Name: transposon-insertion sequencing as a tool to elucidate bacterial colonization factors in a burkholderia gladioli symbiont of lagria villosa beetles
Uploaded: 2021-08-12T15:00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles at JoVE.co

Мы благодарны Junbeom Lee за предоставление штамма E. coli WM3064 + pRL27 для сопряжения и руководства в процедуре, Катрин Хюффмайер за помощь в устранении неполадок во время генерации библиотеки мутантов и профессору Андре Родригесу за поддержку сбора насекомых и получения разрешений. Мы также благодарим Ребекку Янке и Дагмар Клебш за поддержку в сборе и выращивании насекомых. Мы выражаем признательность бразильским властям за предоставление следующих разрешений на доступ, сбор и экспорт образцов насекомых: разрешение SISBIO No 45742-1, 45742-7 и 45742-10, процесс CNPq No 01300.004320/2014-21 и 01300.0013848/2017-33, IBAMA Nr. 14BR016151DF и 20BR035212/DF). Это исследование было поддержано финансированием исследовательских грантов Немецкого научного фонда (DFG) FL1051/1-1 и KA2846/6-1.

<ol>
	<li>Cain, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+advances+in+transposon-insertion+sequencing.">A decade of advances in transposon-insertion sequencing.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (9), 526-540 (2020).</li><li>Chao, M. C., Abel, S., Davis, B. M., Waldor, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+design+and+analysis+of+transposon+insertion+sequencing+experiments.">The design and analysis of transposon insertion sequencing experiments.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (2), 119-128 (2016).</li><li>Barquist, L., Boinett, C. J., Cain, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+querying+bacterial+genomes+with+transposon-insertion+sequencing.">Approaches to querying bacterial genomes with transposon-insertion sequencing.</a> RNA Biology. 10 (7), 1161-1169 (2013).</li><li>Fl&#243;rez, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic-producing+symbionts+dynamically+transition+between+plant+pathogenicity+and+insect-defensive+mutualism.">Antibiotic-producing symbionts dynamically transition between plant pathogenicity and insect-defensive mutualism.</a> Nature Communications. 8 (1), 15172 (2017).</li><li>Fl&#243;rez, L. V., Kaltenpoth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbiont+dynamics+and+strain+diversity+in+the+defensive+mutualism+between+Lagria+beetles+and+Burkholderia.">Symbiont dynamics and strain diversity in the defensive mutualism between Lagria beetles and Burkholderia.</a> Environmental Microbiology. 19 (9), 3674-3688 (2017).</li><li>Fl&#243;rez, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antifungal+polyketide+associated+with+horizontally+acquired+genes+supports+symbiont-mediated+defense+in+Lagria+villosa+beetles.">An antifungal polyketide associated with horizontally acquired genes supports symbiont-mediated defense in Lagria villosa beetles.</a> Nature Communications. 9 (1), 2478 (2018).</li><li>. FastQC A quality control tool for high throughput sequence data Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2012)</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+A+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FeatureCounts:+An+efficient+general+purpose+program+for+assigning+sequence+reads+to+genomic+features.">FeatureCounts: An efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features.</a> Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Gayt&#225;n, M. O., Mart&#237;nez-Santos, V. I., Soto, E., Gonz&#225;lez-Pedrajo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+three+secretion+system+in+attaching+and+effacing+pathogens.">Type three secretion system in attaching and effacing pathogens.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 129 (2016).</li><li>Hachani, A., Wood, T. E., Filloux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+VI+secretion+and+anti-host+effectors.">Type VI secretion and anti-host effectors.</a> Current Opinion in Microbiology. 29, 81-93 (2016).</li><li>Deep, A., Chaudhary, U., Gupta, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing+and+bacterial+pathogenicity:+From+molecules+to+disease.">Quorum sensing and bacterial pathogenicity: From molecules to disease.</a> Journal of Laboratory Physicians. 3 (1), 4-11 (2011).</li><li>Silva, A. J., Benitez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+cholerae+biofilms+and+cholera+pathogenesis.">Vibrio cholerae biofilms and cholera pathogenesis.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (2), 0004330 (2016).</li><li>Navarro-Garcia, F., Ruiz-Perez, F., Cataldi, &. #. 1. 9. 3. ;., Larz&#225;bal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+VI+secretion+system+in+pathogenic+Escherichia+coli:+structure,+role+in+virulence,+and+acquisition.">Type VI secretion system in pathogenic Escherichia coli: structure, role in virulence, and acquisition.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1965 (2019).</li><li>Ribet, D., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+bacterial+pathogens+colonize+their+hosts+and+invade+deeper+tissues.">How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues.</a> Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).</li><li>Schwarz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burkholderia+Type+VI+secretion+systems+have+distinct+roles+in+eukaryotic+and+bacterial+cell+interactions.">Burkholderia Type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions.</a> PLoS Pathogens. 6 (8), 1001068 (2010).</li><li>Jones, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kill+and+cure:+genomic+phylogeny+and+bioactivity+of+Burkholderia+gladioli+bacteria+capable+of+pathogenic+and+beneficial+lifestyles.">Kill and cure: genomic phylogeny and bioactivity of Burkholderia gladioli bacteria capable of pathogenic and beneficial lifestyles.</a> Microbial Genomics. 7 (1), 000515 (2021).</li><li>Takeshita, K., Kikuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Riptortuspedestris+and+Burkholderia+symbiont:+an+ideal+model+system+for+insect-microbe+symbiotic+associations.">Riptortuspedestris and Burkholderia symbiont: an ideal model system for insect-microbe symbiotic associations.</a> Research in Microbiology. 168 (3), 175-187 (2017).</li><li>Powell, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+screen+identifies+host+colonization+determinants+in+a+bacterial+gut+symbiont.">Genome-wide screen identifies host colonization determinants in a bacterial gut symbiont.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (48), 13887-13892 (2016).</li><li>Brooks, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+discovery+of+colonization+determinants+in+the+squid+symbiont+Vibrio+fischeri.">Global discovery of colonization determinants in the squid symbiont Vibrio fischeri.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17284-17289 (2014).</li><li>Somprasong, N., McMillan, I., Karkhoff-Schweizer, R. R., Mongkolsuk, S., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+genetic+manipulation+of+Burkholderia+gladioli+pathovar+cocovenenans.">Methods for genetic manipulation of Burkholderia gladioli pathovar cocovenenans.</a> BMC Research Notes. 3 (308), (2010).</li><li>Garcia, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burkholderia+thailandensis:+Genetic+manipulation.">Burkholderia thailandensis: Genetic manipulation.</a> Current Protocols in Microbiology. 45, 1-15 (2017).</li><li>Headd, B., Bradford, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conjugation+window+in+an+Escherichia+coli+K-12+strain+with+an+IncFII+plasmid.">The conjugation window in an Escherichia coli K-12 strain with an IncFII plasmid.</a> Applied and Environmental Microbiology. 86 (17), 00948 (2020).</li><li>Van Opijnen, T., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+insertion+sequencing:+A+new+tool+for+systems-level+analysis+of+microorganisms.">Transposon insertion sequencing: A new tool for systems-level analysis of microorganisms.</a> Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 435-442 (2013).</li><li>Gallagher, L. A., Ramage, E., Patrapuvich, R., Weiss, E., Brittnacher, M., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-defined+transposon+mutant+library+of+Burkholderia+thailandensis.">Sequence-defined transposon mutant library of Burkholderia thailandensis.</a> mBio. 4 (6), 00604-00613 (2013).</li><li>Wong, Y. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candidate+essential+genes+in+Burkholderia+cenocepacia+J2315+identified+by+genome-wide+TraDIS.">Candidate essential genes in Burkholderia cenocepacia J2315 identified by genome-wide TraDIS.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1288 (2016).</li><li>Moule, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+saturation+mutagenesis+of+Burkholderia+pseudomallei+K96243+predicts+essential+genes+and+novel+targets+for+antimicrobial+development.">Genome-wide saturation mutagenesis of Burkholderia pseudomallei K96243 predicts essential genes and novel targets for antimicrobial development.</a> mBio. 5 (1), 00926 (2014).</li><li>Ding, Q., Tan, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Himar1+transposon+for+efficient+random+mutagenesis+in+Aggregatibacter+actinomycetemcomitans.">Himar1 transposon for efficient random mutagenesis in Aggregatibacter actinomycetemcomitans.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1842 (2017).</li><li>Green, B., Bouchier, C., Fairhead, C., Craig, N. L., Cormack, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+site+preference+of+Mu,+Tn5,+and+Tn7+transposons.">Insertion site preference of Mu, Tn5, and Tn7 transposons.</a> Mobile DNA. 3, 3 (2012).</li><li>Lodge, J. K., Weston-Hafer, K., Berg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+Tn5+target+specificity:+Preference+for+insertion+at+G/C+pairs.">Transposon Tn5 target specificity: Preference for insertion at G/C pairs.</a> Genetics. 120 (3), 645-650 (1988).</li><li>Ar&#225; Ujo, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequencing+and+transposon+mutagenesis+of+Burkholderia+seminalis+TC3.4.2R3+identify+genes+contributing+to+suppression+of+orchid+necrosis+caused+by+B.+gladioli.">Genome sequencing and transposon mutagenesis of Burkholderia seminalis TC3.4.2R3 identify genes contributing to suppression of orchid necrosis caused by B. gladioli.</a> Molecular Plant-microbe Interactions: MPMI. 29 (6), 435-446 (2016).</li><li>Dobritsa, A. P., Samadpour, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reclassification+of+Burkholderiainsecticola+as+Caballeroniainsecticola+comb.+nov.+and+reliability+of+conserved+signature+indels+as+molecular+synapomorphies.">Reclassification of Burkholderiainsecticola as Caballeroniainsecticola comb. nov. and reliability of conserved signature indels as molecular synapomorphies.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 69 (7), 2057-2063 (2019).</li><li>Ohbayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect's+intestinal+organ+for+symbiont+sorting.">Insect's intestinal organ for symbiont sorting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 5179-5188 (2015).</li><li>Ross, C., Scherlach, K., Kloss, F., Hertweck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+conjugated+polyyne+biosynthesis+in+phytopathogenic+bacteria.">The molecular basis of conjugated polyyne biosynthesis in phytopathogenic bacteria.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (30), 7794-7798 (2014).</li><li>Atkins, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutant+of+Burkholderia+pseudomallei,+auxotrophic+in+the+branched+chain+amino+acid+biosynthetic+pathway,+is+attenuated+and+protective+in+a+murine+model+of+melioidosis.">A mutant of Burkholderia pseudomallei, auxotrophic in the branched chain amino acid biosynthetic pathway, is attenuated and protective in a murine model of melioidosis.</a> Infection and Immunity. 70 (9), 5290-5294 (2002).</li></ol>

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов, относящегося к исследованию.

Была создана библиотека транспозонов B. gladioli для выявления важных факторов колонизации хозяина в симбиотическом взаимодействии между жуками L. villosa и бактериями B. gladioli. Основными шагами в протоколе были конъюгация, инфекция хозяина, подготовка библиотеки ДНК и секвенирование.
Поскольку многие штаммы Burkholderia поддаются генетической модификации путем конъюгации24,25,плазмида, несущая транспозон и кассету вставки антибиотика, была успешно конъюгирована в штамм-мишень B. gladioli Lv-StA из E. coli. Предыдущие попытки трансформации электропорацией дали очень низкие до почти никакого уровня трансформанты гладиолусов B. Целесообразно оптимизировать технику трансформации для организма-мишени, чтобы эффективно выдавать большое количество трансформантов.
Один раунд конъюгации и 40 конъюгационных пятен нарушили 3 736 генов у B. gladioli Lv-StA. Оглядываясь назад, можно сказать, что для разрушения большинства из 7 468 генов и получения насыщенной библиотеки потребуется несколько раундов конъюгации. Примечательно, что время инкубации при сопряжении не позволяло превышать 12-18 ч, что является концом фазы экспоненциального роста B. гладиолусов. Разрешение конъюгации за пределами фазы экспоненциального роста бактериальных клеток снижает шансы на успех получения трансконъюгантов26. Поэтому период конъюгации следует корректировать в соответствии с ростом видов бактерий.
Для успешного проведения эксперимента, связанного с заражением мутантных библиотек у хозяина, важно оценить размер узкого места бактериальной популяции во время колонизации и разнообразие мутантов в библиотеке до заражения1,2,27. При подготовке к эксперименту мы оценили минимальное количество жуков, которые должны быть заражены, чтобы иметь высокую вероятность того, что каждый мутант в библиотеке будет отобран и допущен к колонизации. Также были рассчитаны приблизительное время генерации бактерий in vivo и количество поколений за время эксперимента. Затем культура in vitro была выращена до сопоставимого числа поколений путем корректировки времени инкубации. Для аналогичного эксперимента с инфекцией на других немоделовых хозяевах желательна способность поддерживать лабораторную культуру и постоянный источник организмов-хозяев.
Вслед за ростом мутантной библиотеки in vivo и in vitro и коллекции образцов был проведен модифицированный протокол подготовки библиотеки ДНК для секвенирования вставки транспозонов. Модификация протокола включала разработку пользовательских праймеров ПЦР и добавление шагов ПЦР для выбора фрагментов ДНК, содержащих вставную кассету. Поскольку протокол был настроен, дополнительные циклы ПЦР в протоколе увеличивали риск чрезмерной амплификации и получения гибридизированных фрагментов адаптер-адаптер в конечных библиотеках. Следовательно, рекомендуется заключительный этап очистки (без выбора размера) после двух PCR, поскольку он помогает в удалении этих фрагментов. Распределение по размерам библиотек ДНК все еще было шире, чем ожидалось. Однако увеличение глубины секвенирования обеспечило достаточные данные, которые были отфильтрованы в ходе биоинформатического анализа, получив удовлетворительные результаты.
Поскольку транспозонно-опосредованный мутагенез генерирует тысячи случайных вставок в одном эксперименте, можно создать насыщенную библиотеку мутантов, которая содержит все, кроме тех мутантов, где гены, необходимые для роста бактерий, были нарушены. Мы, скорее всего, не работали с насыщенной мутантной библиотекой, учитывая оценки основных генов в других исследованиях Burkholderia sp. 28,29. Тем не менее, ненасыщенная библиотека помогает в изучении различных генов-кандидатов для дальнейших исследований с использованием целевого мутагенеза. Перед экспериментами также важно помнить, что некоторые транспозоны имеют специфические сайты-мишени вставки, которые увеличивают обилие мутантов в определенных локусах в геноме30. Известно, что транспозоны Mariner нацелены на AT-сайты для вставки31,а транспозоны Tn5 имеют смещение GC32,33. Включение шагов во время биоинформатического анализа для распознавания горячих точек для транспозонных вставок поможет в оценке любой предвзятости распределения.
Несмотря на склонность к неудачам, хорошо продуманный эксперимент по секвенированию транспозонной вставки может стать мощным инструментом для идентификации многих условно важных генов у бактерий в рамках одного эксперимента. Например, дюжина генов Burkholderia seminalis, важных для подавления некроза листьев орхидеи, была идентифицирована путем объединения транспозонного мутагенеза и геномики34. Помимо Burkholderia,несколько генов адгезии и подвижности и транспортеров были идентифицированы как важные факторы колонизации у symbionts Snodgrassella alvi apis mellifera (Honeybee)22и у симпозиумов Vibrio fischerii Euprymna scolopes (гавайский кальмар бобтейла)23 с использованием транспозонно-инстиционного мутагенеза.
В качестве альтернативного подхода транспозонный мутагенез может сопровождаться скринингом отдельных мутантов с использованием селективных сред вместо секвенирования. Фенотипический скрининг или биоанализы для выявления недостатков, таких как подвижность, производство биологически активных вторичных метаболитов или специфические ауксотрофии, возможны. Например, скрининг библиотеки транспозонов мутантов Burkholderia insecticola (переназначенных в род Caballeronia35)был ключевым в выявлении того, что симбионты используют гены подвижности для колонизации Riptortus pedestris,их насекомого-хозяина36. Кроме того, с использованием транспозонного мутагенеза и фенотипического скрининга биосинтетический кластер генов для биоактивного вторичного метаболита кариоинненцина был идентифицирован в Burkholderia caryophylli37. Ауксотрофный мутант Burkholderia pseudomallei был идентифицирован после транспозонного мутагенеза и скрининга и является возможным ослабленным кандидатом на вакцину против мелиоидоза, опасного заболевания у людей и животных38. Таким образом, транспозонный мутагенез и секвенирование являются ценным подходом в изучении молекулярных признаков бактерий, которые важны для взаимодействия с их соответствующими хозяевами в патогенных или мутуалистических ассоциациях.

Гладиолусы Burkholderia могут вступать в симбиотическую ассоциацию с жуками Lagria villosa, играя важную роль в защите от микробных антагонистов насекомых-хозяев4,5,6. Самки жуков обуславлживают несколько штаммов B. gladioli в специализированных железах, аксессуарах для репродуктивной системы. При яйцекладке самки размазывают клетки гладиолусов B. на поверхности яйца, где антимикробные соединения, продуцируемые B. gladioli, ингибируют инфекции энтомопатогенными грибами4,6. Во время позднего эмбрионального развития или в начале после вылупления личинок бактерии колонизируют кутиккулярные инвагинации на дорсальной поверхности личинок. Несмотря на такую специализированную локализацию и вертикальный маршрут передачи симбионтов, L. villosa предположительно может также приобретать B. гладиолусов горизонтально из окружающей среды4. Кроме того, по крайней мере три штамма B. gladioli были обнаружены в ассоциации с L. villosa4,6. Среди них B. gladioli Lv-StA является единственным, который поддается выращиванию in vitro.
Б. гладиолусы Lv-StA имеет размер генома 8,56 Mb6 и содержит 7 468 генов. Какие из этих генов важны для бактерий B. gladioli для колонизации жука-хозяина? Чтобы ответить на этот вопрос, мы использовали транспозонно-вставное секвенирование (Tn-seq), исследовательский метод идентификации условно необходимых микробных генов1,2,3. Мутантная библиотека B. gladioli Lv-StA была создана с использованием транспозона Tn5. Путем конъюгации из донорских клеток Escherichia coli в B. gladioli Lv-StA была перенесена плазмида pRL27, несущая транспозон Tn5, и кассета устойчивости к антибиотикам, окруженная перевернутыми повторами(рисунок 1). Таким образом, был сгенерирован набор мутантов, которые по отдельности несут нарушения 3 736 симбионтных генов(рисунок 2).
Пул мутантов был заражен яйцами жуков для выявления факторов колонизации и, в качестве контроля, также выращивался in vitro в среде King's B (KB). После того, как у нас было достаточно времени для колонизации, вылупившиеся личинки были собраны и объединены для извлечения ДНК. Фрагменты ДНК, содержащие транспозонную вставку и фланкировую геномную область B. gladioli Lv-StA, были отобраны с использованием модифицированного протокола подготовки библиотеки ДНК для секвенирования. Была проведена обработка качества считывания с последующим анализом с помощью DESeq2 для выявления специфических генов, имеющих решающее значение для B. gladioli Lv-StA для колонизации личинок L. villosa при передаче через поверхность яйца.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,6- Diaminopimelic Acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B22391</td>
			<td>For E.coli WM3064+ pRL27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar - Agar</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure beads XP (magentic beads + polyethylene glycol + salts)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td>Size selection in step 6.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach (NaOCl) 12%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie2 v.2.4.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinfromatic tool for read mapping. Reference 10 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer-S</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>PEQL01-1020</td>
			<td>For PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutadapt v.2.10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatic tool for removing specific adapter sequences from the reads. Reference 8 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DESeq2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RStudio package for assessing differential mutant abundance. Usually used for RNAseq analysis. Reference 12 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder 100 bp</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T834.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>R0182</td>
			<td>PCR for confirming success of conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Di-Sodium salt</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epicentre MasterPure Complete DNA and RNA Purification Kit</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>MC85200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2218.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastQC v.0.11.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatic tool for assessing the quality of sequencing data. Reference 7 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeatureCounts v.2.0.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatic tool to obtain read counts per genomic feature. Reference 11 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>7530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Serva</td>
			<td>26899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>4936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td>Roth</td>
			<td>PO27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index primers set 1)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7335S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7645S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone (soybean)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2365</td>
			<td>For Burkholderia gladioli Lv-StA KB-medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peqGOLD &#39;Hot&#39; Taq- DNA Polymerase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PEQL01-1020</td>
			<td>PCR for confirming success of conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates - 145 x 20 mm</td>
			<td>Roth</td>
			<td>XH90.1</td>
			<td>For selecting transconjugants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates - 90 x 16 mm</td>
			<td>Roth</td>
			<td>N221.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiaxcel (StarSEQ GmbH, Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Quality check after DNA library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin beads</td>
			<td>Roth</td>
			<td>HP57.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>01-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic v.0.36</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatic tool for trimming low quality reads and also adapter sequences. Reference 9 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris -HCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9090.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2366</td>
			<td>For Escherichia coli WM3064+pRL27 LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td>Bandelin</td>
			<td>GM 70 HD</td>
			<td>For shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER enzyme (uracil DNA glycosylase + DNA glycosylase- lyase Endonuclease VIII)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7645S</td>
			<td>Ligation step 6.5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2363</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transposon-insertion sequencing as a tool to elucidate bacterial colonization factors in a burkholderia gladioli symbiont of lagria villosa beetles

Вывод функции генов путем манипулирования их активностью является важным инструментом для понимания генетических основ большинства биологических процессов. Достижения в молекулярной микробиологии привели к появлению различных методов мутагенеза для манипулирования генами. Среди них транспозонно-инжекционное секвенирование (Tn-seq) является ценным инструментом для одновременной оценки функциональности многих генов-кандидатов нецелевым способом. Этот метод был ключевым для выявления молекулярных механизмов колонизации эукариотических хозяев в нескольких патогенных микробах и нескольких полезных симбионтах.
Здесь Tn-seq установлен как метод выявления факторов колонизации у мутуалистического симбиона Burkholderia gladioli жука Lagria villosa. Путем конъюгации транспозонно-опосредованную Tn5 вставку кассеты с устойчивостью к антибиотикам осуществляют в случайных геномных местах у B. гладиолусов. Чтобы выявить влияние нарушений генов на способность бактерий колонизировать жука-хозяина, сгенерированная транспозонно-мутантная библиотека B. gladioli прививается на яйца жуков, в то время как контроль выращивается in vitro в жидкой питательной среде. После того, как у нас будет достаточно времени для колонизации, ДНК извлекается из библиотек, выращенных in vivo и in vitro. Следуя протоколу подготовки библиотеки ДНК, образцы ДНК готовятся для транспозонно-вставного секвенирования. Фрагменты ДНК, которые содержат транспозонно-вставную кромку и фланкировую бактериальную ДНК, выбираются, а места мутации определяются путем секвенирования вдали от края транспозон-вставки. Наконец, анализируя и сравнивая частоты каждого мутанта между библиотеками in vivo и in vitro, можно предсказать важность конкретных генов симбионта во время колонизации жуков.

Watch this Scientific Journal Video about Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles at JoVE.co

Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles

Это адаптированный метод выявления потенциальных факторов колонизации насекомых в благотворном симбионсе Burkholderia. Жук-хозяин заражен случайной мутантной библиотекой, генерируемой с помощью транспозонного мутагенеза, а сложность библиотеки после колонизации сравнивается с контролем, выращенным in vitro.

Транспозонно-инстиционное секвенирование как инструмент для выяснения факторов бактериальной колонизации у гладиолусов Burkholderia Симбионт Жуков Lagria villosa

Inferring the function of genes by manipulating their activity is an essential tool for understanding the genetic underpinnings of most biological ...

Этот протокол полезен для выполнения генетических манипуляций с симбиотическими бактериями, в данном случае, в частности, с буркхолдерией, и идентификации генов, необходимых для колонизации насекомого-хозяина. Транспозонное вставное секвенирование является мощным инструментом для идентификации большого количества условно необходимых генов одновременно в одном эксперименте. Начните с прививки свежей донорской культуры донора E.coli в 10 миллилитрах среды LB, дополненной канамицином и DAP под стерильным капюшоном.Инокулируют штамма гладиолусов Burkholderia A в клетках-реципиентах в пяти миллилитрах среды KB. Инкубировать культуры при 30 градусах Цельсия в течение ночи на шейкере при 250 оборотах в минуту. После ночного роста центрифугируют четыре миллилитра каждой из культур по 9, 600 раз G в течение шести минут, чтобы гранулировать клетки и выбросить супернатант.Под стерильным капюшоном промыть гранулированные клеточные культуры в среде KB, содержащей DAP. И, наконец, повторно суспендировали культуры отдельно в четырех миллилитрах KB плюс DAP среда. В свежей 15-миллилитровой трубке смешайте 250 микролитров промытых донорских клеток E.coli с одним миллилитром промытых клеток реципиента штамма гладиолусов Burkholderia.Надень 10 микролитров этой смеси конъюгационных клеток на пластинах агара KB, содержащих DAP. Дайте пластине спокойно отдохнуть в стерильной вытяжке при комнатной температуре в течение одного часа. Инкубировать пластины с пятнами сопряжения при 30 градусах Цельсия в течение 12-18 часов.После инкубации добавьте от двух до четырех миллилитров 1X PBS на пластины под стерильным капюшоном и используйте клеточный скребок, чтобы освободить выращенные бактериальные конъюгационные пятна из агара. Затем пипетку конъюгированной ячейки смешивают в две миллилитровые микрофьюжетные трубки. Гранулируют ячейки центрифугированием при 9, 600 раз G в течение двух минут.Выбросьте супернатант и промыть гранулу дважды в одном миллилите 1X PBS путем пипетки вверх и вниз. Повторное суспендирование конечной гранулы в 1 200 микролитрах 1X PBS. Хорошо перемешайте и наложите 100 микролитров клеточной смеси на большие пластины агара KB, дополненные канамицином, и инкубировать при 30 градусах Цельсия в течение ночи.Подсчитайте общее количество трансконъюгантных колоний на трех пластинах и экстраполируйте, чтобы вычислить приблизительное количество мутантов, полученных во всех пластинах. Чтобы увеличить шансы на получение репрезентативной библиотеки, убедитесь, что общее количество колоний в несколько раз превышает общее количество генов в геноме. Чтобы подтвердить успех сопряжения, выполните ПЦР, нацеленную на вставную кассету, используя от 10 до 20 колоний образцов, как описано в рукописи.Под стерильным капотом соскоблите колонии с пластин, добавив один-два миллилитра 1X PBS на агар. Смешанный с пластин клеточной смеси сваливают в 50-миллилитровые трубки. Вихрьте библиотеку, чтобы тщательно перемешать, а затем разделите один миллилитр объединенной библиотеки мутантов на несколько криотрубок.Добавьте в тубы один миллилитр 70% глицерина и храните при минус 80 градусах Цельсия. Выберите яичную кладку L.villosa и подсчитайте количество яиц, если кладка содержит более 100 яиц. Чтобы стерилизовать всю яичную кладку, добавьте 200 микролитров 70% этанола и аккуратно вымойте яйца в течение пяти минут, затем удалите этанол и дважды вымойте яйца автоклавной водой.Добавьте 200 микролитров 12% отбеливателя и аккуратно вымойте яйца в течение 30 секунд. Немедленно удалите отбеливатель и снова вымойте яйца еще раз 200 микролитрами автоклавной воды. Заразить яйца в стерилизованной кладке яиц, используя от двух до шести клеток на микролитр вымытой библиотеки мутантов в PBS.Через два дня после того, как зараженные личинки жука вылупляются, соберите 100-секундных личинок в 1,5-миллилитровой микрофьюжной трубке и храните при минус 80 градусах Цельсия. Чтобы создать контрольную библиотеку in vitro, привите 250 микролитров в два раза по 10 до шести клеток на микролитр мутантной библиотеки в 10 миллилитрах среды KB, содержащей канамицин. После извлечения ДНК из библиотек мутантов, выращенных in vivo и in vitro, поделитесь ДНК с ультразвуковым аппаратом.Чтобы проверить, была ли ДНК срезана до желаемого диапазона размеров, загрузите пять микролитров нестрепаемой и стриженной ДНК после смешивания с гелевым нагрузочным красителем в соотношении один к одному на 1,6% агарозном геле при 250 вольтах в течение 40 минут. Чтобы подготовить концы фрагмента, необходимые для перевязки адаптера, начните с добавления трех микролитров ферментной смеси и семи микролитров реакционного буфера к 50 микролитрам срезаной ДНК и хорошо перемешайте путем пипетирования. Установите термоциклер с нагретой крышкой при температуре более или равной 75 градусам Цельсия и инкубируют образцы в течение 30 минут при 20 градусах Цельсия и 30 минут при 65 градусах Цельсия, затем удерживайте температуру на уровне четырех градусов Цельсия.Для лигирования адаптера добавьте 30 микролитров главной смеси лигирования, один микролитр усилителя лигирования и 2,5 микролитра разбавленного адаптера к продуктам конечной стадии приготовления. Тщательно перемешайте путем пипетки и инкубирует образец в течение 15 минут при 20 градусах Цельсия в термоциклере с подогретой крышкой. Через 15 минут добавьте три микролитра фермента.Хорошо перемешайте путем пипетки и инкубирует образец в течение 15 минут при 37 градусах Цельсия в термоциклере с крышкой, нагретой при большем или равном 47 градусам Цельсия. Чтобы выбрать размер адаптера, лигатированной ДНК, нацеленной на фрагменты из 250 пар оснований, начните с вихревого раствора магнитного шарика и поместите его при комнатной температуре в течение 30 минут перед использованием. Добавьте 0,3 раза бусины к 96,5 микролитрам лигатированной смеси ДНК и тщательно перемешайте, пипетируя.Инкубировать бисероплетение в течение пяти минут. Поместите трубки на магнитную подставку, чтобы стянуть бусины и удалить фрагменты ДНК нежелательного размера. Дайте бусинам отстояться в течение пяти минут, а затем перенесите прозрачный супернатант в новую микрофьюжную трубку.Добавьте в супернатант 0,15 раза свежих бусин и хорошо перемешайте, пипетировка. Инкубировать смесь шариков в течение пяти минут, а затем поместить трубки на магнитную подставку, чтобы стянуть шарики, связанные с целевой ДНК. Подождите пять минут, а затем выбросьте супернатант, сохранив бусины.Вытав бусины на магнитную подставку, добавьте 200 микролитров свежеприготовленного 80% этанола и подождите 30 секунд, прежде чем выбросить этанол, не потревожив бусины. Выньте трубки из подставки и добавьте 17 микролитров 0,1X TE или Low TE, затем перемешайте путем пипетки 10 раз и инкубируете смесь при комнатной температуре в течение двух минут. Поместите трубку на магнитную подставку и возьмите 15 микролитров выбранного размера ДНК для ПЦР-1.Вихрь стрептавидиновые шарики и поместите их при комнатной температуре не менее чем на 30 минут. Возьмите 32 микролитра бусин и вымойте их 500 микролитрами 1X связывания и промывки буфера. Добавьте 32 микролитра 2X связывания и промывки буфера и повторно суспендирует бусины.К этому добавьте 32 микролитра очищенных продуктов PCR-1. Тщательно перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут. Поместите смесь ДНК шариков на магнитную подставку на две минуты.Пипетка из супернатанта в виде биотин-помеченной ДНК, содержащей край вставки, связывается со стрептавидином на шариках. Вымойте бусины 500 микролитрами 1X связующего и промывного буфера, а затем вымойте бусины 200 микролитрами Low TE. Повторное суспендирование связанных с ДНК шариков в 17 микролитрах Low TE. ДНК библиотек мутантов in vivo и in vitro, извлеченных и фрагментированных в ультразвуковом аппарате, показала, что большинство фрагментов охватывают от 100 до 400 пар оснований. Расположение транспозонно-опосредованных вставок через четыре репликакона генома штамма гладиолусов Burkholderia A можно наблюдать в стручке.В таблице можно поразить сводку результатов секвенирования и количество уникальных вставок и генов, поразивших три реплицируемые библиотеки in vivo и in vitro. Важно помнить, что необходимо рассчитать размер узкого места популяции во время колонизации хозяина, чтобы получить соответствующее представление о библиотеке во время заражения. Кроме того, скорректируйте для совместимого количества бактериальных поколений in vitro и в хозяине.После генерации библиотеки транспозонных мутантов она может быть экранирована на селективных носителях для восстановления мутантов на основе фенотипических различий. Таким образом, могут быть идентифицированы специфические гены, важные для состояния.

Research

JoVE Journal

Biology

Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

Использование Rotorod как метод Качественный анализ Прогулка по Крыса

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Микрожидкостных Устройство для Количественная Бактериальные Хемотаксис в стабильных градиента концентрации

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

Корреляционный световой и электронной микроскопии (CLEM) как инструмент для визуализации микроинъекции молекул и их Эукариотические Sub-клеточных мишеней


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Electroantennographic биопроб в качестве скринингового инструмента для летучих растения-хозяина

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Использование МЭСМ последовательности арест как средство изолировать Рибосома связанных полипептидов

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

BEST: Barcode Enabled Sequencing of Tetrads

ЛУЧШИЙ: Штрих Enabled Секвенирование тетрад

Tetrad analysis is a valuable tool for yeast genetics, but the laborious manual nature of the process has hindered its application on large scales. ...

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

C-FOS белка Обнаружение иммуногистохимического: Полезный инструмент в качестве маркера Центральной путей, участвующих в конкретных физиологических реакций<em&gt; В Vivo</em&gt; и<em&gt; Ex Vivo</em

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

Простой биопроб для оценки факторов роста эндотелия сосудов

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Помощью лазера микродиссекция (LAM) в качестве инструмента для транскрипционные Профилирование отдельных типов клеток

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...