokk ved ≥ 75 °C og inkuber prøvene i 30 min ved 20 °C og 30 min ved 65 °C. Hold ved 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Ligation for kort<ol>
<li>For kortligasjon legger du til følgende reagenser i produktene i sluttforberedelsestrinnet: 30 μL Ligation Master Mix, 1 μL Ligation Enhancer og 2,5 μL fortynnet adapter. Bland grundig ved pipettering og inkuber prøven i 15 min ved 20 °C i termosykleren med det oppvarmede lokket av.</li>
		<li>Etter 15 min, tilsett 3 μL av enzymet (uracil DNA glykosylase + DNA glykosylase-lyase Endonuclease VIII) (se materialtabellen). Bland godt ved pipettering og inkuber prøven i 15 min ved 37 °C i en termisk syklist med lokket oppvarmet ved ≥47 °C. MERK: Protokollen kan settes på pause på dette trinnet, og prøvene kan lagres ved -20 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Størrelsesvalg av kort-ligated DNA-målrettingsfragmenter på 250 bp<ol>
<li>Virvel den magnetiske perleoppløsningen (se materialtabellen) og plasser den ved romtemperatur i 30 minutter før bruk.</li>
		<li>Tilsett 0,3x perler til 96,5 μL av den ligaterte DNA-blandingen og bland ved å pipettere grundig. Inkuber perleblandingen i 5 min. MERK: Tilstedeværelsen av salter og polyetylenglykol i perleblandingen letter utfellingen av DNA-fragmenter på perlene. Et lavt forhold mellom perler og DNA-molekyler fører til binding av bare større DNA-fragmenter til perlene. I dette tilfellet er DNA-fragmenter over 250 bp i lengde bundet til perlene.</li>
		<li>Plasser rørene på et magnetisk stativ for å trekke ned perlene og fjerne DNA-fragmenter av uønsket størrelse. La perlene slå seg ned i 5 min og overfør deretter den klare supernatanten til et nytt mikrofugerør (hold supernatanten).</li>
		<li>Tilsett 0,15x ferske perler til supernatanten og bland ved å pipettere godt. Inkuber perleblandingen i 5 min og plasser deretter rørene på et magnetisk stativ for å trekke ned perlene bundet til målet DNA. Vent i 5 min og kast deretter supernatanten (behold perlene). MERK: Dette forholdet mellom perler og DNA fører til binding av fragmenter av ønsket 250 bp størrelse.</li>
		<li>Med perlene på det magnetiske stativet, tilsett 200 μL 80% etanol (nytilberedt) og vent i 30 s. Pipette ut og kast etanolvasken forsiktig uten å forstyrre perlene på magnetstativet. Gjenta dette trinnet.</li>
		<li>Etter den siste vasken, fjern spor av etanol fra perlene og tørk deretter perlene i 2 min til de virker blanke, men ikke helt tørket ut. Ikke tørk perlene for mye.</li>
		<li>Fjern rørene fra det magnetiske stativet og tilsett 17 μL 10 mM Tris-HCl eller 0,1x TE (Low-TE). Bland ved pipettering ~ 10 ganger og inkuber blandingen ved romtemperatur i 2 min.</li>
		<li>Plasser rørene tilbake på det magnetiske stativet og vent i 5 min. Når perlene har slått seg ned, overfør DNA-supernatanten til et nytt rør.</li>
	</ol></li>
	<li>PCR I for å legge til biotin tag til DNA fragmenter som inneholder innsetting kassetten<ol>
<li>Legg til en biotinylert primer-tag i DNA-fragmentene som inneholder Tn5-innsettingskassett ved hjelp av den transposonspesifikke biotinylerte primeren (tabell 5) og en indeksprimer. Klargjør PCR-hovedmiksen i henhold til tabell 6 og følg PCR-betingelsene for den termiske syklisten som er oppført i tabell 7.</li>
	</ol></li>
	<li>Opprydding av PCR I uten størrelsesvalg<ol>
<li>Vortex 0,9x perler og plasser dem ved romtemperatur i minst 30 minutter før opprydding.</li>
		<li>Tilsett 0,9x perler til PCR-produktene og bland grundig.</li>
		<li>Plasser perlene på et magnetisk stativ for å trekke ned perlene.</li>
		<li>Fjern den klare supernatanten og vask perlebundet DNA med 200 μL nylaget 80% etanol to ganger.</li>
		<li>Fjern etanol etter vasketrinnene og lufttørk perlene til de ser blanke ut, men ikke for tørre.</li>
		<li>Legg til 32 μL med 10 mM Tris-HCl eller 0,1X TE (Low-TE) og inkuber perlene i 5 minutter. Plasser blandingen tilbake på det magnetiske stativet og overfør supernatanten til et friskt mikrofugerør.</li>
	</ol></li>
	<li>Binde biotinylerte DNA-fragmenter til streptavidinperler<ol>
<li>Resuspend 32 μL streptavidin perler i 1x bind-og-vask buffer. Vask perlene med bufferen tre ganger mens de er plassert på et magnetisk stativ.</li>
		<li>Tilsett 32 μL 2x bind-og-vask buffer og resuspend perlene. Til dette legger du til 32 μL av de rensede PCR 1-produktene. Bland grundig og inkuber ved romtemperatur i 30 min.</li>
		<li>Plasser perle-DNA-blandingen på et magnetisk stativ i 2 min. Pipette ut supernatanten som biotinmerket DNA som inneholder innsettingskanten binder seg til streptavidin på perlene.</li>
		<li>Vask perlene med 500 μL 1x bind-og-vask buffer og vask deretter perlene med 200 μL lav-TE. Resuspend de DNA-bundet perler i 17 μL low-TE.</li>
	</ol></li>
	<li>PCR II for å legge til adaptere i fragmentene som inneholder innsettingskassettkanten<ol>
<li>Klargjør en hovedmiks, som vist i Tabell 8, ved hjelp av indeksprimerne og modifiserte universelle PCR-primere som er oppført i tabell 5. Tilsett 15 μL av de DNA-bundne streptavidinperlene fra forrige trinn til PCR-blandingen. Se tabell 7 for varmesyklusforholdene.</li>
	</ol></li>
	<li>Rydd opp i PCR-produktene uten størrelsesvalg som angitt i trinn 6.8 i denne protokollen. Elute de endelige DNA-produktene i 30 μL molekylært vann.</li>
	<li>Oppbevar prøvene ved -20 °C og bruk dem til sekvensering.</li>
</ol>7. Sekvensering og analyse
<ol><li>Sekvenser biblioteket ved hjelp av sekvenseringsteknologi med høy gjennomstrømning. Juster sekvenseringsdybden avhengig av størrelsen på transposonbiblioteket, som nevnt nedenfor. Vurder lesekvaliteten med FastQC7. Velg leseoperasjoner som inneholder Tn5-innsettingskanten på slutten av lese- og innsettingskantsekvensen ved hjelp av Klippadapt8 og/eller Trimmomatic9. MERK: Her ble en pardelt sekvenseringstilnærming brukt til å målrette mot 150 bp per lesing og totalt 8 Mio leser. For å få et representativt datasett må du sørge for at det totale antallet sekvenserte lesinger overskrider maksimalt antall mutanter i biblioteket, det vil si det totale estimerte antallet kolonier fra trinn 2.9. Som referanse var denne protokollen rettet mot 40 ganger maksimal mulig bibliotekstørrelse. Andre vellykkede studier ved hjelp av Tn-seq til lignende formål sekvenserte et totalt antall leseoperasjoner nær 25 ganger det faktiske antallet unike innsettinger i det tilsvarende mutantbiblioteket22,23.</li>
	<li>Tatt i betraktning at mutasjoner i enden av gener ikke er funksjonelt forstyrrende, trim 5% av begge ender av genmerknader av referansegenom GFF-filen. Kartlegg de trimmede lesningene til referansegenomet ved hjelp av Bowtie210.</li>
	<li>Beregn antall innsettinger fra antall unike 5-plasseringer i BAM-justeringsfilen.</li>
	<li>Bruk FeatureCounts11til å hente antall treffgener for hver replikeringsprøve.</li>
	<li>Ved hjelp av DESeq212-pakken i RStudio beregner du forskjellen i mutantoverflod mellom ulike forhold.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cain, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+advances+in+transposon-insertion+sequencing.">A decade of advances in transposon-insertion sequencing.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (9), 526-540 (2020).</li><li>Chao, M. C., Abel, S., Davis, B. M., Waldor, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+design+and+analysis+of+transposon+insertion+sequencing+experiments.">The design and analysis of transposon insertion sequencing experiments.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (2), 119-128 (2016).</li><li>Barquist, L., Boinett, C. J., Cain, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+querying+bacterial+genomes+with+transposon-insertion+sequencing.">Approaches to querying bacterial genomes with transposon-insertion sequencing.</a> RNA Biology. 10 (7), 1161-1169 (2013).</li><li>Fl&#243;rez, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic-producing+symbionts+dynamically+transition+between+plant+pathogenicity+and+insect-defensive+mutualism.">Antibiotic-producing symbionts dynamically transition between plant pathogenicity and insect-defensive mutualism.</a> Nature Communications. 8 (1), 15172 (2017).</li><li>Fl&#243;rez, L. V., Kaltenpoth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbiont+dynamics+and+strain+diversity+in+the+defensive+mutualism+between+Lagria+beetles+and+Burkholderia.">Symbiont dynamics and strain diversity in the defensive mutualism between Lagria beetles and Burkholderia.</a> Environmental Microbiology. 19 (9), 3674-3688 (2017).</li><li>Fl&#243;rez, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antifungal+polyketide+associated+with+horizontally+acquired+genes+supports+symbiont-mediated+defense+in+Lagria+villosa+beetles.">An antifungal polyketide associated with horizontally acquired genes supports symbiont-mediated defense in Lagria villosa beetles.</a> Nature Communications. 9 (1), 2478 (2018).</li><li>. FastQC A quality control tool for high throughput sequence data Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2012)</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+A+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FeatureCounts:+An+efficient+general+purpose+program+for+assigning+sequence+reads+to+genomic+features.">FeatureCounts: An efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features.</a> Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Gayt&#225;n, M. O., Mart&#237;nez-Santos, V. I., Soto, E., Gonz&#225;lez-Pedrajo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+three+secretion+system+in+attaching+and+effacing+pathogens.">Type three secretion system in attaching and effacing pathogens.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 129 (2016).</li><li>Hachani, A., Wood, T. E., Filloux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+VI+secretion+and+anti-host+effectors.">Type VI secretion and anti-host effectors.</a> Current Opinion in Microbiology. 29, 81-93 (2016).</li><li>Deep, A., Chaudhary, U., Gupta, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing+and+bacterial+pathogenicity:+From+molecules+to+disease.">Quorum sensing and bacterial pathogenicity: From molecules to disease.</a> Journal of Laboratory Physicians. 3 (1), 4-11 (2011).</li><li>Silva, A. J., Benitez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+cholerae+biofilms+and+cholera+pathogenesis.">Vibrio cholerae biofilms and cholera pathogenesis.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (2), 0004330 (2016).</li><li>Navarro-Garcia, F., Ruiz-Perez, F., Cataldi, &. #. 1. 9. 3. ;., Larz&#225;bal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+VI+secretion+system+in+pathogenic+Escherichia+coli:+structure,+role+in+virulence,+and+acquisition.">Type VI secretion system in pathogenic Escherichia coli: structure, role in virulence, and acquisition.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1965 (2019).</li><li>Ribet, D., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+bacterial+pathogens+colonize+their+hosts+and+invade+deeper+tissues.">How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues.</a> Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).</li><li>Schwarz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burkholderia+Type+VI+secretion+systems+have+distinct+roles+in+eukaryotic+and+bacterial+cell+interactions.">Burkholderia Type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions.</a> PLoS Pathogens. 6 (8), 1001068 (2010).</li><li>Jones, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kill+and+cure:+genomic+phylogeny+and+bioactivity+of+Burkholderia+gladioli+bacteria+capable+of+pathogenic+and+beneficial+lifestyles.">Kill and cure: genomic phylogeny and bioactivity of Burkholderia gladioli bacteria capable of pathogenic and beneficial lifestyles.</a> Microbial Genomics. 7 (1), 000515 (2021).</li><li>Takeshita, K., Kikuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Riptortuspedestris+and+Burkholderia+symbiont:+an+ideal+model+system+for+insect-microbe+symbiotic+associations.">Riptortuspedestris and Burkholderia symbiont: an ideal model system for insect-microbe symbiotic associations.</a> Research in Microbiology. 168 (3), 175-187 (2017).</li><li>Powell, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+screen+identifies+host+colonization+determinants+in+a+bacterial+gut+symbiont.">Genome-wide screen identifies host colonization determinants in a bacterial gut symbiont.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (48), 13887-13892 (2016).</li><li>Brooks, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+discovery+of+colonization+determinants+in+the+squid+symbiont+Vibrio+fischeri.">Global discovery of colonization determinants in the squid symbiont Vibrio fischeri.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17284-17289 (2014).</li><li>Somprasong, N., McMillan, I., Karkhoff-Schweizer, R. R., Mongkolsuk, S., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+genetic+manipulation+of+Burkholderia+gladioli+pathovar+cocovenenans.">Methods for genetic manipulation of Burkholderia gladioli pathovar cocovenenans.</a> BMC Research Notes. 3 (308), (2010).</li><li>Garcia, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burkholderia+thailandensis:+Genetic+manipulation.">Burkholderia thailandensis: Genetic manipulation.</a> Current Protocols in Microbiology. 45, 1-15 (2017).</li><li>Headd, B., Bradford, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conjugation+window+in+an+Escherichia+coli+K-12+strain+with+an+IncFII+plasmid.">The conjugation window in an Escherichia coli K-12 strain with an IncFII plasmid.</a> Applied and Environmental Microbiology. 86 (17), 00948 (2020).</li><li>Van Opijnen, T., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+insertion+sequencing:+A+new+tool+for+systems-level+analysis+of+microorganisms.">Transposon insertion sequencing: A new tool for systems-level analysis of microorganisms.</a> Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 435-442 (2013).</li><li>Gallagher, L. A., Ramage, E., Patrapuvich, R., Weiss, E., Brittnacher, M., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-defined+transposon+mutant+library+of+Burkholderia+thailandensis.">Sequence-defined transposon mutant library of Burkholderia thailandensis.</a> mBio. 4 (6), 00604-00613 (2013).</li><li>Wong, Y. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candidate+essential+genes+in+Burkholderia+cenocepacia+J2315+identified+by+genome-wide+TraDIS.">Candidate essential genes in Burkholderia cenocepacia J2315 identified by genome-wide TraDIS.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1288 (2016).</li><li>Moule, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+saturation+mutagenesis+of+Burkholderia+pseudomallei+K96243+predicts+essential+genes+and+novel+targets+for+antimicrobial+development.">Genome-wide saturation mutagenesis of Burkholderia pseudomallei K96243 predicts essential genes and novel targets for antimicrobial development.</a> mBio. 5 (1), 00926 (2014).</li><li>Ding, Q., Tan, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Himar1+transposon+for+efficient+random+mutagenesis+in+Aggregatibacter+actinomycetemcomitans.">Himar1 transposon for efficient random mutagenesis in Aggregatibacter actinomycetemcomitans.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1842 (2017).</li><li>Green, B., Bouchier, C., Fairhead, C., Craig, N. L., Cormack, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+site+preference+of+Mu,+Tn5,+and+Tn7+transposons.">Insertion site preference of Mu, Tn5, and Tn7 transposons.</a> Mobile DNA. 3, 3 (2012).</li><li>Lodge, J. K., Weston-Hafer, K., Berg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+Tn5+target+specificity:+Preference+for+insertion+at+G/C+pairs.">Transposon Tn5 target specificity: Preference for insertion at G/C pairs.</a> Genetics. 120 (3), 645-650 (1988).</li><li>Ar&#225; Ujo, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequencing+and+transposon+mutagenesis+of+Burkholderia+seminalis+TC3.4.2R3+identify+genes+contributing+to+suppression+of+orchid+necrosis+caused+by+B.+gladioli.">Genome sequencing and transposon mutagenesis of Burkholderia seminalis TC3.4.2R3 identify genes contributing to suppression of orchid necrosis caused by B. gladioli.</a> Molecular Plant-microbe Interactions: MPMI. 29 (6), 435-446 (2016).</li><li>Dobritsa, A. P., Samadpour, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reclassification+of+Burkholderiainsecticola+as+Caballeroniainsecticola+comb.+nov.+and+reliability+of+conserved+signature+indels+as+molecular+synapomorphies.">Reclassification of Burkholderiainsecticola as Caballeroniainsecticola comb. nov. and reliability of conserved signature indels as molecular synapomorphies.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 69 (7), 2057-2063 (2019).</li><li>Ohbayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect's+intestinal+organ+for+symbiont+sorting.">Insect's intestinal organ for symbiont sorting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 5179-5188 (2015).</li><li>Ross, C., Scherlach, K., Kloss, F., Hertweck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+conjugated+polyyne+biosynthesis+in+phytopathogenic+bacteria.">The molecular basis of conjugated polyyne biosynthesis in phytopathogenic bacteria.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (30), 7794-7798 (2014).</li><li>Atkins, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutant+of+Burkholderia+pseudomallei,+auxotrophic+in+the+branched+chain+amino+acid+biosynthetic+pathway,+is+attenuated+and+protective+in+a+murine+model+of+melioidosis.">A mutant of Burkholderia pseudomallei, auxotrophic in the branched chain amino acid biosynthetic pathway, is attenuated and protective in a murine model of melioidosis.</a> Infection and Immunity. 70 (9), 5290-5294 (2002).</li></ol>

Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikt knyttet til studien.

Et B. gladioli transposon mutantbibliotek ble generert for å identifisere viktige vertskoloniseringsfaktorer i det symbiotiske samspillet mellom L. villosa beetles og B. gladioli bakterier. De viktigste trinnene i protokollen var konjugering, vertsinfeksjon, DNA-bibliotekforberedelse og sekvensering.
Så mange stammer av Burkholderia er egnet til genetisk modifikasjon ved konjugering24,25, plasmid bærer transposon og antibiotika innsetting kassetter ble konjugert vellykket inn i målet B. gladioli Lv-StA stamme fra E. coli. Tidligere forsøk på transformasjon ved elektroporasjon ga svært lav til nesten ingen B. gladioli transformanter. Det anbefales å optimalisere transformasjonsteknikken for målorganismen for effektivt å gi et stort antall transformanter.
En runde med konjugering og 40 konjugeringsflekker forstyrret 3736 gener i B. gladioli Lv-StA. I ettertid vil flere runder med konjugering være nødvendig for å forstyrre de fleste av de 7468 genene og få et mettet bibliotek. Spesielt var inkubasjonstiden under konjugering ikke tillatt å overstige 12-18 timer, som er slutten på den eksponentielle vekstfasen av B. gladioli. Å tillate konjugering utover den eksponentielle vekstfasen av bakterieceller reduserer sjansene for suksess for å oppnå transkonjugerendemidler 26. Derfor bør konjugeringsperioden justeres i henhold til veksten av bakteriearter.
For å kunne utføre et eksperiment som involverer infeksjon av mutantbiblioteker i en vert, er det viktig å vurdere bakteriell populasjonsflaskehalsstørrelse under kolonisering og mangfoldet av mutanter i biblioteket før infeksjon1,2,27. Som forberedelse til eksperimentet estimerte vi det minste antall biller som må være smittet for å ha stor sjanse for at hver mutant i biblioteket blir samplet og tillatt å kolonisere. Den omtrentlige in vivo bakterielle generasjonstiden og antall generasjoner i løpet av eksperimentet ble også beregnet. In vitrokulturen ble deretter vokst opp til et sammenlignbart antall generasjoner ved å justere inkubasjonstiden. For et lignende infeksjonseksperiment i andre ikke-modellverter er evnen til å opprettholde en laboratoriekultur og en konstant kilde til vertsorganismer ønskelig.
Etter veksten av mutantbiblioteket in vivo og in vitro og prøvesamling, ble det utført en modifisert DNA-bibliotekforberedelsesprotokoll for transposoninnsettingssekvensering. Modifikasjonen i protokollen innebar å designe tilpassede PCR-primere og legge til PCR-trinn for å velge for DNA-fragmenter som inneholder innsettingskassett. Fordi protokollen ble tilpasset, økte flere PCR-sykluser i protokollen risikoen for overamplifisering og henting av hybridiserte kortkortfragmenter i sluttbibliotekene. Derfor anbefales et siste oppryddingstrinn (uten størrelsesvalg) etter at de to PCR-ene er anbefalt, da det hjelper med å fjerne disse fragmentene. Størrelsesfordelingen til DNA-bibliotekene var fortsatt bredere enn forventet. Økt sekvenseringsdybde ga imidlertid tilstrekkelige data som ble filtrert under bioinformatikkanalyse, og fikk tilfredsstillende resultater.
Ettersom transposonmediert mutagenese genererer tusenvis av tilfeldige innsettinger i et enkelt eksperiment, er det mulig å generere et mettet bibliotek med mutanter som inneholder alle unntatt de mutantene der gener som er avgjørende for bakterievekst har blitt forstyrret. Vi jobbet mest sannsynlig ikke med et mettet mutantbibliotek, gitt beregninger av essensielle gener i andre studier på Burkholderia sp. 28,29. Et ikke-mettet bibliotek hjelper likevel med å utforske ulike kandidatgener for videre studier ved hjelp av målrettet mutagenese. Før forsøkene er det også viktig å huske at noen transposoner har spesifikke innsettingsmålsteder som øker overflod av mutanter på visse loci i genomet30. Mariner-transposoner er kjent for å være rettet mot AT-områder for innsettingav 31, og Tn5-transposoner har en GC-bias32,33. Inkludert trinn under bioinformatikkanalyse for å gjenkjenne hotspots for transposoninnsettinger vil bidra til å vurdere eventuelle distribusjonsbias.
Selv om det er utsatt for tilbakeslag, kan et godt designet sekvenseringseksperiment for transposoninnsetting være et kraftig verktøy for å identifisere mange betinget viktige gener i bakterier i et enkelt eksperiment. For eksempel ble et dusin gener i Burkholderia seminalis viktig for undertrykkelse av orkidébladnekrose identifisert ved å kombinere transposonmutagenese og genomikk34. Utover Burkholderiahar flere adhesjons- og motilitetsgener og transportører blitt identifisert som viktige koloniseringsfaktorer i Snodgrassella alvi symbionter av Apis mellifera (Honeybee)22, og i Vibrio fischerii symbionter av Euprymna scolopes (Hawaiian bobtail blekksprut)23 ved hjelp av transposon-innsetting mutagenesis tilnærming.
Som en alternativ tilnærming kan transposonmutagenese etterfølges av screening for individuelle mutanter som bruker selektive medier i stedet for sekvensering. Fenotypisk screening eller bioassays for å identifisere mangler, for eksempel motilitet, produksjon av bioaktive sekundære metabolitter, eller spesifikke auxotrofier, er gjennomførbare. For eksempel har screening av en Burkholderia insekticola (omplassert til slekten Caballeronia35) transposon mutantbibliotek vært nøkkelen til å identifisere at symbiontene bruker motilitetsgener for kolonisering av Riptortus pedestris, deres insektvert36. Videre, ved hjelp av transposonmutagenese og fenotypisk screening, ble den biosyntetiske genklyngen for den bioaktive sekundære metabolittkaryoynencin identifisert i Burkholderia caryophylli37. En auxotrofisk mutant av Burkholderia pseudomallei ble identifisert etter transposonmutagenese og screening og er en mulig svekket vaksinekandidat mot melioidose, en farlig sykdom hos mennesker og dyr38. Dermed er transposonmutagenese og sekvensering en verdifull tilnærming til å studere molekylære egenskaper av bakterier som er viktige for interaksjonene med sine respektive verter i patogene eller gjensidige foreninger.

Burkholderia gladioli kan engasjere seg i en symbiotisk tilknytning til Lagria villosa beetles, spiller en viktig rolle i forsvar mot mikrobielle antagonister av insektverten4,5,6. Kvinnelige biller huser flere stammer av B. gladioli i spesialisert kjertler tilbehør til reproduktive systemet. Ved egglegging smører kvinner B. gladioliceller på eggoverflaten der antimikrobielle forbindelser produsert av B. gladioli hemmer infeksjoner ved entomopathogene sopp4,6. Under sen embryonal utvikling eller tidlig etter at larvene klekkes, koloniserer bakteriene kutikulære invaginasjoner på larvens dorsale overflate. Til tross for denne spesialiserte lokaliserings- og vertikale overføringsruten til symbiontene, kan L. villosa antagelig også skaffe seg B. gladioli horisontalt fra miljøet4. Videre er det funnet minst tre stammer av B. gladioli i forbindelse med L. villosa4,6. Blant disse er B. gladioli Lv-StA den eneste som er egnet til dyrking in vitro.
B. gladioli Lv-StA har en genomstørrelse på 8,56 Mb6 og inneholder 7468 gener. Hvilke av disse genene er viktige for B. gladiolibakterier for å kolonisere billeverten? For å svare på dette spørsmålet brukte vi sekvensering av transposoninnsetting (Tn-seq), en utforskende metode for å identifisere betinget essensielle mikrobielle gener1,2,3. Et mutantbibliotek av B. gladioli Lv-StA ble opprettet ved hjelp av en Tn5 transposon. Gjennom konjugering fra Escherichia coli donorceller til B. gladioli Lv-StA ble en pRL27-plasmid som bærer Tn5-transposonen og en antibiotikaresistenskassett flankert av inverterte repetisjoner overført (figur 1). Dermed ble det generert et sett med mutanter som individuelt bærer forstyrrelser av 3736 symbiontgener (figur 2).
Mutantbassenget ble smittet på billeegg for å identifisere koloniseringsfaktorene, og som en kontroll ble det også dyrket in vitro i King's B (KB) medium. Etter å ha tillatt tilstrekkelig tid til kolonisering, ble klekkede larver samlet og samlet for DNA-ekstraksjon. Fragmenter av DNA som inneholder transposoninnsatsen og den flankende genomiske regionen B. gladioli Lv-StA ble valgt ved hjelp av en modifisert DNA-bibliotekforberedelsesprotokoll for sekvensering. Les kvalitetsbehandling etterfulgt av analyse med DESeq2 ble utført for å identifisere spesifikke gener som er avgjørende for B. gladioli Lv-StA for å kolonisere L. villosa larver når de overføres via eggoverflaten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,6- Diaminopimelic Acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B22391</td>
			<td>For E.coli WM3064+ pRL27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar - Agar</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure beads XP (magentic beads + polyethylene glycol + salts)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td>Size selection in step 6.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach (NaOCl) 12%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie2 v.2.4.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinfromatic tool for read mapping. Reference 10 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer-S</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>PEQL01-1020</td>
			<td>For PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutadapt v.2.10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatic tool for removing specific adapter sequences from the reads. Reference 8 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DESeq2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RStudio package for assessing differential mutant abundance. Usually used for RNAseq analysis. Reference 12 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder 100 bp</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T834.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>R0182</td>
			<td>PCR for confirming success of conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Di-Sodium salt</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epicentre MasterPure Complete DNA and RNA Purification Kit</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>MC85200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2218.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastQC v.0.11.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatic tool for assessing the quality of sequencing data. Reference 7 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeatureCounts v.2.0.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatic tool to obtain read counts per genomic feature. Reference 11 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>7530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Serva</td>
			<td>26899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>4936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td>Roth</td>
			<td>PO27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index primers set 1)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7335S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7645S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone (soybean)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2365</td>
			<td>For Burkholderia gladioli Lv-StA KB-medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peqGOLD &#39;Hot&#39; Taq- DNA Polymerase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PEQL01-1020</td>
			<td>PCR for confirming success of conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates - 145 x 20 mm</td>
			<td>Roth</td>
			<td>XH90.1</td>
			<td>For selecting transconjugants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates - 90 x 16 mm</td>
			<td>Roth</td>
			<td>N221.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiaxcel (StarSEQ GmbH, Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Quality check after DNA library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin beads</td>
			<td>Roth</td>
			<td>HP57.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>01-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic v.0.36</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatic tool for trimming low quality reads and also adapter sequences. Reference 9 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris -HCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9090.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2366</td>
			<td>For Escherichia coli WM3064+pRL27 LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td>Bandelin</td>
			<td>GM 70 HD</td>
			<td>For shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER enzyme (uracil DNA glycosylase + DNA glycosylase- lyase Endonuclease VIII)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7645S</td>
			<td>Ligation step 6.5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2363</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transposon-insertion sequencing as a tool to elucidate bacterial colonization factors in a burkholderia gladioli symbiont of lagria villosa beetles

Å utlede geners funksjon ved å manipulere deres aktivitet er et viktig verktøy for å forstå de genetiske understøttelsene av de fleste biologiske prosesser. Fremskritt innen molekylær mikrobiologi har sett fremveksten av ulike mutageneseteknikker for manipulering av gener. Blant dem er transposon-innsetting sekvensering (Tn-seq) et verdifullt verktøy for samtidig å vurdere funksjonaliteten til mange kandidatgener på en umålt måte. Teknikken har vært nøkkelen til å identifisere molekylære mekanismer for kolonisering av eukaryote verter i flere patogene mikrober og noen få gunstige symbionter.
Her er Tn-seq etablert som en metode for å identifisere koloniseringsfaktorer i en gjensidig Burkholderia gladioli symbiont av boblen Lagria villosa. Ved konjugering utføres Tn5 transposonmediert innsetting av en antibiotikaresistenskassett på tilfeldige genomiske steder i B. gladioli. For å identifisere effekten av genforstyrrelser på bakterienes evne til å kolonisere billeverten, blir det genererte B. gladioli transposonmutantbiblioteket inokulert på billeeggene, mens en kontroll vokser in vitro i et flytende kulturmedium. Etter å ha tillatt tilstrekkelig tid til kolonisering, blir DNA hentet fra in vivo og in vitro dyrkede biblioteker. Etter en DNA-biblioteksforberedelsesprotokoll er DNA-prøvene forberedt for sekvensering av transposoninnsetting. DNA-fragmenter som inneholder transposon-innsatskanten og flankebakterielle DNA velges, og mutasjonsstedene bestemmes ved å sekvensere bort fra transposon-innsatskanten. Til slutt, ved å analysere og sammenligne frekvensene til hver mutant mellom in vivo- og in vitro-bibliotekene, kan viktigheten av spesifikke symbiontgener under billekolonisering forutsies.

Vertsrelaterte bakterier kan bruke flere faktorer for å etablere en forening, inkludert de som formidler vedheft, motilitet, chemotaxis, stressresponser eller spesifikke transportører. Mens faktorer som er viktige for patogen-vert interaksjoner har blitt rapportert for flere bakterier13,14,15,16,17,18, inkludert medlemmer av slekten Burkholderia19,20, færre studier har utforsket molekylære mekanismer som brukes av gunstige symbionter for kolonisering21,22,23 . Ved hjelp av transposoninnsettingssekvensering var målet å identifisere molekylære faktorer som gjør det mulig for B. gladioli å kolonisere L. villosa beetles.
Transposonmediert mutagenese ble utført ved hjelp av pRL27-plasmiden, som bærer en Tn5-transposon og en kanamycinmotstandskassett flankert av inverterte repetisjonssteder. Plasmid ble introdusert i målet B. gladioli Lv-StA celler ved konjugering med plasmid donor E. coli WM3064 stamme (som vist i figur 1). Etter konjugering ble konjugeringsblandingen som inneholder B. gladiolimottaker og E. coli donorceller belagt på selektive agarplater som inneholder kanamycin. Fraværet av DAP på platene eliminerte donoren E. coli-celler, og tilstedeværelsen av kanamycin valgt for vellykkede B. gladioli Lv-StA transkonjuganter. Det samlede B. gladioli Lv-StA mutantbiblioteket hentet fra høsting av de 100 000 transkonjugante koloniene ble utarbeidet for sekvensering ved hjelp av et modifisert DNA-bibliotekforberedelsessett og tilpassede primere. Figur 2 fremhever forberedelsestrinnene for DNA-biblioteket. Sekvensering ga 4 Mio parvise avlesninger; 3736 gener av 7468 gener i B. gladioli Lv-StA ble forstyrret.
For å identifisere mutanter som var koloniserings-defekte i verten, ble B. gladioli Lv-StA mutantbibliotek smittet på billeeggene og vokst in vitro i KB-medium som kontroll. Den in vivo kolonisering flaskehalsen størrelse ble beregnet før eksperimentet. Et kjent antall B. gladioli Lv-StA-celler ble smittet på billeegg, og antall koloniseringsceller i nyutviklede første instar larver ble oppnådd ved å plating en suspensjon fra hver larve og telle kolonidannende enheter per person. Disse beregningene ble gjort for å sikre at antall koloniseringsceller er nok til å vurdere hele eller en høy prosentandel av mutantene i biblioteket for deres evne til å kolonisere verten. I tillegg ble veksttiden mellom in vitro og in vivo-forhold normalisert basert på antall bakterielle generasjoner for å gjøre disse prøvene sammenlignbare.
Etter at eggene klekket ut, ble 1296 larver samlet i 13 bassenger. De tilsvarende in vitro mutantkulturene ble dyrket og lagret som glyserolbestander. DNA fra in vivo og in vitro dyrkede mutantbiblioteker ble ekstrahert og fragmentert i en ultralydator. Figur 3 viser størrelsesfordelingen til det skjærede DNA-et, der de fleste fragmentene strekker seg mellom 100 og 400 bp, som forventet. Dette trinnet ble etterfulgt av den modifiserte DNA-bibliotekets forberedelsesprotokoll for sekvensering. På hvert trinn i protokollen ble konsentrasjonen av gjenværende DNA kontrollert for å sikre at trinnene ble utført riktig og for å spore tap av DNA. En kvalitetskontroll (se materialtabellen) før sekvensering viste at DNA-bibliotekene inneholdt uventet store (>800 bp) DNA-fragmenter, og dette ble tydeligere i in vivo-bibliotekene. Gitt vanskeligheten med å optimalisere klyngen av fragmenter i sekvenseringsbanene, var det nødvendig å øke sekvenseringsdybden til 10 Mio-parvise lesninger i in vivo-bibliotekene for å oppnå ønsket antall lesninger. Analysen av sekvenseringsresultatene viste at i gjennomsnitt 4 Mio leser i in vivo-bibliotekene og 3,1 Mio leser i in vitro-bibliotekene inneholdt Transposon-kanten i 5' enden av Read-1 (Tabell 9), som var tilfredsstillende for dette eksperimentet. Fordelingen av de 24 224 unike innsettingene over B. gladioligenomet i det opprinnelige biblioteket er vist i figur 4. En analyse utført ved hjelp av DESeq2 viste at overflod av 271 mutanter var betydelig forskjellig mellom in vivo- og in vitro-forholdene. 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62843/62843fig03.jpg"> Figur 3: Agarose geler av mutant og DNA biblioteker. (A) Agarose gel med uarkert DNA av en mutant i lane x og en 1 kbp stige for skala. (B) Gel med kuttet DNA-bibliotek. Båndstørrelsene på stigen i den første banen er angitt på venstre side. De tre første banene a, b og c inneholder skjærede DNA-fragmenter av in vivo-bibliotekene . Lanes d, e, f og g inneholder skjærede DNA-fragmenter av in vitro-bibliotekene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62843/62843fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62843/62843fig04.jpg"> Figur 4: Plassering av unike innsettingssteder i det opprinnelige biblioteket på tvers av de fire replikonene i Burkholderia gladioli Lv-StA-genomet. Hver stolpe langs x-aksen er plassert på et innsettingssted. Høyden på en stolpe langs y-aksen tilsvarer antall leseoperasjoner som er knyttet til området. Legg merke til at de to kromosomene og to plasmider vises i full lengde og dermed har forskjellige skalaer på x-aksen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62843/62843fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Kongens B medium / agar</td>
		</tr>
<tr>
<td>Peptone (soyabønner)</td>
			<td>20 g/l</td>
		</tr>
<tr>
<td>K2HPO4
</td>
			<td>1,5 g/l</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4,7H2O</td>
			<td>1,5 g/l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Agar</td>
			<td>15 g/l</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Oppløst i destillert vann</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">LB medium/agar</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tryptone</td>
			<td>10 g/l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gjærekstrakt</td>
			<td>5 g/l</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>10 g/l</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Oppløst i destillert vann</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Mediekomponenter.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nei.</td>
			<td>Primere</td>
			<td colspan="2">Sekvens</td>
			<td>PCR glødende temperatur (°C)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>tpnRL17–1RC</td>
			<td colspan="2">5'-CGTTACATCCCTGGCTTGTT-3'</td>
			<td rowspan="2">58.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>tpnRL13–2RC</td>
			<td colspan="2">5'-TCGTGAAGAAGGTGTGCTG-3'</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: Primere for å bekrefte suksessen med konjugering.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Komponent</td>
			<td>Volum (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HPLC-renset vann</td>
			<td>4.92</td>
		</tr>
<tr>
<td>Buffer S med 10x (høy spesifisitet)</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2 (25 mM)</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTPer (2 mM)</td>
			<td>1.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer 1 (10 pmol/μL)</td>
			<td>0.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer 2 (10 pmol/μL)</td>
			<td>0.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Taq (5 U/μL)</td>
			<td>0.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mastermix totalt</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mal</td>
			<td>1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 3: PCR-hovedmiks for å bekrefte suksessen med konjugering. Forkortelser: HPLC = høy ytelse flytende kromatografi; dNTPs = deoksynukleoside triphosfat.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Trinn</td>
			<td>Temperatur °C</td>
			<td>Tid</td>
			<td>Sykluser</td>
		</tr>
<tr>
<td>Innledende denaturering</td>
			<td>95</td>
			<td>3 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Denaturering</td>
			<td>95</td>
			<td>40 s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Annealing</td>
			<td>58.2</td>
			<td>40 s</td>
			<td>30 til 35</td>
		</tr>
<tr>
<td>Forlengelse</td>
			<td>72</td>
			<td>1-2 min</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Endelig utvidelse</td>
			<td>72</td>
			<td>4 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Holde</td>
			<td>4</td>
			<td colspan="2">∞</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 4: PCR-betingelser for å bekrefte suksessen til konjugering.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Primere</td>
			<td colspan="2">Sekvens</td>
			<td>Tm °C</td>
			<td>Bruk</td>
			<td>Kilde</td>
		</tr>
<tr>
<td>Transposonspesifikk biotinylert primer</td>
			<td colspan="2">5'-Biotin-ACAGGAACACTTAACGGCTGACATG -3'</td>
			<td>63.5</td>
			<td>6.7.1. PCR I</td>
			<td>Skikk</td>
		</tr>
<tr>
<td>Endret universal PCR-primer</td>
			<td colspan="2">5'- AATGATACGGCGACCACCGAGATC TACACTCTTTCCCTACACGACGCTC TTCCGATCTGAATTCATCGATGAT GGTTGAGATGTGT – 3'</td>
			<td>62</td>
			<td>6.10.1. PCR II</td>
			<td>Skikk</td>
		</tr>
<tr>
<td>Indekser primer</td>
			<td colspan="3">Se produsentens bruksanvisning</td>
			<td>6.7.1. PCR I &6.10.1. PCR II</td>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Indeksprimere satt 1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Adapter</td>
			<td colspan="3">Se produsentens bruksanvisning</td>
			<td>6.5. Kort ligation</td>
			<td>NEBNext Ultra II DNA-bibliotek prep kit for Illumina</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 5: Primere og adapter for PCR I og II under forberedelse av DNA-biblioteket. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>PCR-blanding</td>
			<td>(μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Adapter-ligaterte DNA-fragmenter</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>NEBNext Ultra II Q5 master mix</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Indeksprimer (10 pmol/ μL)</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Transposonspesifikk biotinylert primer (10 pmol/μL)</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totalt volum</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 6: FORBEREDELSE AV DNA-bibliotek-PCR I master mix.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Trinn</td>
			<td>Temperatur</td>
			<td>Tid</td>
			<td>Sykluser</td>
		</tr>
<tr>
<td>Innledende denaturering</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>30 s</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Denaturering</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>10 s</td>
			<td rowspan="3">6 til 12</td>
		</tr>
<tr>
<td>Annealing</td>
			<td>65 °C</td>
			<td>30 s</td>
		</tr>
<tr>
<td>Forlengelse</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>30 s</td>
		</tr>
<tr>
<td>Endelig utvidelse</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>2 min.</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Holde</td>
			<td>16 °C</td>
			<td colspan="2">∞</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 7: DNA-bibliotekforberedelse-PCR I og II forhold.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>PCR-blanding</td>
			<td>(μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Perlevalgt DNA</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>NEBNext Ultra II Q5 master mix</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Indekser primer</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Modifisert universell PCR primer</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totalt volum</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 8: DNA-bibliotekforberedelse-PCR II master mix.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Biblioteker</td>
			<td>Invivo-1</td>
			<td>Invivo-2</td>
			<td>Invivo-3</td>
			<td>Invitro-1</td>
			<td>Invitro-2</td>
			<td>Invitro-3</td>
			<td>Opprinnelig bibliotek</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Nei. lesing (PE)</td>
			<td>56,57,710</td>
			<td>39,19,051</td>
			<td>30,65,849</td>
			<td>35,73,494</td>
			<td>28,83,440</td>
			<td>36,61,956</td>
			<td>46,09,410</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Nei. av avlesninger som inneholder Tn – kant på 5' slutten av Read-1</td>
			<td>54,15,880</td>
			<td>37,31,169</td>
			<td>29,36,247</td>
			<td>33,00,499</td>
			<td>27,35,705</td>
			<td>33,50,402</td>
			<td>41,53,270</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Samlet justeringshastighet for Bowtie2 (%) (bare lese-1)</td>
			<td>95.53%</td>
			<td>83.71%</td>
			<td>89.87%</td>
			<td>80.79%</td>
			<td>78.00%</td>
			<td>73.06%</td>
			<td>74.92%</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Antall unike innsettinger</td>
			<td>8,539</td>
			<td>4,134</td>
			<td>7,183</td>
			<td>18,930</td>
			<td>18,421</td>
			<td>20,438</td>
			<td>24,224</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Antall gener rammet</td>
			<td>1575</td>
			<td>993</td>
			<td>1450</td>
			<td>2793</td>
			<td>2597</td>
			<td>3037</td>
			<td>3736</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 9: Oppsummering av sekvenseringsutgang og transposoninnsettingsfrekvens per bibliotek. Forkortelse: PE = parvis slutt.

Watch this Scientific Journal Video about Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles at JoVE.co

Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles

Dette er en tilpasset metode for å identifisere kandidatens insektkoloniseringsfaktorer i en Burkholderia gunstig symbiont. Billeverten er infisert med et tilfeldig mutantbibliotek generert via transposonmutagenese, og bibliotekets kompleksitet etter kolonisering sammenlignes med en kontroll dyrket in vitro.

Transposoninnsetting Sekvensering som et verktøy for å belyse bakteriekoloniseringsfaktorer i en Burkholderia gladioli Symbiont av Lagria villosa Beetles

Inferring the function of genes by manipulating their activity is an essential tool for understanding the genetic underpinnings of most biological ...

Denne protokollen er nyttig for å utføre genetisk manipulasjon på symbiotiske bakterier, i dette tilfellet spesielt på Burkholderia, og identifisere genene som er avgjørende for å kolonisere en insektvert. Transposoninnsettingssekvensering er et kraftig verktøy for å identifisere et stort antall betinget essensielle gener samtidig i et enkelt eksperiment. Begynn med å inokulere en fersk donorkultur av E.coli donor i 10 milliliter LB medium supplert med Kanamycin og DAP under en steril hette.Inokuler Burkholderia gladiolistamme En mottakerceller i fem milliliter KB medium. Inkuber kulturene ved 30 grader Celsius over natten på en shaker ved 250 RPM. Etter nattvekst, sentrifuger fire milliliter av hver av kulturene på 9600 ganger G i seks minutter for å pellet cellene og kaste bort supernatanten.Under en steril hette, vask pelleted cellekulturer i KB medium som inneholder DAP. Og til slutt, resuspend kulturer separat i fire milliliter av KB pluss DAP medium. Bland 250 mikroliter av de vaskede E.coli-donorcellene i et friskt 15 milliliterrør med en milliliter av den vaskede Burkholderia gladiolistammen A mottakerceller.Spot 10 mikroliter av denne konjugering celle blanding på KB agar plater som inneholder DAP. La platen hvile uforstyrret i den sterile hetten ved romtemperatur i en time. Inkuber platene med konjugeringsstedene ved 30 grader Celsius i 12 til 18 timer.Etter inkubasjon, legg til to til fire milliliter 1X PBS på platene under en steril hette og bruk en celleskraper for å frigjøre de dyrkede bakterielle konjugeringsflekkene fra agaren. Rør deretter den konjugerte celleblandingen i to milliliter mikrofunksjonsrør. Pellet cellene ved sentrifugering ved 9600 ganger G i to minutter.Kast supernatanten og vask pellet to ganger i en milliliter 1X PBS ved å pipettere opp og ned. Resuspend den endelige pellet i 1200 mikroliter av 1X PBS. Bland godt og spred 100 mikroliter av celleblandingen på store KB agarplater supplert med Kanamycin og inkuber ved 30 grader Celsius over natten.Tell det totale antallet transkonjugante kolonier på de tre platene og ekstrapoler for å beregne omtrentlig antall mutanter oppnådd i alle platene. For å øke sjansene for å få et representativt bibliotek, sørg for at det totale antallet kolonier er flere ganger høyere enn det totale antall gener i genomet. For å bekrefte suksessen til konjugasjonen, utfør en PCR rettet mot innsettingskassett ved hjelp av 10 til 20 prøvekolonier som beskrevet i manuskriptet.Under en steril hette skraper du koloniene fra platene ved å legge til en til to milliliter 1X PBS på agaren. Slå sammen celleblandingen som skrapes av platene til 50 milliliterrør. Vortex biblioteket for å blande grundig, og deretter dele en milliliter av det samlede mutantbiblioteket i flere kryorør.Tilsett en milliliter 70% glyserol til rørene og lagre på minus 80 grader Celsius. Velg en L.villosa eggkobling og tell antall egg som fortsetter hvis koblingen inneholder mer enn 100 egg. For å sterilisere hele eggkoblingen, tilsett 200 mikroliter 70% etanol og vask eggene forsiktig i fem minutter, fjern deretter etanol og vask eggene to ganger med autoklavert vann.Tilsett 200 mikroliter 12% blekemiddel og vask eggene forsiktig i 30 sekunder. Fjern blekemiddelet umiddelbart og vask eggene igjen tre ganger med 200 mikroliter autoklavert vann. Infiser eggene i den steriliserte eggkoblingen ved hjelp av to ganger 10 til de seks cellene per mikroliter av det vaskede mutantbiblioteket i PBS.To dager etter at de infiserte bille larver luker, samle 100 andre instar larver per 1,5 milliliter mikrofuge rør og lagre på minus 80 grader Celsius. For å generere in vitro-kontrollbiblioteket inokulerer du 250 mikrolitere på to ganger 10 til de seks cellene per mikroliter i mutantbiblioteket i 10 milliliter KB-medium som inneholder Kanamycin. Etter å ha hentet DNA fra in vivo og in vitro voksne mutantbiblioteker, del DNA med en ultralydator.For å sjekke om DNA-et ble kuttet til ønsket størrelsesområde, last fem mikrolitere av det uarkerte og skjærede DNA etter blanding med gellastefargestoff i et en-til-en-forhold på en 1,6% agarose gelløp ved 250 volt i 40 minutter. For å forberede fragmentendene som kreves for adapterligasjon, start med å legge til tre mikroliter av enzymblandingen og syv mikroliter reaksjonsbuffer til 50 mikroliter av det skjærede DNA-et og bland godt ved pipettering. Sett en termocycler med oppvarmet lokk på større enn eller lik 75 grader Celsius og inkuber prøvene i 30 minutter ved 20 grader Celsius og 30 minutter ved 65 grader Celsius, og hold deretter temperaturen på fire grader Celsius.For adapterligasjon, tilsett 30 mikroliter ligasjonsmasterblanding, en mikroliter ligasjonsforsterker og 2,5 mikroliter fortynnet adapter til produktene i sluttforberedelsestrinnet. Bland grundig ved pipettering og inkuber prøven i 15 minutter ved 20 grader Celsius i termosykleren med det oppvarmede lokket av. Etter 15 minutter, tilsett tre mikroliter av enzymet.Bland godt ved pipettering og inkuber prøven i 15 minutter ved 37 grader Celsius i en termosykler med lokket oppvarmet ved større enn eller lik 47 grader Celsius. For å velge størrelsen på adapterligaerte DNA-målrettingsfragmenter på 250 basepar, start med å virvelere den magnetiske perleløsningen og plasser den ved romtemperatur i 30 minutter før bruk. Tilsett 0,3 ganger perler til 96,5 mikroliter av den ligaterte DNA-blandingen og bland ved å pipettere grundig.Inkuber perleblandingen i fem minutter. Plasser rørene på et magnetisk stativ for å trekke ned perlene og fjerne DNA-fragmenter av uønsket størrelse. La perlene slå seg ned i fem minutter og overfør deretter den klare supernatanten til et nytt mikrofugerør.Tilsett 0,15 ganger friske perler til supernatanten og bland ved å pipettere godt. Inkuber perleblandingen i fem minutter, og plasser deretter rørene på et magnetisk stativ for å trekke ned perlene bundet til mål-DNA-et. Vent i fem minutter og kast deretter supernatanten, og hold perlene.Med perlene på det magnetiske stativet, tilsett 200 mikroliter nytilberedt 80% etanol og vent i 30 sekunder før du kaster etanol uten å forstyrre perlene. Fjern rørene fra stativet og tilsett 17 mikroliter 0,1X TE eller Low TE, bland deretter ved pipettering 10 ganger og inkuber blandingen ved romtemperatur i to minutter. Plasser røret på det magnetiske stativet og ta 15 mikroliter av det størrelsesvalgte DNA-et for PCR-1.Vortex streptavidin perler og plasser dem ved romtemperatur i minst 30 minutter. Ta 32 mikroliter perler av perlene og vask dem med 500 mikroliter 1X bind og vask buffer. Tilsett 32 mikroliter 2X bind og vask buffer og resuspend perlene.Til dette legger du til 32 mikroliter av de rensede PCR-1-produktene. Bland grundig og inkuber ved romtemperatur i 30 minutter. Plasser perle-DNA-blandingen på et magnetisk stativ i to minutter.Pipette ut supernatanten som biotinmerket DNA som inneholder innsettingskanten binder seg til streptavidin på perlene. Vask perlene med 500 mikroliter 1X bind og vask buffer, og vask deretter perlene med 200 mikroliter lav TE. Resuspend DNA-bundet perler i 17 mikroliter av Low TE. DNA-et til in vivo- og in vitro-dyrkede mutantbibliotekene ekstrahert og fragmentert i en ultralydator viste at flertallet av fragmentene spenner mellom 100 og 400 basispar. Plasseringen av transposonmedierte innsettinger over de fire svarene til Burkholderia gladiolistamme Et genom kan observeres i kapselen.Et sammendrag av sekvenseringseffekten og antall unike innsettinger og gener som er truffet i de tre replikerings-in vivo- og in vitro-bibliotekene, kan observeres i tabellen. Det viktige å huske er å beregne populasjonens flaskehalsstørrelse under vertskolonisering for å få en passende representasjon av biblioteket under infeksjon. Juster også for et kompatibelt antall bakterielle generasjoner in vitro og i verten.Etter å ha generert transposonmutantbiblioteket, kan det screenes på selektive medier for å gjenopprette mutanter basert på fenotypiske forskjeller. Spesifikke gener som er viktige for en tilstand, kan dermed identifiseres.

Research

JoVE Journal

Biology

Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Electroantennographic bioassay som et screeningverktøy for vertsplanten flyktige

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Bruke SecM Arrest sekvens som et verktøy for å isolere ribosom Innbundne polypeptider

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

BEST: Barcode Enabled Sequencing of Tetrads

BEST: Barcode Enabled Sekvensering av Tetrads

Tetrad analysis is a valuable tool for yeast genetics, but the laborious manual nature of the process has hindered its application on large scales. ...

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

C-FOS Protein Immunohistologisk Detection: Et nyttig verktøy som en markør av Central Pathways involvere seg i det fysiologiske responser<em&gt; I Vivo</em&gt; og<em&gt; Ex Vivo</em

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

En enkel Bioassay for Evaluering av vaskulær endotelial vekstfaktorer

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assistert mikrodisseksjon (LAM) som et verktøy for Transkripsjonell Profilering av individuelle celletyper

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...