Name: transposon-insertion sequencing as a tool to elucidate bacterial colonization factors in a burkholderia gladioli symbiont of lagria villosa beetles
Uploaded: 2021-08-12T15:00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles at JoVE.co

Estamos agradecidos a Junbeom Lee por proporcionar la cepa E. coli WM3064 + pRL27 para la conjugación y la orientación en el procedimiento, Kathrin Hüffmeier por ayudar con la solución de problemas durante la generación de la biblioteca mutante y el Prof. André Rodrigues por apoyar la recolección de insectos y la adquisición de permisos. También agradecemos a Rebekka Janke y Dagmar Klebsch por su apoyo en la recolección y crianza de los insectos. Reconocemos a las autoridades brasileñas por otorgar los siguientes permisos de acceso, recolección y exportación de especímenes de insectos: autorización SISBIO Nr. 45742-1, 45742-7 y 45742-10, proceso CNPq nº 01300.004320/2014-21 y 01300.0013848/2017-33, IBAMA Nr. 14BR016151DF y 20BR035212/DF). Esta investigación fue apoyada por fondos de la Fundación Alemana de Ciencias (DFG) Research Grants FL1051/1-1 y KA2846/6-1.

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Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses relacionado con el estudio.

Se generó una biblioteca de mutantes de transposones de B. gladiolos para identificar importantes factores de colonización del huésped en la interacción simbiótica entre los escarabajos L. villosa y la bacteria B. gladioli. Los principales pasos en el protocolo fueron la conjugación, la infección del huésped, la preparación de la biblioteca de ADN y la secuenciación.
Como muchas cepas de Burkholderia son susceptibles de modificación genética por conjugación24,25, el plásmido que lleva el transposón y el cassette de inserción de antibióticos se conjudicó con éxito en la cepa objetivo B. gladioli Lv-StA de E. coli. Los intentos anteriores de transformación por electroporación produjeron muy bajo o casi ningún transformador de B. gladioli. Es aconsejable optimizar la técnica de transformación para que el organismo objetivo produzca de manera eficiente una gran cantidad de transformadores.
Una ronda de conjugación y 40 puntos de conjugación interrumpieron 3.736 genes en B. gladioli Lv-StA. En retrospectiva, serían necesarias múltiples rondas de conjugación para interrumpir la mayoría de los 7.468 genes y obtener una biblioteca saturada. En particular, no se permitió que el tiempo de incubación durante la conjugación superara las 12-18 h, que es el final de la fase de crecimiento exponencial de B. gladioli. Permitir la conjugación más allá de la fase de crecimiento exponencial de las células bacterianas reduce las posibilidades de éxito de la obtención de transconjugantes26. Por lo tanto, el período de conjugación debe ajustarse de acuerdo con el crecimiento de la especie bacteriana.
Para llevar a cabo con éxito un experimento que involucre la infección de bibliotecas mutantes en un huésped, es importante evaluar el tamaño del cuello de botella de la población bacteriana durante la colonización y la diversidad de mutantes en la biblioteca antes de la infección1,2,27. En preparación para el experimento, estimamos que el número mínimo de escarabajos que deben infectarse tiene una alta probabilidad de que cada mutante en la biblioteca sea muestreado y se le permita colonizar. También se calculó el tiempo aproximado de generación bacteriana in vivo y el número de generaciones durante la duración del experimento. El cultivo in vitro se cultivó hasta un número comparable de generaciones ajustando el tiempo de incubación. Para un experimento de infección similar en otros huéspedes no modelo, es deseable la capacidad de mantener un cultivo de laboratorio y una fuente constante de los organismos huéspedes.
Tras el crecimiento de la biblioteca de mutantes in vivo e in vitro y la recolección de muestras, se llevó a cabo un protocolo de preparación de la biblioteca de ADN modificado para la secuenciación de inserción de transposones. La modificación en el protocolo implicó el diseño de cebadores de PCR personalizados y la adición de pasos de PCR para seleccionar fragmentos de ADN que contienen el casete de inserción. Debido a que el protocolo se personalizó, los ciclos de PCR adicionales en el protocolo aumentaron el riesgo de sobreamplificación y la obtención de fragmentos híbridos de adaptador-adaptador en las bibliotecas finales. Por lo tanto, se recomienda un paso final de limpieza (sin selección de tamaño) después de las dos PCR, ya que ayuda a eliminar estos fragmentos. La distribución del tamaño de las bibliotecas de ADN fue aún más amplia de lo esperado. Sin embargo, el aumento de la profundidad de secuenciación proporcionó datos suficientes que se filtraron durante el análisis bioinformático, obteniendo resultados satisfactorios.
Como la mutagénesis mediada por transposones genera miles de inserciones aleatorias en un solo experimento, es posible generar una biblioteca saturada de mutantes que contiene todos excepto aquellos mutantes donde se han interrumpido genes esenciales para el crecimiento bacteriano. Lo más probable es que no trabajáramos con una biblioteca de mutantes saturados, dadas las estimaciones de genes esenciales en otros estudios sobre Burkholderia sp. 28,29. Sin embargo, una biblioteca no saturada ayuda a explorar varios genes candidatos para estudios adicionales utilizando mutagénesis dirigida. Antes de los experimentos, también es importante recordar que algunos transposones tienen sitios objetivo de inserción específicos que aumentan la abundancia de mutantes en ciertos loci en el genoma30. Se sabe que los transposones de Mariner se dirigen a sitios AT para la inserción31,y los transposones Tn5 tienen un sesgo GC32,33. Incluir pasos durante el análisis bioinformático para reconocer puntos críticos para las inserciones de transposones ayudará a evaluar cualquier sesgo de distribución.
Aunque es propenso a contratiempos, un experimento de secuenciación de inserción de transposones bien diseñado puede ser una herramienta poderosa para identificar muchos genes condicionalmente importantes en bacterias dentro de un solo experimento. Por ejemplo, una docena de genes en Burkholderia seminalis importantes para la supresión de la necrosis de la hoja de orquídea se identificaron combinando la mutagénesis del transposón y la genómica34. Más allá de Burkholderia,se han identificado varios genes y transportadores de adhesión y motilidad como factores de colonización importantes en simbiontes de Snodgrassella alvi de Apis mellifera (Honeybee)22,y en los simbiontes Vibrio fischerii de scolopes Euprymna (calamar bobtail hawaiano)23 utilizando el enfoque de mutagénesis transposon-inserción.
Como enfoque alternativo, la mutagénesis de transposones puede ir seguida de la detección de mutantes individuales utilizando medios selectivos en lugar de secuenciación. El cribado fenotípico o los bioensayos para identificar deficiencias, como la motilidad, la producción de metabolitos secundarios bioactivos o auxotrofias específicas, son factibles. Por ejemplo, el cribado de una biblioteca mutante de burkholderia insecticola (reasignada al género Caballeronia35)ha sido clave para identificar que los simbiontes emplean genes de motilidad para colonizar Riptortus pedestris,su insecto huésped36. Además, utilizando mutagénesis de transposones y cribado fenotípico, se identificó el grupo de genes biosintéticos para el metabolito secundario bioactivo carioynencina en Burkholderia caryophylli37. Se identificó un mutante auxotrófico de Burkholderia pseudomallei tras la mutagénesis de transposones y el cribado y es un posible candidato a vacuna atenuado contra la melioidosis, una enfermedad peligrosa en humanos y animales38. Por lo tanto, la mutagénesis y secuenciación de transposones es un enfoque valioso en el estudio de los rasgos moleculares de las bacterias que son importantes para las interacciones con sus respectivos huéspedes en asociaciones patógenas o mutualistas.

Burkholderia gladioli puede participar en una asociación simbiótica con los escarabajos Lagria villosa, desempeñando un papel importante en la defensa contra los antagonistas microbianos del insecto huésped4,5,6. Los escarabajos hembra albergan varias cepas de B. gladioli en glándulas especializadas accesorias al sistema reproductivo. Al poner huevos, las hembras untan las células de B. gladiolos en la superficie del huevo donde los compuestos antimicrobianos producidos por B. gladioli inhiben las infecciones por hongos entomopatógenos4,6. Durante el desarrollo embrionario tardío o temprano después de la eclosión de las larvas, las bacterias colonizan las invaginaciones cuticulares en la superficie dorsal de las larvas. A pesar de esta localización especializada y la ruta de transmisión vertical de los simbiontes, L. villosa presumiblemente también puede adquirir B. gladioli horizontalmente del entorno4. Además, se han encontrado al menos tres cepas de B. gladioli en asociación con L. villosa4,6. Entre estos, B. gladioli Lv-StA es el único que es susceptible de cultivo in vitro.
B. gladiolos Lv-StA tiene un tamaño de genoma de 8,56 Mb6 y contiene 7.468 genes. ¿Cuál de estos genes es importante para que la bacteria B. gladioli colonice al huésped escarabajo? Para responder a esta pregunta, utilizamos la secuenciación de transposon-inserción (Tn-seq), un método exploratorio para identificar genes microbianos condicionalmente esenciales1,2,3. Una biblioteca mutante de B. gladioli Lv-StA fue creada usando un transposón Tn5. A través de la conjugación de células donantes de Escherichia coli a B. gladioli Lv-StA, se transfirió un plásmido pRL27 portador del transposón Tn5 y un casete de resistencia a antibióticos flanqueado por repeticiones invertidas (Figura 1). De este modo, se generó un conjunto de mutantes que individualmente portan interrupciones de 3.736 genes simbiontes(Figura 2).
El grupo mutante se infectó en huevos de escarabajo para identificar los factores de colonización y, como control, también se cultivó in vitro en el medio King's B (KB). Después de permitir suficiente tiempo para la colonización, las larvas eclosionadas se recolectaron y agruparon para la extracción de ADN. Los fragmentos de ADN que contienen el inserto del transposón y la región genómica flanqueante de B. gladioli Lv-StA se seleccionaron utilizando un protocolo de preparación de la biblioteca de ADN modificado para la secuenciación. El procesamiento de calidad de lectura seguido de un análisis con DESeq2 se llevó a cabo para identificar genes específicos cruciales para que B. gladioli Lv-StA colonice las larvas de L. villosa cuando se transmiten a través de la superficie del huevo.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>2,6- Diaminopimelic Acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B22391</td>
			<td>For E.coli WM3064+ pRL27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar - Agar</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure beads XP (magentic beads + polyethylene glycol + salts)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td>Size selection in step 6.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach (NaOCl) 12%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie2 v.2.4.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinfromatic tool for read mapping. Reference 10 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer-S</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>PEQL01-1020</td>
			<td>For PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutadapt v.2.10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatic tool for removing specific adapter sequences from the reads. Reference 8 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DESeq2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RStudio package for assessing differential mutant abundance. Usually used for RNAseq analysis. Reference 12 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder 100 bp</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T834.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>R0182</td>
			<td>PCR for confirming success of conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, Di-Sodium salt</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epicentre MasterPure Complete DNA and RNA Purification Kit</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>MC85200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2218.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastQC v.0.11.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatic tool for assessing the quality of sequencing data. Reference 7 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeatureCounts v.2.0.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatic tool to obtain read counts per genomic feature. Reference 11 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>7530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Serva</td>
			<td>26899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>4936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td>Roth</td>
			<td>PO27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index primers set 1)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7335S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7645S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone (soybean)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2365</td>
			<td>For Burkholderia gladioli Lv-StA KB-medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peqGOLD &#39;Hot&#39; Taq- DNA Polymerase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PEQL01-1020</td>
			<td>PCR for confirming success of conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates - 145 x 20 mm</td>
			<td>Roth</td>
			<td>XH90.1</td>
			<td>For selecting transconjugants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates - 90 x 16 mm</td>
			<td>Roth</td>
			<td>N221.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiaxcel (StarSEQ GmbH, Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Quality check after DNA library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin beads</td>
			<td>Roth</td>
			<td>HP57.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>01-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic v.0.36</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatic tool for trimming low quality reads and also adapter sequences. Reference 9 in main manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris -HCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9090.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2366</td>
			<td>For Escherichia coli WM3064+pRL27 LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td>Bandelin</td>
			<td>GM 70 HD</td>
			<td>For shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER enzyme (uracil DNA glycosylase + DNA glycosylase- lyase Endonuclease VIII)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7645S</td>
			<td>Ligation step 6.5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2363</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transposon-insertion sequencing as a tool to elucidate bacterial colonization factors in a burkholderia gladioli symbiont of lagria villosa beetles

Inferir la función de los genes mediante la manipulación de su actividad es una herramienta esencial para comprender los fundamentos genéticos de la mayoría de los procesos biológicos. Los avances en microbiología molecular han visto la aparición de diversas técnicas de mutagénesis para la manipulación de genes. Entre ellos, la secuenciación de transposon-inserción (Tn-seq) es una herramienta valiosa para evaluar simultáneamente la funcionalidad de muchos genes candidatos de una manera no objetivo. La técnica ha sido clave para identificar mecanismos moleculares para la colonización de huéspedes eucariotas en varios microbios patógenos y algunos simbiontes beneficiosos.
Aquí, Tn-seq se establece como un método para identificar factores de colonización en un simbionte mutualista Burkholderia gladioli del escarabajo Lagria villosa. Por conjugación, la inserción mediada por transposón Tn5 de un casete de resistencia a los antibióticos se lleva a cabo en ubicaciones genómicas aleatorias en B. gladioli. Para identificar el efecto de las alteraciones genéticas en la capacidad de las bacterias para colonizar al huésped escarabajo, la biblioteca generada de transposones-mutantes de B. gladioli se inocula en los huevos de escarabajo, mientras que un control se cultiva in vitro en un medio de cultivo líquido. Después de permitir suficiente tiempo para la colonización, el ADN se extrae de las bibliotecas cultivadas in vivo e in vitro. Siguiendo un protocolo de preparación de la biblioteca de ADN, las muestras de ADN se preparan para la secuenciación de transposon-inserción. Se seleccionan fragmentos de ADN que contienen el borde transposon-insert y el ADN bacteriano flanqueante, y los sitios de mutación se determinan mediante secuenciación lejos del borde transposon-insert. Finalmente, al analizar y comparar las frecuencias de cada mutante entre las bibliotecas in vivo e in vitro, se puede predecir la importancia de genes simbiontes específicos durante la colonización del escarabajo.

Las bacterias asociadas al huésped pueden emplear varios factores para establecer una asociación, incluidos los que median la adhesión, la motilidad, la quimiotaxis, las respuestas al estrés o los transportadores específicos. Si bien se han reportado factores importantes para las interacciones patógeno-huésped para varias bacterias13,14,15,16,17,18,incluidos los miembros del género Burkholderia19,20,menos estudios han explorado los mecanismos moleculares utilizados por los simbiontes beneficiosos para la colonización21,22,23 . Utilizando la secuenciación de inserción de transposones, el objetivo fue identificar los factores moleculares que permiten a B. gladioli colonizar los escarabajos L. villosa.
La mutagénesis mediada por transposón se realizó utilizando el plásmido pRL27, que lleva un transposón Tn5 y un cassette de resistencia a la kanamicina flanqueado por sitios de repetición invertida. El plásmido se introdujo en las células diana B. gladioli Lv-StA por conjugación con el donante plásmido E. coli WM3064 cepa (como se muestra en la Figura 1). Después de la conjugación, la mezcla de conjugación que contenía células receptoras de B. gladiolos y donantes de E. coli se enchaparon en placas de agar selectivas que contenían kanamicina. La ausencia de DAP en las placas eliminó las células de E. coli del donante, y la presencia de kanamicina seleccionada para transconjugantes exitosos de B. gladioli Lv-StA. La biblioteca de mutantes B. gladioli Lv-StA agrupada obtenida de la cosecha de las 100,000 colonias transconjugantes se preparó para su secuenciación utilizando un kit de preparación de biblioteca de ADN modificado y cebadores personalizados. La Figura 2 destaca los pasos de preparación de la biblioteca de ADN. La secuenciación produjo 4 lecturas pareadas de Mio; 3.736 genes de 7.468 genes en B. gladioli Lv-StA fueron alterados.
Para identificar mutantes que eran defectuosos para la colonización en el huésped, la biblioteca de mutantes B. gladioli Lv-StA se infectó en los huevos de escarabajos y se cultivó in vitro en medio KB como control. El tamaño del cuello de botella de colonización in vivo se calculó antes del experimento. Un número conocido de células B. gladioli Lv-StA se infectó en huevos de escarabajo, y el número de células colonizadoras en las primeras larvas de instar recién eclosionadas se obtuvo mediante el recubrimiento de una suspensión de cada larva y el recuento de unidades formadoras de colonias por individuo. Estos cálculos se realizaron para garantizar que el número de células colonizadoras sea suficiente para evaluar todos o un alto porcentaje de los mutantes en la biblioteca por su capacidad para colonizar al huésped. Además, el tiempo de crecimiento entre las condiciones in vitro e in vivo se normalizó en función del número de generaciones bacterianas para hacer que estas muestras sean comparables.
Después de que los huevos eclosionaron, se recolectaron 1.296 larvas en 13 piscinas. Los cultivos mutantes in vitro correspondientes se cultivaron y almacenaron como reservas de glicerol. El ADN de las bibliotecas mutantes cultivadas in vivo e in vitro se extrajo y fragmentó en un ultrasonido. La Figura 3 muestra la distribución de tamaño del ADN cizallado, donde la mayoría de los fragmentos abarcan entre 100 y 400 pb, como se esperaba. Este paso fue seguido por el protocolo de preparación de la biblioteca de ADN modificado para la secuenciación. En cada paso del protocolo, se comprobó la concentración de ADN restante para garantizar que los pasos se realizaran correctamente y para rastrear las pérdidas de ADN. Un control de calidad (ver la Tabla de Materiales)antes de la secuenciación reveló que las bibliotecas de ADN contenían fragmentos de ADN inesperadamente grandes (>800 pb), y esto fue más pronunciado en las bibliotecas in vivo. Dada la dificultad de optimizar la agrupación de fragmentos en los carriles de secuenciación, fue necesario aumentar la profundidad de secuenciación a 10 Mio de lecturas pareadas en las bibliotecas in vivo para alcanzar el número deseado de lecturas. El análisis de los resultados de la secuenciación reveló que un promedio de 4 Mio lee en las bibliotecas in vivo y 3.1 Mio lee en las bibliotecas in vitro que contenían el borde del transposón en el extremo 5' de Read-1(Tabla 9),lo que fue satisfactorio para este experimento. La distribución de las 24.224 inserciones únicas a través del genoma de B. gladioli en la biblioteca original se muestra en la Figura 4. Un análisis realizado utilizando DESeq2 reveló que las abundancias de 271 mutantes eran significativamente diferentes entre las condiciones in vivo e in vitro. 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62843/62843fig03.jpg"> Figura 3: Geles de agarosa de un mutante y bibliotecas de ADN. (A) Gel de agarosa con ADN inaudito de un mutante en el carril x y una escalera de 1 kbp para la escala. (B) Gel con biblioteca de ADN esquilado. Los tamaños de banda de la escalera en el primer carril se indican en el lado izquierdo. Los tres primeros carriles a, b y c contienen fragmentos de ADN esquilados de las bibliotecas in vivo. Los carriles d, e, f y g contienen fragmentos de ADN cizallados de las bibliotecas in vitro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62843/62843fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62843/62843fig04.jpg"> Figura 4:Ubicación de sitios de inserción únicos en la biblioteca original a través de los cuatro replicones en el genoma de Burkholderia gladioli Lv-StA. Cada barra a lo largo del eje x se encuentra en un sitio de inserción. La altura de una barra a lo largo del eje Y corresponde al número de lecturas asociadas con ese sitio. Tenga en cuenta que los dos cromosomas y dos plásmidos se muestran en longitud completa y, por lo tanto, tienen diferentes escalas en el eje x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62843/62843fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">King's B medio / agar</td>
		</tr>
<tr>
<td>Peptona (soja)</td>
			<td>20 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>K2HPO4
</td>
			<td>1,5 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td>1,5 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Agar-agar</td>
			<td>15 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Disuelto en agua destilada</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">LB medio/agar</td>
		</tr>
<tr>
<td>Triptona</td>
			<td>10 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Extracto de levadura</td>
			<td>5 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>10 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Disuelto en agua destilada</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Componentes de medios.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>No.</td>
			<td>Imprimaciones</td>
			<td colspan="2">Secuencia</td>
			<td>Temperatura de recocido por PCR (°C)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>tpnRL17–1RC</td>
			<td colspan="2">5'-CGTTACATCCCTGGCTTGTT-3'</td>
			<td rowspan="2">58.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>tpnRL13–2RC</td>
			<td colspan="2">5'-TCGTGAAGAAGGTGTTGCTG-3'</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Imprimaciones para confirmar el éxito de la conjugación.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Componente</td>
			<td>Volumen (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Agua purificada por HPLC</td>
			<td>4.92</td>
		</tr>
<tr>
<td>10x Buffer S (alta especificidad)</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2 (25 mM)</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTP (2 mM)</td>
			<td>1.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Imprimación 1 (10 pmol/μL)</td>
			<td>0.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Imprimación 2 (10 pmol/μL)</td>
			<td>0.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Taq (5 U/μL)</td>
			<td>0.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>Total de Mastermix</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Plantilla</td>
			<td>1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 3: Mezcla maestra de PCR para confirmar el éxito de la conjugación. Abreviaturas: HPLC = cromatografía líquida de alto rendimiento; dNTPs = trifosfato de desoxinucleósido.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Pasos</td>
			<td>Temperatura °C</td>
			<td>Hora</td>
			<td>Ciclos</td>
		</tr>
<tr>
<td>Desnaturalización inicial</td>
			<td>95</td>
			<td>3 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Desnaturalización</td>
			<td>95</td>
			<td>40 s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Recocido</td>
			<td>58.2</td>
			<td>40 s</td>
			<td>De 30 a 35</td>
		</tr>
<tr>
<td>Extensión</td>
			<td>72</td>
			<td>1-2 min</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Extensión final</td>
			<td>72</td>
			<td>4 minutos</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sostener</td>
			<td>4</td>
			<td colspan="2">∞</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 4: Condiciones de PCR para confirmar el éxito de la conjugación.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Imprimaciones</td>
			<td colspan="2">Secuencia</td>
			<td>Tm °C</td>
			<td>Uso</td>
			<td>Fuente</td>
		</tr>
<tr>
<td>Imprimación biotinilada específica del transposón</td>
			<td colspan="2">5'-Biotina-ACAGGAACACTTAACGGCTGACATG -3'</td>
			<td>63.5</td>
			<td>6.7.1. PCR I</td>
			<td>Costumbre</td>
		</tr>
<tr>
<td>Imprimación PCR universal modificada</td>
			<td colspan="2">5'- AATGATACGGCGACCACCGAGATC TACACTCTTTCCCTACACGACGCTC TTCCGATCTGAATTCATCGATGAT GGTTGAGATGTGT – 3'</td>
			<td>62</td>
			<td>6.10.1. PCR II</td>
			<td>Costumbre</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cartilla de índice</td>
			<td colspan="3">Consulte el manual del fabricante</td>
			<td>6.7.1. PCR I y 6.10.1. PCR II</td>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos para Illumina (Conjunto de cebadores de índice 1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Adaptador</td>
			<td colspan="3">Consulte el manual del fabricante</td>
			<td>6.5. Ligadura del adaptador</td>
			<td>Kit de preparación de la biblioteca de ADN NEBNext Ultra II para Illumina</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 5: Cebadores y adaptador para PCR I y II durante la preparación de la biblioteca de ADN. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Mezcla de PCR</td>
			<td>(μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fragmentos de ADN ligados por adaptador</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mezcla maestra NEBNext Ultra II Q5</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Imprimación índice (10 pmol/μL)</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Imprimación biotinilada específica de transposones (10 pmol/ μL)</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volumen total</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 6: Preparación de la biblioteca de ADN-MEZCLA MAESTRA DE PCR I.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Pasos</td>
			<td>Temperatura</td>
			<td>Hora</td>
			<td>Ciclos</td>
		</tr>
<tr>
<td>Desnaturalización inicial</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>30 s</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Desnaturalización</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>10 s</td>
			<td rowspan="3">De 6 a 12</td>
		</tr>
<tr>
<td>Recocido</td>
			<td>65 °C</td>
			<td>30 s</td>
		</tr>
<tr>
<td>Extensión</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>30 s</td>
		</tr>
<tr>
<td>Extensión final</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>2 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sostener</td>
			<td>16 °C</td>
			<td colspan="2">∞</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 7: Preparación de la biblioteca de ADN-condiciones de PCR I y II.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Mezcla de PCR</td>
			<td>(μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>ADN seleccionado por perlas</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mezcla maestra NEBNext Ultra II Q5</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cartilla de índice</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Imprimación PCR universal modificada</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volumen total</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 8: Preparación de la biblioteca de ADN-Mezcla maestra de PCR II.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Bibliotecas</td>
			<td>Invivo-1</td>
			<td>Invivo-2</td>
			<td>Invivo-3</td>
			<td>Invitro-1</td>
			<td>Invitro-2</td>
			<td>Invitro-3</td>
			<td>Biblioteca original</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">No. de lecturas (PE)</td>
			<td>56,57,710</td>
			<td>39,19,051</td>
			<td>30,65,849</td>
			<td>35,73,494</td>
			<td>28,83,440</td>
			<td>36,61,956</td>
			<td>46,09,410</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">No. de lecturas que contienen Tn – borde en el extremo 5' de Read-1</td>
			<td>54,15,880</td>
			<td>37,31,169</td>
			<td>29,36,247</td>
			<td>33,00,499</td>
			<td>27,35,705</td>
			<td>33,50,402</td>
			<td>41,53,270</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tasa de alineación general de Bowtie2 (%) (solo Lectura-1)</td>
			<td>95.53%</td>
			<td>83.71%</td>
			<td>89.87%</td>
			<td>80.79%</td>
			<td>78.00%</td>
			<td>73.06%</td>
			<td>74.92%</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Número de inserciones únicas</td>
			<td>8,539</td>
			<td>4,134</td>
			<td>7,183</td>
			<td>18,930</td>
			<td>18,421</td>
			<td>20,438</td>
			<td>24,224</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Número de genes afectados</td>
			<td>1575</td>
			<td>993</td>
			<td>1450</td>
			<td>2793</td>
			<td>2597</td>
			<td>3037</td>
			<td>3736</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 9: Resumen de la salida de secuenciación y la frecuencia de inserción de transposones por biblioteca. Abreviatura: PE = pareado- final.

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Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles

Este es un método adaptado para identificar factores candidatos de colonización de insectos en un simbionte beneficioso de Burkholderia. El huésped escarabajo está infectado con una biblioteca mutante aleatoria generada a través de la mutagénesis del transposón, y la complejidad de la biblioteca después de la colonización se compara con un control cultivado in vitro.

Secuenciación de transposon-inserción como herramienta para dilucidar factores de colonización bacteriana en un simbionte de gladiolos de Burkholderia de escarabajos lagria villosa

Inferring the function of genes by manipulating their activity is an essential tool for understanding the genetic underpinnings of most biological ...

Este protocolo es útil para realizar la manipulación genética de bacterias simbióticas, en este caso, específicamente en Burkholderia, e identificar los genes esenciales para colonizar un insecto huésped. La secuenciación de inserción de transposones es una herramienta poderosa para identificar un gran número de genes condicionalmente esenciales simultáneamente en un solo experimento. Comience inoculando un cultivo de donante fresco de E. coli en 10 mililitros de medio LB suplementado con kanamicina y DAP bajo una capucha estéril.Inocular células receptoras de la cepa A de gladiolos de Burkholderia en cinco mililitros de kb medio. Incubar los cultivos a 30 grados centígrados durante la noche en una coctelera a 250 RPM. Después del crecimiento durante la noche, centrífuga cuatro mililitros de cada uno de los cultivos a 9, 600 veces G durante seis minutos para peletizar las células y desechar el sobrenadante.Bajo una capucha estéril, lave los cultivos celulares granulados en un medio KB que contenga DAP. Y finalmente, resuspend los cultivos por separado en cuatro mililitros de KB más medio DAP. En un tubo fresco de 15 mililitros, mezcle 250 microlitros de las células donantes de E. coli lavadas con un mililitro de las células receptoras de burkholderia gladioli cepa A lavadas.Detecte 10 microlitros de esta mezcla de células de conjugación en placas de agar KB que contienen DAP. Deje que la placa descanse sin ser molestada en la campana estéril a temperatura ambiente durante una hora. Incubar las placas con los puntos de conjugación a 30 grados centígrados durante 12 a 18 horas.Después de la incubación, agregue de dos a cuatro mililitros de 1X PBS en las placas debajo de una capucha estéril y use un raspador celular para liberar las manchas de conjugación bacterianas cultivadas del agar. Luego pipetee la mezcla de células conjugadas en dos tubos de microfugios de mililitros. Pellet las células centrifugando a 9, 600 veces G durante dos minutos.Deseche el sobrenadante y lave el pellet dos veces en un mililitro de 1X PBS canalizando hacia arriba y hacia abajo. Resuspend el pellet final en 1, 200 microlitros de 1X PBS. Mezcle bien y extienda 100 microlitros de la mezcla celular en placas grandes de agar KB suplementadas con kanamicina e incube a 30 grados centígrados durante la noche.Contar el número total de colonias transconjugantes en las tres placas y extrapolar para calcular el número aproximado de mutantes obtenidos en todas las placas. Para aumentar las posibilidades de obtener una biblioteca representativa, asegúrese de que el número total de colonias sea varias veces mayor que el número total de genes en el genoma. Para confirmar el éxito de la conjugación, realice una PCR dirigida al casete de inserción utilizando de 10 a 20 colonias de muestra como se describe en el manuscrito.Bajo una capucha estéril, raspe las colonias de las placas agregando de uno a dos mililitros de 1X PBS en el agar. Agrupa la mezcla celular raspada de las placas en tubos de 50 mililitros. Vórtice la biblioteca para mezclar a fondo, y luego divida un mililitro de la biblioteca mutante agrupada en varios tubos crioedores.Agregue un mililitro de glicerol al 70% a los tubos y guárdelo a menos 80 grados centígrados. Seleccione una nidada de huevos L.villosa y cuente el número de huevos que continúan si la nidada contiene más de 100 huevos. Para esterilizar toda la nidada de huevos, agregue 200 microlitros de etanol al 70% y lave suavemente los huevos durante cinco minutos, luego retire el etanol y lave los huevos dos veces con agua en autoclave.Añadir 200 microlitros de lejía al 12% y lavar suavemente los huevos durante 30 segundos. Retire la lejía inmediatamente y lave los huevos de nuevo tres veces con 200 microlitros de agua en autoclave. Infecte los huevos en la nidada de huevos esterilizados usando dos veces 10 a las seis células por microlitro de la biblioteca de mutantes lavados en PBS.Dos días después de que eclosionen las larvas de escarabajo infectado, recolecte larvas de instar de 100 segundos por tubo de microfugio de 1.5 mililitros y guárdelo a menos 80 grados centígrados. Para generar la biblioteca de control in vitro, inocular 250 microlitros de dos veces 10 a las seis células por microlitro de la biblioteca mutante en 10 mililitros de medio KB que contenga kanamicina. Después de extraer el ADN de las bibliotecas mutantes cultivadas in vivo e in vitro, comparta el ADN con un ultrasonido.Para verificar si el ADN se cortó al rango de tamaño deseado, cargue cinco microlitros del ADN sin escuchar y esquilar después de mezclarlo con el tinte de carga de gel en una proporción de uno a uno en un gel de agarosa al 1.6% a 250 voltios durante 40 minutos. Para preparar los extremos del fragmento necesarios para la ligadura del adaptador, comience agregando tres microlitros de la mezcla de enzimas y siete microlitros de tampón de reacción a 50 microlitros del ADN cortado y mezcle bien mediante pipeteo. Ajuste un termociclador con una tapa calentada a más o igual a 75 grados centígrados e incube las muestras durante 30 minutos a 20 grados centígrados y 30 minutos a 65 grados centígrados, luego mantenga la temperatura a cuatro grados centígrados.Para la ligadura del adaptador, agregue 30 microlitros de mezcla maestra de ligadura, un microlitro de potenciador de ligadura y 2.5 microlitros de adaptador diluido a los productos de la etapa de preparación final. Mezclar bien mediante pipeteo e incubar la muestra durante 15 minutos a 20 grados centígrados en el termociclador con la tapa calentada apagada. Después de 15 minutos, agregue tres microlitros de la enzima.Mezclar bien mediante pipeteo e incubar la muestra durante 15 minutos a 37 grados centígrados en un termociclador con la tapa calentada a más o igual a 47 grados centígrados. Para seleccionar el tamaño del ADN ligado del adaptador dirigido a fragmentos de 250 pares de bases, comience por vórtice la solución de perla magnética y colóquela a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de su uso. Agregue 0.3 veces de cuentas a 96.5 microlitros de la mezcla de ADN ligado y mezcle pipeteando a fondo.Incubar la mezcla de cuentas durante cinco minutos. Coloque los tubos en un soporte magnético para tirar de las cuentas y eliminar fragmentos de ADN de tamaño no deseado. Deje que las perlas se asienten durante cinco minutos y luego transfiera el sobrenadante transparente a un nuevo tubo de microfuge.Agregue 0.15 veces de cuentas frescas al sobrenadante y mezcle pipeteando bien. Incubar la mezcla de perlas durante cinco minutos y luego colocar los tubos en un soporte magnético para tirar de las perlas unidas al ADN objetivo. Espere cinco minutos y luego deseche el sobrenadante, manteniendo las cuentas.Con las perlas en el soporte magnético, agregue 200 microlitros de etanol 80% recién preparado y espere 30 segundos antes de desechar el etanol sin molestar las perlas. Retire los tubos del soporte y agregue 17 microlitros de 0.1X TE o Low TE, luego mezcle 10 veces mediante pipeteo e incube la mezcla a temperatura ambiente durante dos minutos. Coloque el tubo en el soporte magnético y tome 15 microlitros del ADN seleccionado para PCR-1.Perlas de estreptavidina vórtice y colóquelas a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos. Tome 32 microlitros de las cuentas y lávelas con 500 microlitros de 1X bind y wash buffer. Agregue 32 microlitros de 2X bind y lave el tampón y resuspenda las perlas.A esto, agregue 32 microlitros de los productos PCR-1 limpios. Mezclar bien e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Coloque la mezcla de ADN de perlas en un soporte magnético durante dos minutos.Pipetee el sobrenadante ya que el ADN marcado con biotina que contiene el borde de inserción se une a la estreptavidina en las perlas. Lave las cuentas con 500 microlitros de 1X bind y wash buffer, y luego lave las cuentas con 200 microlitros de Low TE. Resuspend las perlas unidas al ADN en 17 microlitros de TE Baja. El ADN de las bibliotecas mutantes cultivadas in vivo e in vitro extraídas y fragmentadas en un ultrasonido mostró que la mayoría de los fragmentos abarcan entre 100 y 400 pares de bases. La ubicación de las inserciones mediadas por transposones a través de los cuatro replicones del genoma de la cepa A de Burkholderia gladioli se puede observar en la vaina.En la tabla se puede observar un resumen de la salida de secuenciación y el número de inserciones únicas y genes alcanzados en las tres bibliotecas replicadas in vivo e in vitro. Lo importante a recordar es calcular el tamaño del cuello de botella de la población durante la colonización del huésped para obtener una representación adecuada de la biblioteca durante la infección. Además, ajuste para un número compatible de generaciones bacterianas in vitro y en el huésped.Después de generar la biblioteca de mutantes de transposones, se puede filtrar en medios selectivos para recuperar mutantes en función de las diferencias fenotípicas. Por lo tanto, se pueden identificar genes específicos importantes para una afección.

Research

JoVE Journal

Biology

Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles

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Investigación

Biología

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